基于液相色谱信息的西青果化学成分抑制<i>α</i>-葡萄糖苷酶活性数学模型的构建


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基于液相色谱信息的西青果化学成分抑制α-葡萄糖苷酶活性数学模型的构建

王定颖¹, 朱靖博^1,2 , 丁燕^1,2, 寇自农^2,3, 杨兰苹¹

1. 大连工业大学食品学院, 辽宁大连 116034;
2. 大连工业大学植物资源化学与应用研究所, 辽宁大连 116034;
3. 大连工业大学实验仪器中心, 辽宁大连 116034

收稿日期：2014-1-13

基金项目：辽宁省高等学校重大科技平台项目（辽教发[2011]191号）.

通讯作者：朱靖博,Tel:(0411)86332109,E-mail:zhujingb@sina.com.

摘要：中药提取物是一个组成复杂、机理不明晰的混合物体系，其对靶标的作用是其中所有化合物的综合影响，如何表征和评价其生物活性值得深入研究。本文采用羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱分离西青果乙醇提取物，得到29组成分连续变化的样品，采集样品的色谱信息（254 nm波长下）与活性信息，运用逐步回归法建立成分的峰面积（V_i，自变量）与活性（以对酶的抑制率（W）表示，因变量）之间的数学方程，确定对活性影响显著的成分。结果表明，29组样品包含55个峰，这些峰对应成分的峰面积（V_i，i=1，2，…，55）与W之间存在数学关系：W=V₇×（-0.034±0.013）+V₁₈×（-0.155±0.051）+V₂₉×（-0.142±0.028）+V₄×（0.079±0.020）+V₁₁×（0.074±0.028）+V₃₆×（-0.117±0.053）+85.669±4.476，复相关系数R=0.854，显著度=0.037，稳健性良好，对活性影响最显著的物质为第18、29、36、4、11和7号峰对应的化合物。该方法同样适用于不同中药资源的成分与多种不同活性等方面的研究，对于中药的研发具有重要意义。

关键词：高效液相色谱逐步回归分析多元线性回归方程数学模型 α-葡萄糖苷酶活性抑制西青果

Establishment of the mathematical model for the inhibition on α-glycosidase by chemical compositions from Terminalia chebula Retz. based on the liquid chromatographic information

WANG Dingying¹, ZHU Jingbo^1,2 , DING Yan^1,2, KOU Zinong^2,3, YANG Lanping¹

1. School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China;
2. Institute of Chemistry and Applications of Plant Resources, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China;
3. Instrumental Analysis Center, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China

Received: 2014-1-13

Abstract: The extracts from Chinese herbs are complex compounds with uncertain mechanism, which affects the target with all ingredients. Therefore, it is of great importance to evaluate the bioactivity of these extracts. In this study, 29 samples which had continuous variation of constituents were obtained from the alcohol extract of Terminalia chebula Retz. by a Sephadex LH-20 size exclusion chromatographic column. After detecting the chromatographic information of detection wavelength at 254 nm and the activity information of these samples, the mathematical relationship equation was established to determine the impact on the active components. Stepwise regression method was used to research the relationship between the peak areas (V_i, independent variables) of the compositions in the samples and activities (according to the enzyme inhibition (W), dependent variables). The results showed that there were 55 chromatographic peaks in the samples and the mathematical relationship between the compositions of Terminalia chebula Retz. extract (V_i, i=1, 2,…, 55) and activities was certain. The expression was: W=V₇×(-0.034±0.013)+V₁₈×(-0.155±0.051)+V₂₉×(-0.142±0.028)+V₄×(0.079±0.020)+V₁₁×(0.074±0.028)+V₃₆×(-0.117±0.053)+85.669±4.476, multiple correlation coefficient R=0.854, significance level (Sig. F change)=0.037. The steadiness of model was favorable with new digital information. The compounds corresponding to 18^th, 29^th, 36^th, 4^th, 11^th and 7^th peaks were the main active compounds. The method can be also applied to the relationship between a wide variety of components of traditional Chinese medicine resources and different kinds of activities. It is significant to the research and development of traditional Chinese medicine.

Key words: high performance liquid chromatography (HPLC) stepwise regression multiple linear regression equation mathematical model α-glycosidase activity inhibition Terminalia chebula Retz

单味及复方中药、植物源功能性食品的活性评价方法是公认的难点,其主要原因是物质体系组成和作用机理的复杂性。在现有的科学技术水平下,研究者们普遍采用针对混合物中已知或主要化合物进行定量分析或针对全成分指纹图谱阐明其化学组成色谱信息的方法进行分析^{[ 1 ]}。但由于化合物成分对靶点同时存在协同、拮抗等复杂作用,这一方法对于植物源功能性食品、单味及复方中药等复杂体系活性评价的局限性是不言而喻的^{[ 2,3 ]}。各种类别的色谱分析在获得复杂体系化合物组成及含量方面信息具有明显的优势,如运用分子生物色谱筛选中药活性成分及其质量控制,采用高效液相色谱法检测药材中某主要化合物或某杂质的含量,结合质谱分析确定药材中某主要化合物或某杂质的化学结构等^{[ 4,5,6,7 ]},因此在获得提取物活性数据的基础上,结合色谱信息构建数学模型来评价这些复杂体系的活性,可能是解决这一问题的有效方法。

复杂体系的色谱信息包含成分组成、比例、含量等多方面,其对活性的影响可随色谱信息的变化而变化,且这一变化不呈简单的线性加合作用。回归分析常被用作处理一系列变化的因素对某单方面探测目标的影响效应,包括变化因素之间的幂响应、相互作用效应、多重共线性与超饱和模型等^{[ 8,9 ]}。逐步回归法(stepwise regression,SR)是回归分析中的一种模式,采用在基本自变量回归的基础上逐一筛选其余自变量,并通过对已剔除的自变量进行多轮筛选过程,改变显著自变量项选入和剔除的标准,获得包含主要效应分量的优化回归方程。由于每步都做检验,因而保证了最后所建立的回归方程中所有自变量都是显著的^{[ 8,10 ]}。SR已广泛应用于农学、经济学、社会学、地质学等行业^{[ 11,12,13,14,15,16 ]},在中药活性研究中仅见于筛选血竭中活性成分和药物质量控制中有所运用^{[ 17,18 ]}。

α -葡萄糖苷酶抑制剂可以良好地抑制餐后血糖升高,已成为降低餐后血糖的一线药物^{[ 19,20 ]}。目前人们已发现大量植物提取物或有效部位可明显抑制 α -葡萄糖苷酶,并对其有效成分进行分离富集研究^{[ 21,22,23,24,25,26 ]}。已有的研究证明,西青果提取物具有较强的抑制 α -葡萄糖苷酶作用,较现有的治疗糖尿病临床药物阿卡波糖(acarbose)具有明显的优势^{[ 27,28,29 ]}。因此,本论文建立了基于复杂体系色谱分析信息、生物活性信息的数学模型来表征与评价天然产物抑制 α -葡萄糖苷酶活性的方法,对于开展植物源功能食品、中药研发具有重要的科学意义。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

P230-Ⅱ型高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司); DZF-6050真空干燥箱、R502B旋转蒸发器(巩义市予华仪器有限公司); SK-1快速混匀器(常州国华仪器有限公司); MDFF2LASO.25反渗透纯水机(大连美德环保设备公司); BS2245电子天平(北京赛多利斯仪器公司); BT100-1J蠕动泵驱动器(保定兰格恒流泵公司); 1.5 mL PE离心管(美国Axygen公司); Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μ m;迪马科技公司); Galaksil EF-C18M 120A色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μ m;加莱克色谱科技公司);超声波清洗机、恒温水浴锅等实验室常用设备。

对-硝基苯基- α -D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl- α -D-glucopyranoside，PNPG,纯度99% )、 α -葡萄糖苷酶(来自酿酒酵母,规格为7.14 U/mg)、牛血清白蛋白(BSA,纯度≥95% )均购于Sigma公司;阿卡波糖片(acarbose，50 mg/片，批号H19990205;拜耳医药保健有限公司)。

甲酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸钠、磷酸购自天津市科密欧化学试剂有限公司，对-硝基苯酚(PNP)购自国药集团化学试剂有限公司，以上试剂均为分析纯。工业级甲醇、乙醇、丙酮、正己烷(均重蒸后使用),购自天津市大茂化学试剂厂;乙腈、甲醇均为色谱纯,购自美国Tedia公司;超纯水为实验室仪器自制。

西青果原药材:生产批号090301,购自河北聚仁堂饮片有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱:Galaksil EF-C18M 120A;流动相A:乙腈;流动相B: 0.02 mol/L 磷酸二氢钾溶液(磷酸调节pH=2)。梯度洗脱程序:0～40 min,10%A～18%A; 40～55 min,18%A; 55～60 min,18%A～70%A; 60～70 min,70%A; 70～73 min,70%A～10%A; 73～80 min,10%A。流速:1.0 mL/min;进样量:10 μ L;柱温:常温;检测波长:254 nm。检测过程每组样品平行测定3次。仪器检出限:峰高＞6.0 mV,峰面积＞50.0 mV·s。

1.2.2 组分样品的制备

取212 g西青果原药材经乙醇加热回流提取得到TCR-crude。取TCR-crude 60.0 g经HPD-100大孔树脂除去蛋白质、氨基酸、无机盐以及部分极性极小的物质,得到富集后的产物TCR-pur,编号S₁。取TCR-pur 9.5 g进行Sephadex LH-20色谱分离,得到28份组成既有联系又有区别的混合物样品组,编号S₂～S₂₉。分别浓缩、干燥、称重,并将其配制为1.00 g/L 的甲醇溶液,密封保存作为后续HPLC成分检测与PNPG活性检测的样品。制备流程如图1所示。

图1 组分样品制备过程 Fig.1 Preparation process of the samples

1.2.3 α -葡萄糖苷酶抑制活性的检测

酶液配制:取14 U/mg规格的 α -葡萄糖苷酶7.14 mg,用含0.20%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液(pH 6.8,浓度0.067 mol/L)溶解后定容于100 mL容量瓶中,冰箱冻存,使用前经解冻并稀释10倍后即得0.1 U/mL的 α -葡萄糖苷酶液。

采用HPLC-PNPG法^{[ 30,31 ]}检测,反应在1.5 mL的PE管中完成。具体操作方法:加入0.067 mol/L pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液50 μ L、0.1 U/mL α -葡萄糖苷酶60 μ L、待测样品的甲醇溶液5 μ L,振荡混匀,于37 ℃水浴中恒温孵育20 min;再加入40 μ L 4.0 mmol/L PNPG,振荡混匀,于37 ℃水浴中恒温孵育反应30 min;最后加入0.2 mol/L Na₂CO₃溶液160 μ L终止反应,加超纯水稀释定容至 1500 μ L,混匀机中混匀,经0.45 μ m滤膜过滤,待HPLC检测。实验设样品组、空白对照组(blank control,以等量磷酸盐缓冲溶液代替酶液)、阴性对照组(negative control,以等量纯甲醇代替样品溶液)和阳性对照组(positive control,以等量同浓度阿卡波糖溶液代替样品溶液)。HPLC检测条件:Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μ m);流动相:乙腈-0.1%甲酸水溶液(45 ∶ 55,v/v);等度洗脱8 min;流速:1.0 mL/min;进样量:10 μ L;柱温:常温;UV检测波长:315 nm。检测限:峰高＞0.0 mV,峰面积＞0.0 mV·s。

活性大小采用相同浓度的样品对酶的抑制率(W)来表示,使用PNP峰面积-浓度标准曲线法计算浓度。标准曲线的绘制:准确称取PNP标准品 0.0347 g,用重蒸纯水超声辅助溶解,定容于25 mL容量瓶中,配制成10 mmol/L 的PNP母液,再将其稀释成0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.01、0.005、0.0025 mmol/L 系列浓度的PNP标准液,过0.45 μ m水系滤膜,经高效液相色谱检测,检测条件同PNPG法活性检测中的HPLC条件。以PNP峰面积为横坐标,PNP浓度为纵坐标,绘制标准曲线。抑制率W计算公式:W= A-B A ×100%,式中:A为阴性对照中PNP的浓度(扣除相应空白); B为样品组(包括阳性对照)中PNP的浓度(扣除相应空白)。

1.2.4 数学模型的构建

以样品对 α -葡萄糖苷酶的抑制率W为因变量、样品HPLC谱图中各组分的峰面积3次测定的平均值(V_i)为自变量进行多元线性回归。在这个模型中,样品个数N=29,样品维度(所有样品峰的总数)P=55,属于典型的超饱和模型(P＞N),且单个样品中的不同成分之间会对活性产生难以预估的相互作用,或者某个成分的单独作用可以相抵其他若干组分的共同作用,即待考察的项数之间存在多重共线性,故选用逐步回归法进行统计学分析。具体操作中使用统计软件SPSS13.0中的“Regression Analysis/Linearity/Stepwise”程序进行数据处理,选取F分布概率区间为进入F( α =0.05),移出F( α =0.10)。

2 结果与讨论

2.1 HPLC条件的确定

为了获取充分的色谱信息,本文考察了Diamonsil C18、UniPS 5-100、Hypersil BDS C18、SinoChrom ODS-BP等色谱柱对样品的分离效果,确定了Galaksil EF-C18M(250 mm×4.6 mm,5 μ m,填料孔径12 nm)作为分析色谱柱,选择乙腈与0.02 mol/L 磷酸二氢钾溶液(磷酸调节pH=2)作为流动相,梯度洗脱,在此条件下西青果提取物达到了较好的分离(见图2)。

图2 西青果乙醇提取物的HPLC谱图 Fig.2 HPLC chromatogram of Terminalia chebula Retz. extract with ethanol

2.2 组分样品的制备及其HPLC检测

TCR-crude经HPD-100大孔树脂富集处理后得到黄褐色细干粉状TCR-pur 40.3 g,经Sephadex LH-20凝胶色谱柱分离得到29个成分连续变化、组成既有联系又有区别的混合物样品组。对各组样品采用HPLC检测各样品的化学组成,结果见图3。

图3 29组样品的HPLC谱图 Fig.3 HPLC chromatograms of the 29 samples

每组样品平行测定3次,根据出峰时间对不同组分的各个峰进行排列,将保留时间相同或相近、峰形相似的峰进行识别和匹配,记录峰面积数值并计算其平均值与相对标准偏差(RSD)(具体数据略)。

2.3 样品抑制 α -葡萄糖苷酶活性的检测

对上述样品进行PNPG法活性检测,所得结果的标准曲线方程为y=0.0002x+0.0023,r=0.9992,根据方程计算各组分的PNP浓度及其相应的对酶抑制率,对各样品活性检测数据取3次测定的平均值,所得结果见表1。

表1 PNPG法测定的29组样品的 α -葡萄糖苷酶抑制率(n=3) Table 1 Inhibition of α -glycosidase enzyme for the 29 samples by PNPG method (n=3)

2.4 样品成分与活性对应的数学关系模型的构建

由SPSS13.0软件中的“Regression Analysis/Linearity/Stepwise”程序处理得出如下结果:模型拟合概况及方差分析见表2,其中的复相关系数R表明自变量与因变量之间的相关程度,复决定系数R²反映V引起W的变异性。当自变量V₇、V₁₈、V₂₉、V₄、V₁₁、V₃₆都进入方程时,R=0.854,表明自变量与因变量有良好的相关性。R²=0.729表明上述6个自变量可以解释因变量72.9%的变异性。检验回归方程6种模式的F统计量分别为6.962、7.112、4.296、7.641、5.053、4.909,均大于对应的F_0.1(1,54)=2.81,F_0.1(2,53)=2.41,F_0.1(3,52)=2.20,F_0.1(4,51)=2.06,F_0.1(5,50)=1.97,F_0.1(6,49)=1.90。6步回归的显著F变化值(Sig. F change)依次为0.014、0.013、0.049、0.011、0.034、0.037,均小于0.05,差异显著,所以回归方程具有统计学意义。模型6的方程更显著,更有统计学意义,为最优回归方程。

表2 模型拟合概况及方差分析 Table 2 Model summary and analysis of variance

在回归系数分析表(表3)中,回归系数(B)的绝对值反映了组分对酶的抑制率程度,绝对值越大,表现出对抑制酶活能力的影响越大,影响包括促进与阻碍两种作用。表3中列出了回归模型的自变量系数与常数项及个体的t检验。由第6步回归分析的t检验可以知道,对V₇、V₁₈、V₂₉、V₄、V₁₁、V₃₆检验的Sig. F change值依次为0.018、0.006、0.000、0.001、0.016、0.037,均小于0.05,差异显著,表明回归方程在个体上有意义。且由Model 1、Model 2可看出,V₁₈引入后使V₇的回归系数绝对值减小,说明前者可部分抵消后者的作用。同理,V₂₉可部分抵消V₇、V₁₈的作用,三者的回归系数均为负值,表明该成分对酶的活性有显著的促进作用;V₄、V₁₁的回归系数为正,表明该成分对酶的活性有显著的抑制作用,且V₁₁的引入使V₄的回归系数变大,即V₁₁可以增强V₄的抑制作用;V₃₆的回归系数为负,且V₃₆的引入使V₇、V₄的回归系数的绝对值变小,V₁₈、V₂₉、V₁₁的回归系数绝对值变大,表明V₃₆本身对酶活性有显著的抑制作用,且其可抑制V₇、V₄的作用,促进V₁₈、V₂₉、V₁₁的作用。

表3 6个数学模型的回归系数分析 Table 3 Analysis of the coefficients of the six models

逐步回归方程:

Model 1:W=V₇×(-0.035±0.013)+77.336±5.921;

Model 2:W=V₇×(-0.032±0.012)+V₁₈×(-0.175±0.066)+80.439±5.472;

Model 3:W=V₇×(-0.031±0.011)+V₁₈×(-0.155±0.051)+V₂₉×(-0.043±0.021)+84.582±5.529;

Model 4:W=V₇×(-0.048±0.012)+V₁₈×(-0.117±0.058)+V₂₉×(-0.095±0.026)+V₄×(0.057±0.021)+84.018±4.918;

Model 5:W=V₇×(-0.052±0.011)+V₁₈×(-0.126±0.054)+V₂₉×(-0.135±0.030)+V₄×(0.081±0.022)+V₁₁×(0.069±0.031)+82.553±4.596;

Model 6:W=V₇×(-0.034±0.013)+V₁₈×(-0.155±0.051)+V₂₉×(-0.142±0.028)+V₄×(0.079±0.020)+V₁₁×(0.074±0.028)+V₃₆×(-0.117±0.053)+85.669±4.476。

综上,对酶活性影响显著的物质依次为第18、29、36、4、11、7号峰对应的化合物。

2.5 模型的稳健性与普适性分析

在29组样品中随机抽取15组进行任意混配,制得5组新样品并配制为1.00 g/L 的甲醇溶液,编号S_1N、S₂_N、S₃_N、S₄_N、S_5N,采用上述方法重复HPLC成分检测与PNPG活性检测。5组样品的HPLC检测化学组成结果见图4(相应的色谱信息具体数据略)。从HPLC成分检测可知此5组样品构成的新测试集包含数学模型6中所述对活性影响显著的全部化合物,故可采用此组数据验证模型的稳健性。

图4 模型稳健性考察样品的HPLC谱图 Fig.4 HPLC chromatograms of the samples for the steadiness of the model

根据模型方程式可预测该5组样品对 α -葡萄糖苷酶抑制率分别为88.48% 、99.76% 、78.49% 、26.94% 、93.88% ,按其大小顺次样品排列为S_2N＞S_5N ＞S_1N＞S_3N＞S_4N。采用PNPG法实际测得样品的抑制率分别为93.36% 、99.98% 、76.65% 、31.15% 、97.03% ,按大小顺次样品排列为S_2N＞S_5N ＞S_1N＞S_3N＞S_4N。该数值变化规律与计算所得数据吻合,存在正常范围内的随机误差,说明模型的稳健性良好。

中药组分是天然的混合复杂化合物体系,不同中药组分的复杂程度不同,西青果组成成分与药理活性已被多位学者深入研究。本论文通过构建西青果提取物中多个化学成分与抑制 α -葡萄糖苷酶活性之间对应关系的数学模型,建立了一种基于复杂体系色谱分析信息、生物活性信息的数学模型来表征与评价天然产物某方面活性的方法。相信这一研究思路同样适用于单一植物的多种成分与其他方面活性、不同中药资源的成分与多种不同活性等方面的研究,这对于开展植物源功能食品、中药研发具有重要的科学意义。

3 结论

本研究借助SPSS13.0软件,探索了结合色谱学与统计学表征复杂体系中成分与活性对应数学关系的可行性。研究中构造了一系列组成既有区别又有联系的连续变化样品组,测定其成分信息与活性信息,采用多元线性回归中的逐步回归法建立数学关系模型来表征多个化合物的混合复杂体系中各物质含量与活性大小的关系并证明了该关系模型的稳健性良好。结果表明这一探索是可行的。此关系模型可表征化合物混合体系中各物质含量变化引起的活性变化,对药物开发以及质量控制中的关键活性物质的确定具有一定的指导作用,为应用数学在色谱分析学领域的使用开拓了一个新的思路与方法,具有潜在的应用价值。由于本研究时间及条件所限,未能确定对活性影响较大物质(第18、29、36、4、11、7号峰对应化合物)的具体的化学结构,后续研究中可在此方面做进一步的探索。

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