色谱  2014, Vol. 32 Issue (12): 1400-1403   PDF (797 KB)    
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徐颖
臧颖
姜婷
郑兆娟
欧阳嘉
高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法同时测定生物转化样品中的海藻糖、葡萄糖和麦芽糖
徐颖, 臧颖, 姜婷, 郑兆娟, 欧阳嘉     
南京林业大学化学工程学院, 江苏 南京 210037
收稿日期：2014-7-23
基金项目：国家自然科学基金项目(31200443);江苏省杰出青年基金项目(BK2012038);新世纪优秀人才支持计划项目(NCET-11-0988);江苏高校优势学科建设工程项目.
通讯作者：欧阳嘉,E-mail:hgouyj@njfu.edu.cn.
摘要：建立了高效阴离子交换色谱-脉冲安培电化学检测法同时测定生物转化样品中海藻糖、葡萄糖和麦芽糖的分析方法。选用CarboPacTM10色谱柱(250 mm×2 mm)对分离条件进行优化,使用标准样品测定了线性范围和工作曲线,柱温为30 ℃,流速为0.30 mL/min,以氢氧化钠溶液和醋酸钠溶液为流动相进行梯度洗脱,脉冲安培法进行检测。研究结果表明,该方法可在15 min内实现海藻糖生物转化液中3种糖的快速定量分析。海藻糖、葡萄糖和麦芽糖峰面积与质量浓度的线性关系良好,检出限为0.010~0.100 mg/L。将此方法用于酶法制备海藻糖的检测,加标回收率为89.40%~103.2%。在生物转化样品中检测到海藻糖浓度为101.084 g/L,转化率达到了50.5%。该方法灵敏度高,简便快速,可应用于海藻糖制备样品中各种成分的分离和定量检测。
关键词： 高效阴离子交换色谱     海藻糖     葡萄糖     麦芽糖     生物转化样品    
Simultaneous analysis of trehalose, glucose and maltose in biotransformation samples by high performance anion exchange chromatography with pulsed ampere detection
XU Ying, ZANG Ying, JIANG Ting, ZHENG Zhaojuan, OUYANG Jia     
College of Chemical Engineering, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China
Received: 2014-7-23
Abstract: An analytical method for the determination of trehalose, maltose, and glucose in biotransformation samples was developed by using high performance anion exchange chromatography coupled with pulsed ampere detection (HPAEC-PAD). The analysis was performed on a CarboPacTM10 column (250 mm×2 mm) with the gradient elution of NaOH-NaAc as the mobile phase. The column temperature was set at 30 ℃, the flow rate was 0.30 mL/min. The results showed that trehalose, maltose, and glucose in biotransformation system were completely separated and determined in 15 min. The linear ranges and the working curves were determined by using standard samples. The correlation coefficients of three kinds of carbohydrates were over 0.9998 . The detection limits (LODs) were 0.010-0.100 mg/L. Under the optimized separation conditions, the recoveries of saccharides in the transformation system at three different spiked levels ranged from 89.4% to 103.2%. In biotransformation system, 50 IU trehalose synthase were added into 200 g/L maltose for reaction of 8 h at 37 ℃, pH 8.0. Under the above conditions, the concentration of trehalose in biotransformation sample was 101.084 g/L, and the conversion rate of trehalose reached 50.5%. The method can be applied to determine the composition in the transformation system with the advantages of simplicity and convenience.
Key words: high performance anion exchange chromatography (HPAEC)     trehalose     glucose     maltose     biotransformation sample    

海藻糖是由两个葡萄糖分子通过半缩醛羟基缩合而成的非还原性双糖,化学名为 α -D-吡喃葡萄糖基- α -D-吡喃葡萄糖苷。其分子式为C12H22O11\52H2O,相对分子质量为378.33,广泛应用于食品、化工和医药行业[1, 2]。利用海藻糖合酶以麦芽糖为原料生产海藻糖是一条极有工业化前景的重要途径。海藻糖合酶除了分子内转糖苷作用还有微弱的水解活性,除催化海藻糖和麦芽糖相互转化外还伴有副产物葡萄糖的生成[3]。同时测定海藻糖、葡萄糖和麦芽糖对于生物转化生成海藻糖有重要意义。

常用于海藻糖定量分析的方法有蒽酮比色法、3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法、纸层析法、薄层色谱法、气相色谱(GC)、高效液相色谱法(HPLC)等[4, 5, 6, 7, 8]。蒽酮比色法和DNS比色法干扰较多,定量准确度和重复性不理想[7]。纸层析法操作简单、费用低,但选择合适展开剂和显色剂比较难,且重现性差、误差较大。GC通过将海藻糖衍生也可以定量分析其含量,但样品衍生化操作较为繁琐[8]。而HPLC虽然可以实现糖的高效分离,但糖检测需要使用灵敏度较低的示差折光检测器(RID),且不能用于梯度洗脱,给一些糖的分离带来了困难。

高效阴离子交换色谱法(HPAEC)可在碱性流动相条件下用阴离子交换柱将糖分离[9],目前已运用于各种单糖、双糖和低聚糖的同时测定[10, 11, 12, 13, 14, 15],但是利用该方法实现海藻糖、葡萄糖和麦芽糖的同时测定尚未见报道。本文针对海藻糖合酶生物转化麦芽糖生成海藻糖反应体系的实际状况,建立了一种基于离子色谱直接同时测定生物转化过程中海藻糖、葡萄糖和麦芽糖的方法。该方法操作简单、灵敏度高,可用于海藻糖制备样品中各种成分的分离和定量检测。



1 实验部分
1.1 仪器

ICS-3000型离子色谱仪(Dionex,美国):配备ED3000电化学检测器,Au工作电极,pH-Ag/AgCl复合参比电极,Chromeleon 67色谱工作站,AS40自动进样器。超纯水设备(法国ELGA LabWater公司);离心机(美国Thermo Fisher公司); CarboPacTM10保护柱(50 mm×2 mm); CarboPacTM10分析柱(250 mm×2 mm)(美国Dionex公司)。

D-葡萄糖(纯度≥99.5% ),D-麦芽糖(纯度≥99% ),D-海藻糖(纯度≥99% ),无水醋酸钠(NaAc)购于美国Sigma公司,50%(w/v)氢氧化钠溶液购自美国Fluka公司。实验用水均采用电阻率不低于18.2 M Ω \5cm的超纯水。

1.2 溶液的制备
1.2.1 标准溶液

分别精密称取葡萄糖、麦芽糖和海藻糖标准样品各0.200 g,用超纯水溶解并定容于100 mL容量瓶中,配成质量浓度为2 g/L 的标准储备液,于-20 ℃下冷冻保存。使用前取出化冻,取等量同浓度级别的标准溶液混合后作为标准工作溶液。

1.2.2 淋洗液

200 mmol/L NaOH溶液:取50% NaOH溶液10.5 mL用水稀释至1 L并定容,混匀后立即通氮气(41.3～55.1 kPa)保护。

500 mmol/L NaAc溶液:称取20.5 g固体无水醋酸钠,用水溶解,经0.22 μ m醋酸纤维膜过滤后转至500 mL容量瓶中,加入5.25 mL 50%的NaOH溶液后用水定容,混匀后立即通氮气(41.3～55.1 kPa)保护。

1.2.3 样品溶液

在200 g/L 的麦芽糖中加入50 IU海藻糖合酶(来自于Pseudomonas stutzeri),在37 ℃、pH 8.0的条件下反应8 h,反应结束后取生物转化样品于100 ℃灭活10 min,10000 r/min 离心15 min。离心结束后,取上清液1 mL,经0.22 μ m滤膜过滤,稀释样品至检测浓度范围后进行检测和分析。

1.2.4 色谱条件

检测方式:四电位脉冲安培检测。以超纯水,200 mmol/L NaOH(A)和500 mmol/L NaAc(B)为淋洗液进行洗脱。0～7.00 min,采用75%超纯水和25%A相混合液淋洗; 7.01 min变为100%A相,然后A相线性减少,B相逐渐增加,至15.00 min时变为90%A相和10%B相混合液; 15.01～30 min恢复为75%超纯水和25%A相冲洗系统。进样量为10 μ L,流速为0.30 mL/min,柱温为30 ℃。

2 结果与讨论
2.1 色谱条件的选择
2.1.1 流动相NaOH浓度的优化

糖类化合物具有弱酸性及亲水性,在较强的碱性溶液中以阴离子形态存在。糖类化合物在阴离子交换分离柱上的保留时间主要取决于糖类化合物所带的电荷数、分子大小、组成和结构。NaOH中的阴离子OH-除了起到淋洗离子的作用之外,其强碱性质也使安培检测器对糖类有较高的灵敏度[9]。本实验中葡萄糖、麦芽糖和海藻糖标准样品的质量浓度均为10 mg/L,在柱温30 ℃,流速为0.30 mL/min 条件下,考察不同浓度的NaOH对标准样品分析的影响,结果如图1所示。低浓度的NaOH洗脱效果不佳,麦芽糖出峰时间过长,效率较低。提高NaOH浓度至200 mmol/L 后3种糖可以在10 min内得到完全分离,但麦芽糖的响应值较低。因 此,采用单一流动相无法实现葡萄糖、麦芽糖和海藻糖的高效分离。

图1 优化NaOH浓度的色谱图 Fig.1 Optimization of NaOH concentration Peak identifications: 1. trehalose; 2. glucose; 3. maltose.
2.1.2 洗脱液NaAc浓度的优化

为了进一步提高麦芽糖的洗脱效果,在不同时间段采用不同流动相进行梯度洗脱。有文献表明,洗脱与固定相亲和力强的糖(如寡糖、多糖、糖醛酸等)时需要在淋洗液中加入比较强的淋洗离子,无电化学活性的NaAc常被加入以实现较好的分离效果[9]。仍采用柱温30 ℃、流速0.30 mL/min 和初始NaOH浓度为50 mmol/L 的条件,在7.01 min以后将NaOH浓度提高至200 mmol/L 并加入一定浓度的NaAc以提高麦芽糖的响应值。加入不同浓度的NaAc(0、25、50、100、125 mmol/L)后,麦芽糖的保留时间、峰不对称性和柱效等参数见表1。随着NaAc浓度的增加,麦芽糖的响应值增大且保留时间逐渐减短。当NaAc为50 mmol/L 时麦芽糖的柱效最高,故选择添加50 mmol/L NaAc的流动相为最佳分离条件。

表1 NaAc浓度对于分离效果的影响 Table 1 Effects of NaAc concentration on the separation
2.1.3 流速的优化

固定1.2.4节其他条件不变,考察了不同流速(0.20、0.25、0.30、0.35 mL/min)对分离效果的影响。本实验中葡萄糖、麦芽糖和海藻糖标准样品的浓度均为10 mg/L。实验结果表明:流速越低,分离度越好,分析时间越长。综合考虑分离度、分析时间和柱压等因素,选择流速为0.30 mL/min。从图2可以看出,3种糖得到了较好的检测和分离。海藻糖、葡萄糖、麦芽糖对应的出峰时间分别为2.670、5.976、13.854 min。

图2 混合标准溶液的色谱图 Fig.2 Chromatogram of a mixed standard solution Anthocidaris crassispina
2.2 标准曲线和方法检出限

将配制的标准溶液重复进样3次,以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标建立标准曲线。如表2所示,海藻糖、葡萄糖和麦芽糖在一定的浓度范围内都具有良好的线性关系,线性相关系数均不低于 0.9998。根据3倍信噪比(S/N=3)分别计算出海藻糖、葡萄糖和麦芽糖的检出限(见表2)。魏泱等[16]使用HPLC方法检测海藻糖,其分析方法的检出限是10 mg/L,本文中方法检出限为0.010 mg/L,相比于HPLC法灵敏度有了很大的提高。与许丽等[17]测定化妆品中的海藻糖检出限为0.020 mg/L 相比,本方法的灵敏度也有一定程度的提高。

表2 标准工作曲线的线性范围、相关系数和检出限 Table 2 Linear ranges,correlation coefficients of standard working curves and detection limits for the sample
2.3 方法的回收率和重复性

为了考察对实际样品的适用性,我们检测了海藻糖合酶催化麦芽糖制备海藻糖反应样品中的海藻糖、葡萄糖和麦芽糖。将同一批样品分成3份,分别进行低、中、高3个水平的添加试验(n=3),计算其回收率。从表3中可看出,回收率在89.40% ～103.2%之间。测定重复性是对混合标准溶液连续进样6次,计算其结果的相对标准偏差。3种糖含量的相对标准偏差在0.93% ～2.69%之间,重现性良好。

表3 样品中海藻糖、葡萄糖和麦芽糖的加标回收率(n=3) Table 3 Recoveries of trehalose,glucose and maltose spiked in a sample (n=3)
2.4 生物转化样品的检测

取生物转化过程中的样品以 10000 r/min 离心后,取上清液,稀释 10000 倍,经0.22 μ m滤膜过滤,在1.2.4节中色谱条件下进行分析(见图3)。测得海藻糖、葡萄糖和麦芽糖的质量浓度分别为101.084、10.182、94.030 g/L,海藻糖的转化率达到了50.5% 。

图3 紫海胆样品中NMG和SMG的提取离子色 Fig.3 Extracted ion chromatograms (EIC) of NMG and SMG from sea urchin Anthocidaris crassispina
3 结论

本文建立了一种简单快速的离子色谱同时测定生物转化海藻糖生成过程中底物、产物和副产物含量的方法,由高效阴离子交换色谱柱分离后通过脉冲安培检测器进行检测,得到样品中海藻糖、葡萄糖和麦芽糖的含量。本方法相对于其他的常规方法,灵敏度高,处理步骤简单,无需衍生,稀释后可直接进行检测。

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