HP6890 (GC)-5975 (MS)型气相色谱-质谱联用仪,美国Agilent公司;聚氟乙烯采集袋(2 L,Teflon^®FEP),大连德霖气体包装有限公司;微型空气泵(FAY4002,6 L),成都气海机电制造有限公司;活性炭管(外径6 mm,长75 mm),Tenax TA吸附管(100 mg/50 mg,60/80目;外径6 mm,长75 mm),美国Sigma-Aldrich公司;玻璃转子流量计(LZB-4),天津流量仪表有限公司;无味特氟隆管(PTEE),瑞典VICI Jour公司;棕色进样瓶(2 mL),美国Agilent公司;正己烷,色谱纯,美国Fisher公司;丙酮,优级纯,天津试剂公司。

本研究顶空样品野外收集于2013年5月上旬,供试植株为中国科学院昆明植物研究所百草园内栽培的算盘子,采集盛花期的雌花和雄花各约200朵。

采用动态顶空吸附法收集算盘子花气味^[25],主要工作流程为:将采集好的花放入无味透明的聚氟乙烯采集袋中。首先,将通气泵产生的空气经过活性炭管净化,主要目的是除掉空气中的水分以及灰尘,以免影响后续吸附剂对花气味挥发物的吸附效果,由采集袋进气口通入袋内,模拟自然状态花气味挥发;然后,用抽气泵将花挥发的气味经由采集袋出气口导入填充有Tenax TA吸附剂的玻璃管中,进行吸附收集。通气端和进气端空气流速均由玻璃转子流量计调节控制,为400 mL/min。收集装置中所有器件均用无味的特氟隆管连接。采样时间:晚上6 ∶ 30～11 ∶ 30,收集5 h。用空气作为对照,与花气味采集同步进行。

采集完毕后,用保鲜膜密封吸附管,然后用锡箔纸包裹并装入自封袋,置于超低温冰盒带回实验室。用2 mL正己烷洗脱吸附管,收集0.5 mL含有花气味的洗脱液于2 mL棕色进样瓶内。氮吹浓缩至100 μ L。最后将样品置于-18 ℃冰箱保存,直至进行仪器分析时取出。

在Okamoto等研究^[7]的基础上对气相色谱条件进行了优化。色谱柱:HP-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μ m,Agilent,美国);程序升温:40 ℃保持5 min,之后以3 ℃/min 升温至100 ℃,最后以5 ℃/min 升至200 ℃,保持5 min;进样量2 μ L,采用分流模式,分流比2 ∶ 1;进样口温度250 ℃;载气为高纯He,流速1.0 mL/min。

电离方式EI;质量扫描范围m/z 35～450;电子能量70 eV;接口温度280 ℃;离子源温度230 ℃;四极杆温度150 ℃。

花气味化学成分的鉴定首先利用仪器自带的标准谱库(NIST08)进行检索,对于谱库检索结果物质单一,且匹配度高的峰,直接根据检索结果给予确认;然而,对于一些检索结果中出现两种及以上物质的峰,进一步在NIST化学数据库网站(http:/ /webbook. nist. gov/chemistry)上查询这些物质的保留指数,根据保留指数大小,最后加以确定。运用离子流峰面积归一化法计算花气味各挥发物组分的相对含量。

所有数据均表示为平均值±标准差。利用单因素方差分析中的Tukey’s方法检验花气味不同类型挥发物相对含量之间的差异性。数据分析和图片制作均用Graphad Prism 5. 0软件完成。

花气味是植物长期进化的产物,在传粉过程中起到了吸引传粉者的关键作用^[26]。目前,动态顶空吸附-GC-MS技术广泛应用在植物与昆虫的关系研究中，运用此技术已分析鉴定出了小叶黑面神^[8]、鸡嗉子榕^[14]花气味的化学成分,并且通过电生理以及昆虫行为学实验筛选出了吸引各自传粉者的化合物:小叶黑面神花中2-苯乙醇和2-苯乙腈,即具有电生理活性,而且两者混合物也能够吸引传粉头细蛾^[8];鸡嗉子榕果挥发物中对苯甲基醚可以强烈地吸引榕小蜂^[14]。因此,这种方法可信度高,收集的挥发物中包含了植物花真实的化学信息,可以为后续开展昆虫学实验提供可信的数据。本研究也采用动态顶空吸附-GC-MS对算盘子花气味成分进行分析,获得其总离子流图(见图1),扣除空气中杂质峰后,共分离得到47个峰,可以认为此47个峰几乎代表了自然状态下算盘子花挥发的全部挥发物。

图1

Fig. 1

图1 算盘子花气味的动态顶空吸附-GC-MS总离子流图 Fig.1Total ion chromatograms of the floral scent components in G. puberum using gas chromatography-mass spectrometry with dynamic headspace

采用仪器自带谱库,运用计算机检索，结合人工解析各个峰对应的质谱图,从算盘子花气味中共鉴定出45种化合物(见表1),相对含量超过1%的只有11种,占总含量的92.33% ,分别是:顺-丁酸-3-己烯酯、反- β -罗勒烯、反-氧化芳樟醇(呋喃型)、芳樟醇、 β -榄香烯、 γ -芹子烯、大根香叶烯D、 β -芹子烯、 α -芹子烯、 β -人参烯和苯乙腈。在这45种挥发物中,有超过40种的化合物广泛存在于其他一些植物花中^[27]。因此,与同科植物小叶黑面神以及其他5种算盘子植物一样^{[7, 8]},算盘子花气味的化学组成也是通过常见的化合物来体现的。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 多环芳烃的相对分子质量、动力学直径及分组 Table 1 Mr,kinetic diameters and grouping of the PAHs     Compound Retention time/min Relative content/% Fatty acid derivatives(脂肪酸衍生物)     (E)-2-Hexenal(反-2-己醛) 8.270 0.08±0.03     (Z)-3-Hexen-1-ol(顺-3-己烯-1-醇) 8.458 0.15±0.03     Hexenyl acetate(乙酸己烯酯) 16.369 0.04±0.01     (Z)-2-Hexenyl acetate(顺-乙酸-2-己烯酯) 16.523 0.02±0.01     (Z)-3-Nonen-1-ol(顺-3-壬烯-1-醇) 23.395 0.10±0.03     (E)-2-Nonenal(反-2-壬醛) 23.607 0.16±0.04     (E)-2-Nonen-1-ol(反-2-壬烯-1-醇) 24.141 0.05±0.03     (Z)-3-Hexenyl butyrate(顺-丁酸-3-己烯酯) 24.984 1.16±0.33     Hexyl butyrate(丁酸己酯) 25.258 0.42±0.01     (E)-2-Hexenyl butyrate(反-丁酸-2-己烯酯) 25.406 0.26±0.06     (Z)-3-Hexenyl isovalerate(顺-异戊酸-3-己烯酯) 26.977 0.10±0.02     (Z)-3-Hexenyl valerate(顺-戊酸-3-己烯酯) 27.136 0.11±0.02     2-Ethylhexyl butyrate(丁酸-2-乙基己酯) 30.338 0.05±0.01 Monoterpenes(单萜类)     2-Pentylfuran(2-戊基呋喃) 15.103 0.13±0.05     (Z)-β-Ocimene(顺-β-罗勒烯) 17.549 0.06±0.02     (E)-β-Ocimene(反-β-罗勒烯) 18.059 1.72±0.39     (Z)-Linalool oxide(furanoid)(顺-氧化芳樟醇(呋喃型)) 19.220 0.67±0.23     (E)-Linalool oxide(furanoid)(反-氧化芳樟醇(呋喃型)) 20.043 3.14±0.53     Linalool(芳樟醇) 21.006 38.06±3.36     6-Ethenyldihydro-2,2,6-trimethyl-2H-pyran-3(4H)-one 21.136 0.75±0.33     (6-乙烯基-2,2,6-三甲基-2氢-呋喃-3(4氢)-酮)     (E,Z)-2,6-Nonadienal(反,顺-2,6-壬二烯) 23.289 0.07±0.01 Sesquiterpenes(倍半萜)     α-Ylangene(α-衣兰烯) 31.821 0.36±0.16     α-Copaene(α-胡椒烯) 31.961 0.26±0.41     β-Elemene(β-榄香烯) 32.573 23.84±0.07     β-Caryophyllene(β-石竹烯) 33.266 0.95±0.15     β-Copaene(β-胡椒烯) 33.545 0.21±0.07     γ-Elemene(γ-榄香烯) 33.671 0.48±0.14     α-Guaiene(α-愈创木烯) 33.810 0.05±0.01     Alloaromadendrene(别香橙烯) 33.969 0.15±0.06     Humulene(葎草烯) 34.229 0.21±0.05     4,5-di-epi-aristolochene(4,5-二-非手性-马兜铃烯) 34.667 0.07±0.01     γ-Selinene(γ-芹子烯) 34.860 4.37±0.39     Germacrene D(大根香叶烯D) 35.014 3.93±1.35     β-Selinene(β-芹子烯) 35.173 5.05±0.09     α-Selinene(α-芹子烯) 35.409 6.14±0.16     α-Panasinsen(α-人参烯) 35.972 0.32±0.04     β-Panasinsen(β-人参烯) 39.343 2.88±0.12 Aromatics(芳香族)     Benzaldehyde(苯甲醛) 13.364 0.04±0.02     Benzyl nitrile(苯乙腈) 22.571 2.04±0.09     Methyl salicylate(水杨酸甲酯) 25.172 0.03±0.03     Indole(吲哚) 29.293 0.10±0.01     Eugenol(丁香酚) 31.422 0.10±0.04     Mellein(蜂蜜曲菌素) 36.627 0.34±0.06     (Z)-3-Hexenyl benzoate(顺-苯甲酸-3-己烯酯) 37.263 0.19±0.03     Hexyl benzoate(苯甲酸己酯) 37.436 0.07±0.02 Unknown(未知化合物) 0.19±0.13

表1 多环芳烃的相对分子质量、动力学直径及分组 Table 1 Mr,kinetic diameters and grouping of the PAHs

芳樟醇(38.06±3.36)%和 β -榄香烯(23.84±0.07)%两种物质在算盘子花气味中含量最高,总共占相对含量的61.9%(见表1),是算盘子花气味的主要成分,与已报道的5种算盘子植物相比,它们的花气味主要成分之间存在明显的差异^[7]。小叶黑面神花中2-苯乙醇和2-苯乙腈含量最高,超过80% ,昆虫学实验证明,这两种物质具有很强的电生理活性,两者混合物能够强烈吸引小叶黑面神头细蛾^[8];因此,推测芳樟醇和 β -榄香烯两种含量很高的挥发物也可能是吸引算盘子头细蛾的活性物质。对于此推测还需要进一步进行头细蛾电生理以及昆虫行为学试验来验证。

目前,通过现代提取技术从 1 000 种植物花中已分离到 1 720 种挥发性有机化合物^[27]。通常分为3大类:(1)脂肪族衍生物,通过脂肪酸途径合成;(2)单萜和倍半萜类化合物,主要通过异戊二烯途径合成;(3)苯环类芳香族化合物,通过莽草酸途径合成^[28]。在算盘子花气味中,单萜类和倍半萜类物质相对含量最高,分别为(44.6±2.06)%和(49.6±2.46)% ,显著高于脂肪族衍生物(2.71±0.45)%和芳香族化合物(2.91±0.06)%。

大戟科叶下珠族算盘子属、黑面神属植物与头细蛾之间都存在专性传粉育幼互利共生关系^{[2, 3, 4, 5]}。同本研究一样,Okamoto等^[7]发现另外5种算盘子属植物花气味也主要以萜类物质为主,尤其是单萜类物质。然而,Svensson等^[8]研究表明小叶黑面神花气味中芳香族化合物相对含量最高^[7]。尽管与传粉头细蛾相关的叶下珠族植物种类繁多,但现已分析鉴定出花气味成分的植物种类有限,就目前研究结果的对比分析可以看出,与头细蛾相关的叶下珠族不同属间植物花气味化合物类别组成存在明显的差异,主要原因可能是黑面神属和算盘子属植物在叶下珠族植物发育系统中分别属于不同的独立的进化枝系^[29],导致它们的花气味在进化过程中同样分化出属于本属特定的、区别于其他属的化合物类别,同时也推测此类特定的化合物包含了其专门与种特异性传粉头细蛾进行化学交流的主要物质。