超高效合相色谱仪(ACQUITY UPC²):包括合相色谱管理器、样品管理器、柱温箱管理器、二元溶剂管理器和SQD 2质谱检测器;515溶剂补偿泵(美国Waters公司)。ACQUITY UPC² BEH 2-EP色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μ m)、ACQUITY UPC² BEH色谱柱(100 mm×3 mm,1.7 μ m)、ACQUITY UPC² HSS C18 SB色谱柱(100 mm×2.1 mm,1. 8 μ m)和ACQUITY UPC² CSH^TM Fluoro-Phenyl Column色谱柱(100 mm×3 mm,1.7 μ m)(美国Waters公司)。METTLER TOLEDO AL204型电子天平(瑞士METTLER公司)。PURELAB Ultra MK 2型超纯水仪(英国ELGA公司)。5种脂肪酸标准品棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸均购自Sigma Aldrich公司,纯度大于99% 。正己烷、甲醇和乙腈为色谱纯(德国Merck公司)。实验用水为超纯水。玉米油、葵花籽油、大豆油、菜籽油均购于正规超市,茶油和花生油为农家自榨油。

分别准确称取0.05 g(精确至0.001 g)各种脂肪酸标准样品,用正己烷溶解并分别定容于50 mL容量瓶中,制备成1 g/L 的单一标准品储备液。然后用正己烷制备成100 mg/L 混合标准溶液,再稀释成系列标准工作溶液。

分别称取5 g上述6种食用油置于100 mL烧瓶中,加入10 g 250 g/L 的KOH溶液进行皂化反应,加冷凝管于100 ℃油浴中回流8 h,停止加热。冷却后加入10 mL 2 mol/L 的H₂SO₄溶液进行酸化,卸下烧瓶,转入分液漏斗,静置分层。上层用蒸馏水洗涤至中性,加入无水Na₂SO₄干燥后得到各种植物油相对应的脂肪酸样品。再分别称取约0.01 g该脂肪酸样品于100 mL容量瓶中,用正己烷定容,溶液经有机膜过滤后直接进行UPC²分析。

UPC²系统所使用的亚2 μ m色谱柱,涵盖了正相和反相LC的色谱柱类别,本实验首先考察了4种不同填料的ACQUITY UPC²色谱柱对脂肪酸分离的影响,结果如图 2所示。色谱柱选择性的大小依次为:BEH 2-EP＞HSS C18 SB＞BEH＞CSH^TM Fluoro-Phenyl,其中,BEH 2-EP色谱柱的固定相是在亚乙基桥杂化颗粒表面键合了2-乙基吡啶,对具有极性官能团的化合物具有较好的选择性,5种脂肪酸获得了有效分离。因此选用BEH 2-EP色谱柱。

图 2

Fig. 2

图 2 不同色谱柱对5种脂肪酸分离效果的影响 Fig. 2 Effect of chromatographic columns on the separation of the five fatty acids Peaks: 1. palmitic acid; 2. stearic acid; 3. oleic acid; 4. linoleic acid; 5. linolenic acid.

改性剂会改变流动相的极性,对UPC²的分离有一定的影响。考察了3种改性剂甲醇、乙腈、甲醇/乙腈(1 ∶ 1,v/v)对5种脂肪酸分离的影响,结果如图 3所示。3种改性剂对脂肪酸的洗脱能力为甲醇﹥甲醇/乙腈(1 ∶ 1,v/v)﹥乙腈;3种改性剂的选择性存在差异,其中甲醇/乙腈(1 ∶ 1,v/v)和乙腈的分离效果相当,但使用乙腈时保留时间相对较长。因此,选择甲醇/乙腈(1 ∶ 1,v/v)作为流动相中的改性剂,此时对样品的洗脱能力和分离效果较好。

图 3

Fig. 3

图 3 不同改性剂对5种脂肪酸分离效果的影响 Fig. 3 Effect of organic modifiers on the separation of the five fatty acids. Peaks: 1. palmitic acid; 2. stearic acid; 3. oleic acid; 4. linoleic acid; 5. linolenic acid.

柱温的改变会在一定程度上影响UPC²的分离效果,所以实验中以混合标准品为对象,在改性剂为甲醇/乙腈(1 ∶ 1,v/v)、流速0.8 mL/min 和背压1.38×10⁷ Pa的条件下,考察了不同柱温(40～60 ℃)对分离效果的影响。结果如图 4所示,随着柱温的升高,化合物的保留增强,与常规液相色谱中柱温对保留时间的影响不同。这是因为升高温度会降低超临界CO₂的密度,从而减弱其洗脱能力,导致化合物的保留值增大。当柱温为50 ℃时,样品的分离和保留效果较好。

图 4

Fig. 4

图 4 温度对5种脂肪酸分离效果的影响 Fig. 4 Effect of temperature on the separation of the five fatty acids Peaks: 1. palmitic acid; 2. stearic acid; 3. oleic acid; 4. linoleic acid; 5. linolenic acid.

背压的改变也会在一定程度上影响UPC²的分离效果,所以在改性剂为甲醇/乙腈(1 ∶ 1,v/v)、流速0.8 mL/min 和柱温50 ℃的条件下,考察了不同系统背压(1.24×10⁷～1.51×10⁷ Pa)对分离效果的影响。结果如图 5所示,背压升高造成CO₂的密度和黏度增加,进而导致流动相的溶剂化能力和洗脱能力提高,使得化合物的保留时间缩短。背压为1.38×10⁷ Pa时的分离效果与分析效率较好。

图 5

Fig. 5

图 5 背压对5种脂肪酸分离效果的影响 Fig. 5 Effect of back pressure on the separation of the five fatty acids Peaks: 1. palmitic acid; 2. stearic acid; 3. oleic acid; 4. linoleic acid; 5. linolenic acid

在MS方法开发中,不同的补偿溶剂对目标物的离子化效率也会产生一定的影响。实验考察了分别含1%(v/v)水、0.1%(v/v)甲酸铵、0.1%(v/v)醋酸铵的甲醇作为补偿溶剂和不同的流速(0.1、0.2、0.3 mL/min)对5种脂肪酸的分离影响。在相同的梯度洗脱条件下,甲醇-1%(v/v)水作为补偿溶剂且流速为0.2 mL/min 时,目标物离子化效果最好,色谱峰尖锐、对称,响应灵敏度高,5种脂肪酸分离效果好。

配制不同质量浓度的混合标准工作液,在优化的条件下进行测定,外标法定量,通过Masslynx 4.1软件得到化合物响应面积(Y)和质量浓度(X,mg/L)的线性关系(见表 1),5种脂肪酸的线性范围为0.5～100 mg/L,相关系数均大于 0.998 5,表明线性关系良好。以信噪比大于10时的质量浓度确定定量限(LOQ),为0.15～0.50 mg/L。

表 1

Table 1

表 1(Table 1)

表 1 5种脂肪酸的线性关系、相关系数(R2)及定量限 Table 1 Linear relationships,correlation coefficients (R2) and LOQs of the five fatty acids Fatty acid Linear range/(mg/L) Linear equation R2 LOQ/(mg/L) Palmitic acid 0.5-100 Y=1.323×104X+1.932×102 0.9997 0.20 Stearic acid 0.5-100 Y=8.083×103X+5.477×103 0.9990 0.50 Oleic acid 0.5-100 Y=1.615×104X+1.351×103 0.9997 0.26 Linoleic acid 0.5-100 Y=1.804×104X+5.047×103 0.9998 0.22 Linolenic acid 0.5-100 Y=2.177×104X-7.898×103 0.9985 0.15 Y: peak area; X: mass concentration,mg/L.

表 1 5种脂肪酸的线性关系、相关系数(R2)及定量限 Table 1 Linear relationships,correlation coefficients (R2) and LOQs of the five fatty acids

取已经测定脂肪酸含量的菜籽油作为基质样品,再设置5种脂肪酸低、中、高3个加标水平进行方法学考察,按优化条件分析,每个加标水平平行测定6次。如表 2所示,方法的回收率为89.61% ～108.50% ,RSD为0.69% ～3.01% ,可满足食用油中脂肪酸的测定。

表 2

Table 2

表 2(Table 2)

表 2 加标样品中5种脂肪酸的回收率和相对标准偏差(n=6) Table 2 Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of the five fatty acids in spiked samples (n=6) Fatty acid Background/(mg/L) Added/(mg/L) Found/(mg/L) Recovery/% RSD/% Palmitic 4.16 1.50 5.58 94.67 2.67 acid 4.16 4.20 8.28 98.09 1.90 4.16 12.50 16.68 100.16 2.31 Stearic 2.00 2.00 4.17 108.50 2.93 acid 2.00 5.00 7.21 104.20 1.81 2.00 20.00 22.21 101.11 2.70 Oleic 59.90 6.00 65.82 98.67 1.75 acid 59.90 12.00 71.91 100.33 0.69 59.90 24.00 83.68 99.08 2.21 Linoleic 19.53 6.50 25.90 98.01 1.82 acid 19.53 19.50 38.92 99.44 0.89 19.53 58.50 78.51 100.82 1.78 Linolenic 7.63 2.50 9.87 89.61 3.01 acid 7.63 7.60 14.93 96.07 2.25 7.63 22.90 30.14 98.30 2.61

表 2 加标样品中5种脂肪酸的回收率和相对标准偏差(n=6) Table 2 Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of the five fatty acids in spiked samples (n=6)

本研究选取玉米油、葵花籽油、大豆油、茶油、菜籽油和花生油等6种食用植物油,测定了5种主要脂肪酸的含量,结果见表 3。上述6种食用油中油酸、亚油酸和亚麻酸等不饱和脂肪酸总含量分别为85.21% 、88.15% 、82.92% 、89.41% 、87.06% 、78.84% ,棕榈酸和硬脂酸等饱和脂肪酸总含量分别为13.80% 、9.75% 、14.38% 、9.89% 、6.16% 、15.54% ,不饱和脂肪酸远高于饱和脂肪酸且各成分含量差异显著。其中:茶油、菜籽油以油酸为主,但茶油中的油酸含量远高于菜籽油。玉米油、葵花油和大豆油以亚油酸为主,但葵花油中亚油酸最高,玉米油和大豆油则差异不大。花生油中油酸含量略高于亚油酸,两者含量差异没有其余5种食用油明显。6种食用油除葵花籽油和花生油外均含有亚麻酸,其中以菜籽油中的亚麻酸含量最高,为7.63% 。6种样品的色谱图如图 6所示。

表 3

Table 3

表 3(Table 3)

表 3 实际样品的分析结果 Table 3 Analytical results of real samples Sample Palmitic acid/(mg/g) Stearic acid/(mg/g) Oleic acid/(mg/g) Linoleic acid/(mg/g) Linolenic acid/(mg/g) Corn oil 12.28 1.52 29.90 54.63 0.68 Sunflower oil 6.11 3.64 25.03 63.12 - Soybean oil 10.3 4.08 24.12 52.86 5.94 Tea oil 8.03 1.86 79.93 8.77 0.71 Rapeseed oil 4.16 2.00 59.90 19.53 7.63 Peanut oil 12.05 3.49 44.84 34.00 - -: not detected.

表 3 实际样品的分析结果 Table 3 Analytical results of real samples

图 6

Fig. 6

图 6 (a)玉米油、(b)葵花籽油、(c)大豆油、(d)茶油、(e)菜籽油和(f)花生油中5种脂肪酸的色谱图 Fig. 6 Chromatograms of the five fatty acids in (a) corn oil,(b)sunflower oil,(c) soybean oil,(d) tea oil,(e) rapeseed oil and (f) peanut oil Peaks: 1. palmitic acid; 2. stearic acid; 3. oleic acid; 4. linoleic acid; 5. linolenic acid.