色谱  2015, Vol. 33 Issue (8): 897-901   PDF (834KB)    
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胡婷婷
曲晓宇
康明芹
宋清莲
杨璐
赵韫慧
张代辉
高效液相色谱-高分辨质谱快速筛查和确证保健品中非法添加的壮阳药物
胡婷婷1,2, 曲晓宇3, 康明芹1, 宋清莲1, 杨璐1, 赵韫慧1, 张代辉1     
1. 吉林出入境检验检疫局, 吉林 长春 130062;
2. 吉林大学公共卫生学院, 吉林 长春 130021;
3. 吉林大学第一医院, 吉林 长春 130021
收稿日期：2015-03-16
基金项目：国家科技支撑计划项目(2012BAK08B01).
通讯作者：2662439@qq.com(张代辉)
摘要：采用高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱对中药保健品中红地那非、伐地那非、那红地那非、他达拉非、西地那非、豪莫西地那非、硫代艾地那非、伪伐地那非、羟基豪莫西地那非、育亨宾、达泊西汀等11种非法添加的壮阳类药物进行了快速筛查、确证和定性定量检测。样品经甲醇提取后,采用正离子扫描模式进行检测。结果表明,11种待测物的定量限除那红地那非为25.0 ng/mL外,其他10种壮阳类药物均为5.0 ng/mL,在5.0~200.0 ng/mL(那红地那非在25.0~500.0 ng/mL)范围内,线性相关性较好,相关系数均不小于0.9990。平均添加回收率为82.0%~105.9%,相对标准偏差为4.7%~16.5%。本方法利用准确质量数匹配和自建标准谱库,通过多级特征碎片离子的比对,实现快速筛查和确证,简单快速,结果可靠。
关键词： 高效液相色谱-高分辨质谱     壮阳药物     保健品     快速筛查    
Rapid screening and confirmation of illegally added anti-impotence preparations in health care products by high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry
HU Tingting1,2, QU Xiaoyu3, KANG Mingqin1, SONG Qinglian1, YANG Lu1, ZHAO Yunhui1, ZHANG Daihui1     
1. Jilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Changchun 130062, China;
2. Public Health College of Jilin University, Changchun 130021, China;
3. The First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, China
Received: 2015-3-16
Abstract: A method was established for rapid screening and quantifying 11 illegally added anti-impotence preparations (yohimbine, acetildenafil, nor-acetildenafil, homosildenafil, hydroxyhomosildenafil, sildenafil, vardenafil, thioaildenafil, tadalafil, pseudovardenafil, dapoxetine) in health care products by high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry. The samples were extracted with methanol and analyzed by positive mode in the MS detection. The results showed that the limits of detection were 25.0 ng/mL except for nor-acetildenafil (5.0 ng/mL), the linear ranges were 5.0-200.0 ng/mL except for nor-acetildenafil (25.0-500.0 ng/mL) with the correlation coefficients not less than 0.9990. The recoveries were in the range of 82.0%-105.9% with the relative standard deviations of 4.7%-16.5%. This method is accurate, simple and rapid, and can be used in rapid screening and quantitative analysis of the 11 illegally added anti-impotence in health care products.
Key words: high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (HPLC-HRMS)     anti-impotence preparations     health care products     rapid screening    

近些年,抗疲劳类保健品(尤其是号称纯中药成分的保健品)在市场上大量销售,但由于一些不法分子牟利心切,在中药保健品中大量非法添加壮阳类化学成分,对人体造成了很大危害。消费者在不知情的情况下服用这些含有壮阳类化学成分的保健品,会出现头晕、恶心、青光眼等症状,严重者会造成肾功能、心脏功能及心血管系统的严重损伤[1, 2, 3]。因此,有必要建立专属性强、能快速准确检测此类非法添加物质的检测方法。

目前检测保健品中非法添加物质的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)及高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)等[4, 5, 6, 7]。随着质谱技术的发展,高分辨质谱越来越受到人们的关注,与串联四极杆质谱相比,高分辨质谱具有扫描速度快、分辨率高等优点[8, 9, 10, 11, 12],但目前在保健品非法添加物质的快速筛查方面应用仍然较少。

本实验运用高效液相色谱-高分辨质谱联用技术,建立了同时检测抗疲劳类保健品中11种壮阳药物的方法,操作简便、快速准确、结果可靠。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

TripleTOFTM5600+系统(AB SCIEX公司),Ekspert ultraLC 100液相色谱仪,AL204电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司); KQ5200超声波清洗器,功率250 W,频率25 kHz(昆山超声波仪器有限公司)。

西地那非和他达拉非标准物质购于加拿大TRC公司,红地那非、伐地那非、那红地那非、豪莫西地那非、硫代艾地那非、伪伐地那非、羟基豪莫西地那非、育亨宾、达泊西汀等标准物质购于中国食品药品检定研究所,所有标准物质纯度均大于98% 。甲醇、乙腈均为色谱纯,甲酸为优级纯,水为去离子水。

1.2 标准溶液的配制

标准物质溶液:取上述11种标准物质各约10 mg,精确称重至0.1 mg,分别置于10 mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得各标准储备溶液(约1.0 mg/mL)。实验时用甲醇稀释上述混合标准储备液,配制成不同浓度的混合标准使用液。

1.3 样品前处理
1.3.1 口服液、保健酒等液体样品

本实验所取口服液样品均为市售抗疲劳类保健品,准确吸取0.25 mL待测样品于25 mL具塞试管中,用甲醇定容至25 mL,混匀后过0.22 μ m滤膜,取滤液待测。

1.3.2 片剂、胶囊剂及颗粒剂等固体样品

本实验所取片剂、胶囊剂及颗粒剂样品均为市售抗疲劳类保健品,准确称取约0.25 g粉碎均匀的样品于25 mL具塞试管中,加入约15 mL甲醇,超声波提取10 min,用甲醇定容至25 mL,过0.22 μ m滤膜,取滤液待测。

1.4 色谱条件

色谱柱:Xbridge C18柱(150 mm×2.1 mm,3.5 μ m);流动相:A为0.1%甲酸水溶液,B为0.1%甲酸乙腈,线性梯度洗脱,程序如下:0 min 90%A 10%B,1 min 90%A 10%B,8 min 5%A 95%B,10 min 5%A 95%B,10.1 min 90%A 10%B,15 min 90%A 10%B,共15 min;流速:0.3 mL/min;柱温:25 ℃;进样量:10 μ L。

1.5 质谱条件

离子源:电喷雾电离源(ESI),正离子模式;扫描范围:一级质谱m/z 100～1000,二级质谱m/z 50～1000;离子源温度:600 ℃;气帘气(CUR)压力: 2.41×105 Pa;雾化气(GS1)压力: 3.79×105 Pa;辅助加热气(GS2)压力: 3.79×105 Pa。11种待测物的保留时间等见表1。

表 1 11种待测物的保留时间和精确相对分子质量(Mr) Table 1 Retention times and the precise relative molecular masses (Mr) for the 11 anti-impotence preparations
2 结果与讨论
2.1 质谱条件和色谱条件的优化

根据待测化合物的结构特征,选择正离子模式进行质谱参数优化。11种待测物在正离子电离模式下均形成[M+H]+准分子离子峰。

液相色谱条件方面,考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液等流动相体系,结果发现在0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液体系中,各化合物峰形较好,且能达到较好的分离效果,因此选其作为流动相,进行梯度洗脱,11种待测物的保留时间见表1,提取离子色谱图见图1。

图 1 11种待测物的提取离子色谱图 Fig. 1 Extracted ion chromatograms of the 11 anti-impotence preparations For peak Nos.,see Table 1.
2.2 前处理方法的选择

在检测工作中我们发现,中药成分保健品中添加的非法添加物质含量较大,因此在能够满足检出限的情况下采用尽量大的稀释倍数,以免仪器受到污染,通过考察甲醇、水、50%甲醇溶液对样品的提取情况,发现在使用纯甲醇溶解样品时待测物的峰形较好,且干扰较少,因此选择用纯甲醇作为提取溶剂。由于样品稀释倍数较大,实验证明基质效应对11种待测物带来的影响极小,可以忽略不计,图2为空白样品稀释后的全扫描谱图。

图 2 空白样品的全扫描谱图 Fig. 2 Full scan chromatogram of a blank sample
2.3 数据库的建立

建立了包括11种非法添加壮阳类化合物的分子式、精确质量数、二级特征碎片离子以及保留时间等信息数据库,通过peakview软件分别对待测物的一级和二级质谱图与数据库中质谱图进行比对,同时结合保留时间、母离子、碎片离子精确质量数和同位素丰度比进行比对,用于进一步定性确证。

2.4 方法的线性关系和定量限

按上述液相色谱及质谱条件测定不同质量浓度的混合标准溶液,以各组分峰面积对其质量浓度绘制标准曲线,得到线性回归方程和相关系数。以信噪比(S/N)等于3的浓度作为该化合物的检出限,以信噪比(S/N)等于10左右的浓度作为定量限,结果见表2。

表 2 11种待测物的线性范围、回归方程、相关系数(r)、检出限和定量限 Table 2 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients (r),limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) for the 11 anti-impotence preparations
2.5 回收率及精密度

向空白样品(胶囊及口服液保健品)中加入11种待测物对照品溶液,添加水平分别为20.0、50.0和100.0 ng/mL,按实验方法处理并平行测定6次,计算回收率和精密度。结果表明,本方法回收率试验结果良好(见表3)。

表 3 11种待测物的精密度和回收率(n=6) Table 3 Precisions (RSDs) and recoveries for the 11 anti-impotence preparations (n=6)
2.6 实际样品分析

应用本方法对市售20种抗疲劳类中药保健品进行了检测,其中口服液3种,保健酒5种,片剂4种,胶囊剂6种,颗粒剂2种。结果表明，共检出阳性样品6个,其中2个样品(一种为保健酒，另一种为胶囊)检出西地那非,2个样品(胶囊)检出伐地那非,2个样品(一种保健酒，一种片剂)同时检出西地那非与他达拉非。

图3为检出西地那非的阳性样品的提取离子色谱图。

图 3 含有西地那非的阳性样品的提取离子色谱图 Fig. 3 Extracted ion chromatogram of a positive sample containing sildenafil
3 结论

本文建立了中药保健品中红地那非等11种非法添加壮阳类药物的液相色谱-高分辨质谱检测方法,可实现对11种物质的同时定性筛查和定量分析。本方法具有快速、灵敏、高效及选择性好的优点,为食品药品监督部门对抗疲劳类保健品的监督和管理提供了可靠的技术保障,对严格规范我国保健品市场具有重要意义。

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