近年来,在食品中非法添加和滥用酸性合成色素的现象层出不穷。因此相关的检测方法[1, 2, 3, 4, 5]也随之受到关注和研究。合成色素与天然色素有着本质区别,合成色素由于色泽鲜艳、容易上色等特点主要应用于工业生产中。如对羊毛、皮革、蚕丝等进行染色处理,但均有一定程度的毒性。然而有些不法分子为节省成本,在食品中非法添加酸性合成色素,如酸性黄[6]、酸性红[7]等,对人体健康和社会稳定产生了极大的危害。但考虑到酸性合成色素种类繁多,无法一一列明,因此有必要针对目前市场上常见的28种酸性合成色素建立筛查方法,从而为有效遏制非法添加行为和食品安全风险预警提供技术手段。
目前色素的检测方法很多,如毛细管电泳法[8]、高效液相色谱法[9, 10, 11]、液相色谱-质谱法[12, 13, 14, 15]等。液相色谱与质谱联用技术能够在一定程度上排除基质干扰,对于基质复杂、需要高灵敏度、宽适用范围的检测工作而言,它已成为最佳的手段之一。四极杆飞行时间质谱(Q-TOF MS)作为高分辨质谱,能测定得到精确质量数,并且通过数据库进行一级、二级质量数匹配和同位素匹配等进行化合物鉴定,特别是对非特定的目标化合物进行鉴定,同时可以对检测到的阳性目标物进行定量。但目前对未知添加色素的筛查技术研究较少,且未见水产品中未知添加色素检测的相关报道。
因此,本文以水产品为研究对象,对其中28种禁用的酸性合成色素进行分析,建立了UPLC-Q-TOF MS筛查方法。对样品前处理方法、液相色谱条件、质谱条件进行了系统优化,为水产品中酸性合成色素高通量的筛查和确证提供了可行的方法。
Agilent UHPLC和Agilent 6540-Q-TOF MS(Agilent,美国); Avanti®J-E高速冷冻离心机、Talboys涡旋混合器、N-EVAPTM-112氮吹仪、样品萃取管;甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯，均购自上海安谱实验科技股份有限公司;无水硫酸镁、乙酸铵、丙酮、正己烷、乙醇和氨水(质量分数25% ～28% )为分析纯;C18填料(40～63 μ m)、聚酰胺粉(100～200目)均购自上海安谱实验科技股份有限公司;实验用水为Milli-Q超纯水。
标准物质:苋菜红(Amaranth,纯度89% )、日落黄(Sunset Yellow FCF,纯度90% )、靛蓝(Indigo carmine,纯度89% )、诱惑红(Allura Red AC,纯度91% )、亮黑BN(Brilliant Black BN,纯度91% )、萘酚黄(Naphthol Yellow,纯度89% )、酸性红(New Coccine,纯度91% )、酸性黄(Acid Yellow,纯度89% )、喹林黄(Quinoline Yellow,纯度91% )、酸性红2G(Acid Red 1,纯度89% )、亮绿SF(Light Green SF Yellowish,纯度91% )、偶氮玉红(Carmoisine,纯度91% )、酸性红26(Ponceau Xylidine,纯度91% )、羊毛绿(Wood Green S,纯度91% )、橙色I(Orange I,纯度91% )、橙色II(Orange II,纯度91% )、监牢绿FCF(Fast Green FCF,纯度91% )、萘酚蓝黑(Naphthol Blue Black,纯度91% )、酸性蓝(Brilliant Blue FCF,纯度91% )、酸性红52(Sulforhodamine B,纯度91% )、赤藓红(Erythrosine,纯度91% )、荧光桃红(Phloxine B,纯度91% )、酸性黄36(Metanil Yellow,纯度91% )、酸性绿3(Guinea Green B,纯度91% )、荧光素钠(Uranine,纯度91% )、孟加拉玫瑰红(Rose Bengal,纯度91% )、酸性红87(Eosin Y,纯度91% )、丽春红SX(Ponceau SX)均购于上海安谱实验科技股份有限公司。
分别准确称取28种酸性合成色素标准品各10 mg于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解,配制成1 g/L 的单标准储备液(-20 ℃保存),再分别吸取1 g/L 的28种单标准储备液各1 mL于100 mL容量瓶中,用甲醇定容得10 mg/L 的混合标准溶液。用初始流动相将其稀释成相应的标准工作溶液,于4 ℃保存。
称取2.0 g样品于50 mL带盖聚四氟乙烯离心管中,加入10 mL氨水和乙醇水溶液(2 ∶ 7 ∶ 1,v/v/v),涡旋混匀后于80 ℃水浴中浓缩至4 mL,用200 g/L 柠檬酸调节提取液pH值至4.0,以 10000 r/min 冷冻离心10 min,将上清液转移至基质分散管中,管内装有氨基化吸附剂(1000 mg无水硫酸镁、50 mg C18粉末、200 mg聚酰胺粉末),振荡基质分散管5 min,以 10000 r/min 冷冻离心10 min,去除上清液,然后向沉淀中加入5 mL氨水-甲醇(30 ∶ 70,v/v)洗脱,重复洗脱一次后合并两次洗脱液,用氨化甲醇定容10 mL,取1 mL用氮气吹干,再用0.2 mL甲醇-水(50 ∶ 50,v/v)溶解,过0.22 μ m有机滤膜后供UPLC-Q-TOF MS分析测定。
Agilent Eclipse Plus-C18(100 mm×3.0 mm,1.8 μ m)作为分析柱,柱温为30 ℃;流动相A相为5 mmol/L 乙酸铵-0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相为乙腈。梯度洗脱程序:0～1 min,5%B～20%B; 1～10 min,20%B～100%B; 10 min～15 min,100%B。进样体积为3 μ L;流速为0.2 mL/min。
离子源:电喷雾离子(ESI)源;扫描方式:负离子全扫描;全扫描范围:m/z 50～1100;毛细管电压:3500 V;离子源喷雾电压:1500 V;离子化电压:130 V;鞘气温度:350 ℃;干燥气温度:325 ℃;鞘气流速:11 L/min;干燥气流速:8 L/min;数据采集模式:全息离子扫描(Allions MS/MS)。参比溶液中含三氯乙酸(C2HF3O2,精确相对离子质量为 112.9855)和六(1H,1H,3H-全氟丙氧基)磷氮的三氟乙酸加合离子(C20H19F27N3O8P+3,精确相对离子质量为 1033.9881)。
数据采集与处理通过Agilent Mass Hunter Workstation Software (Version B.05.00)软件完成,碎片离子数据库建立通过Agilent Mass Hunter PCDL Manager (B.04.00)软件完成。
选取负离子模式,在全扫描方式下优化离子化电压、毛细管电压、碰撞电压等参数。离子化电压和毛细管电压是质谱离子源的一项关键参数,该参数直接影响目标化合物的检测灵敏度。随着离子化电压和毛细管电压的逐渐增大,离子的响应强度会逐渐增强,响应达到一定值后,离子的响应又逐渐减弱。本实验考察了离子化电压为100～150 V以及毛细管电压为 3000～5500 V的影响,结果表明在130 V的离子化电压和3500 V的毛细管电压下,所有的目标化合物均能够得到比较满意的准分子离子峰,因此本文以130 V作为最佳采样离子化电压,根据优化结果采集数据。其次优化了碰撞电压,通过设定5～80 V的碰撞电压,根据二级离子灵敏度的总体情况进行调节,最终选择了两个碰撞能量,低能量值为10 V,高能量为40 V,由于高分辨质谱的筛查需要准确质量的二级图谱碎片进行匹配,所以通过不同的碰撞电压进行碎裂,并用全息二级图谱建立数据库,最终确定了用于酸性合成色素分析的质谱条件,同时用一级质量数、同位素丰度和二级碎片信息等建成一个完整的数据库,用于质谱筛选。
本实验选择甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液、甲醇-含0.1%(v/v)甲酸的5 mmol/L 乙酸铵溶液、乙腈-含0.1%(v/v)甲酸的5 mmol/L 乙酸铵溶液作为流动相,分析比较了多种酸性合成色素的分离效果。结果表明,乙腈的分离效果明显优于甲醇,同时乙腈的洗脱能力更好,提高了分析效率;而乙酸铵能够得到较好的酸性合成色素峰形,相比之下纯水的效果较差;且在乙酸铵溶液中加入0.1%(v/v)甲酸,虽然在负离子条件下灵敏度有一定程度的损失,但实验发现其影响在可接受的范围内,同时峰形和分离度有明显改善。因此比较了在乙酸铵溶液中添加不同体积分数(0% 、0.1% 、0.2% 、0.5% )的甲酸对色谱峰的影响,结果表明含0.1%(v/v)甲酸的5 mmol/L 乙酸铵溶液和乙腈为最佳的流动相。由此,通过优化质谱条件和流动相确定最终的采集方法,然后通过标准物质采集获得28种酸性合成色素的分子特征提取色谱图(见图1)。
通过Allions MS/MS模式一次进样同时检测28种酸性合成色素的质谱全扫描信息,在化学工作站设置28种酸性合成色素质谱检测的母离子及保 留时间等信息,检测得到的质谱特征离子如表1所示。
配制20～10000 μ g/L 的系列标准溶液,以峰面积(Y)对相应的质量浓度(X,μ g/L)分别绘制28种酸性合成色素的标准曲线。将200 μ g/L 混合标准溶液连续检测6次,计算峰面积的相对标准偏差(RSD)。各酸性合成色素的线性范围、相关系数(r)和峰面积的RSD见表2。结果表明,28种酸性合成色素在各自的线性范围内线性关系良好(r≥0.991)。
根据3倍、10倍信噪比(S/N)分别确定检出限(LOD)、定量限(LOQ)。在阴性的鲳鱼样品基质中添加100、200和500 μ g/kg 3个水平的混合标准溶液,按1.3节方法进行预处理,每个水平重复测定6次,得到28种酸性合成色素的回收率、LOD与LOQ(见表3)。28种目标物的LOD为5～50 μ g/kg,LOQ为20～100 μ g/kg;且在3个不同加标水平下28种酸性合成色素的回收率分别为70.24% ～106.47% ,可以满足国内外水产品中酸性色素检测的要求。
选取市售22份水产品(白蟹、富贵虾、小黄鱼、大黄鱼、龙头鱼、黄姑鱼、梅童鱼、鮸鱼、玉秃、鲳鱼、带鱼、青占鱼、马鲛鱼、鳓鱼、鲭鱼、鱿鱼、乌贼、海带、海蜇、海地瓜、蛏子和文蛤)进行检测,结果未发现阳性样品,下一步将以水产品加工品作为采集对象,扩大筛查范围。按照本方法筛选,以酸性红为例,图2是酸性红的二级碎片质谱图,可获得相应的母离子和碎片离子信息。经过精确分子质量及标准物质谱图数据库的检索,28种目标物的匹配度均大于85% ,说明建立UPLC-Q-TOF MS技术可快速有效地筛查水产品中28种酸性合成色素。
本文建立了UPLC-Q-TOF MS快速筛查水产品中28种酸性合成色素的方法,该方法简便快速,灵敏度高,其回收率及重复性能满足日常检测的要求。采用氨基化吸附剂基质分散法对样品净化处理,可有效地减少样本中杂质的干扰。且该方法具有高通量、高灵敏度、高分辨率、高质量精确度及可行的线性范围,可利用四极杆串联飞行时间质谱定性的功能,对28种酸性合成色素进行检测筛查,适用于水产品中违禁添加色素化合物的快速确证。
2015, Vol. 33 Issue (8): 822-829
PDF (1243KB)
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