EasySep-LC1010液相色谱仪(美国Unimicro Technologies公司); LC-10AD液相色谱泵(日本岛津公司); XL30ESEM电子扫描显微镜(荷兰FEI公司); GL-16C离心机(最高转速 16000 r/min)(上海安亭科技仪器厂); 601超级恒温水浴(江苏省金坛市医疗仪器厂); Milli-Q Reference型超纯水系统(美国Millipore公司)。液相色谱分析柱Gemini 5u C18 (250 mm×4.6 mm,5 μ m)(美国Phenomenex公司)。

甲基丙烯酸十八烷基酯(SMA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、 γ -甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷( γ -MAPS)(美国ACROS公司);环己醇、1,4-丁二醇(分析纯,天津市光复精细化工研究所);偶氮二异丁腈(AIBN,化学纯,上海试剂四厂);乙腈(ACN)、甲醇(色谱纯,国药集团化学试剂有限公司);盐酸、氢氧化钠和三氟乙酸(TFA)(分析纯,上海试剂总厂)。所用水均为超纯水,由Milli-Q reference型超纯水系统制得。熔融石英毛细管(250 μ m i. d.,375 μ m o. d.,河北永年锐沣色谱器件有限公司)。纯氮气(N₂,福州开发区友辉气体有限公司)。除草剂标准品:2,4-D、PPA、2,2-CPPA、2,3-CPPA、2,4-DP购自美国SIGMA公司。检测水样取自福州市闽侯县上街镇厚美村和浦口村。

0.1% TFA溶液:取1 mL TFA溶于超纯水,并移入 1000 mL容量瓶中,用超纯水定容,即得0.1%的TFA溶液。使用前需要用水系滤膜过滤,再超声脱气30 min。苯氧羧酸类标准储备液:分别称取适量的2,4-D、PPA、2,2-CPPA、2,3-CPPA和2,4-DP溶解于乙腈中,配制成100 mg/L 的标准储备液。实验前用流动相配制成所需浓度的标准溶液。

取10 mL(精确到0.01 mL)的检测水样,先用0.01 mL的TFA进行酸化处理,在转速为 5000 r/min 下离心5 min,取上清液用0.22 μ m水系滤膜过滤,用于in-tube SPME-HPLC联用系统测定。

在制备固相微萃取整体柱时,为保证毛细管整体柱内连续床层固定相稳定、不移动,首先对毛细管内壁进行预烯基化处理,在毛细管内壁键合上一层带烯基官能团的硅烷化试剂^[26]。整体柱制备方法参考文献^[27]。整体柱反应液由功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂组成,其中:SMA(18.0% ,质量分数)作为功能单体;EDMA(12.0% ,质量分数)作为交联剂;环己醇(56.0% ,质量分数)和1,4-丁二醇(14.0% ,质量分数)为致孔剂;AIBN(按单体质量的0.3%加入)作为引发剂^[18]。反应液用漩涡混合器混匀,超声15～20 min,用0.22 μ m有机系微孔滤膜过滤。之后用微孔注射器将处理好的反应液匀速注满已经预处理过的毛细管空管,用气相色谱进样橡胶垫片将毛细管两端封口,放入60 ℃水浴锅中恒温加热24 h。24 h之后取出毛细管,除去两端的橡胶垫片,以甲醇为流动相,在液相色谱泵上冲洗毛细管色谱柱约1 h,除去床层内残留的致孔剂、未反应的单体以及反应生成的一些副产物,得到毛细管整体柱。截取20 cm毛细管整体柱,作为在线固相微萃取毛细管整体柱,待用。

从毛细管的填料端切下长约为2 cm的一段,用XL30ESEM电子扫描显微镜观察固相微萃取毛细管整体柱的截面形貌。

in-tube SPME-HPLC系统结构参考文献^[28]构建,采用双泵双六通阀系统,如图1所示:六通阀V1定量环位置(即1、4号位)为500 μ L的定量PEEK管(聚醚醚酮管),六通阀V2的定量环位置(即1、4号位)为制备的毛细管整体柱;泵A与六通阀V1的6号位连接,泵B与六通阀V2的6号位连接,六通阀V1的5号位与六通阀V2的2号位相连。

图1

Fig. 1

图 1 in-tube SPME-HPLC联用系统结构图 Fig. 1 Construction of in-tube SPME-HPLC

联用系统运行流程:(1)实验开始时,六通阀V1处于Load状态,此时样品直接进入定量PEEK管。样品装载液(0.1%TFA溶液-乙腈(98 ∶ 2,v/v))通过泵A,经过六通阀V1,平衡固相微萃取整体柱。六通阀V2处于Load状态,流动相通过泵B,以1.0 mL/min 流速直接平衡液相色谱分析柱,以获得一个稳定的色谱分离基线。(2)进样完成后,开始富集清洗,六通阀V1由Load状态调为Inject状态,泵A与500 μ L的定量PEEK管相通,泵A以0.04 mL/min 流速将样品带入六通阀V2的固相微萃取整体柱。进样13 min后,六通阀V1重新调到Load状态,以样品装载液冲洗固相微萃取柱90 s,目的是消除固相微萃取柱中的水溶性杂质。(3)完成富集清洗后,将泵B的流速调为0.02 mL/min,六通阀V2由Load状态调为Inject状态后,用流动相以0.02 mL/min 洗脱固相微萃取柱5 min,目的是将固相微萃取柱上富集的样品洗脱至分离柱中。洗脱结束后,将六通阀V2的状态重新调到Load状态,同时将泵B流速调为1.0 mL/min 开始液相色谱分离检测。

文献报道的测定苯氧羧酸类化合物的HPLC流动相体系主要有:乙腈-水体系^[7]、乙腈-三乙胺水溶液(pH=10)体系^[8]、甲醇-乙酸铵溶液体系^[29]等。通过反复对比试验,本实验选择的流动相体系为0.1%(v/v)TFA水溶液-乙腈(55 ∶ 45,v/v),其他条件为流动相流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,检测波长为214 nm。在该条件下,5种苯氧羧酸类除草剂的分离效果较好,15 min内可完全分离。

固相微萃取毛细管整体柱长度、进样流速、进样时间、洗脱流速、洗脱时间等运行条件对in-tube SPME-HPLC联用系统检测都有影响,为了得到in-tube SPME-HPLC联用系统的最佳运行条件,我们对以上几个系统运行参数进行了考察。

2.3.1 固相微萃取毛细管整体柱长度的影响

在in-tube SPME-HPLC联用系统中,毛细管整体柱作为固相微萃取的介质,是整个联用系统的重要组成部分。
固相微萃取介质量的多少直接影响到in-tube SPME-HPLC联用系统的萃取能力。实验中,以250 μ m内径的毛细管制作固相微萃取整体柱,使用的整体柱越长则固相微萃取介质的量就越大,萃取能力就越强。由图3可以看出,保持其他条件不变,随着固相微萃取整体柱长度的增加,5种除草剂的峰面积不断增大。当整体柱长度大于20 cm以后,峰面积没有明显增大,考虑到随着使用的整体柱长度的增加,系统的柱压也不断增大,导致系统稳定性下降。因此,选用固相微萃取毛细管整体柱长度为20 cm。

图3

Fig. 3

图 3 固相微萃取整体柱长度的优化 Fig. 3 Optimization of the length of the SPME monolithic column Separation conditions: mobile phase,0.1% (v/v) TFA aqueous solution: ACN (55 ∶ 45,v/v); pump flow rate,1.0 mL/min; column temperature,30 ℃; detection wavelength,214 nm. System operating parameters: sampling flow rate,0.04 mL/min; sampling time,13 min; elution flow rate,0.02 mL/min; elution time,5 min.

2.3.2 进样流速的影响

在进样量不变的情况下,进样流速越大,则全部进样的时间越短。在保持进样量500 μ L不变的前提下,考察了进样流速对5种除草剂峰面积的影响。由图4可知,进样流速越大,5种除草剂的峰面积越小。这是因为进样流速越大,样品在整体柱上的作用时间越短,保留下降。当流速大于0.04 mL/min 时,5种除草剂的峰面积明显减小。当进样流速在0.02～0.04 mL/min 时,5种除草剂的峰面积变化不大,但由于低的流速造成进样时间过长,导致实验效率不高。因此,选用0.04 mL/min 作为进样流速。

图4

Fig. 4

图 4 进样流速的优化 Fig. 4 Optimization of sampling flow rate Separation conditions as Fig. 3. System operating parameters: the length of the microextraction monolithic column,20 cm; sampling time,25 min (0.02 mL/min),17 min (0.03 mL/min),13 min (0.04 mL/min),10 min (0.05 mL/min),9 min (0.06 mL/min); elution flow rate,0.02 mL/min; elution time,5 min.

2.3.3 进样时间的影响

在保持进样流速不变的前提下,实验考察了进样时间对5种除草剂的峰面积的影响。由图5可知,进样时间越长,5种除草剂的峰面积越大。这是因为进样时间越长,样品的进样量越多,当进样时间小于13 min时5种苯氧羧酸类除草剂的峰面积随进样时间的增长而增大且变化趋势较大,但在进样时间大于13 min后5种苯氧羧酸类除草剂的峰面积随时间的变化不明显。说明样品在进样13 min后已接近完全进样。因此,选用13 min作为进样时间。

图5

Fig. 5

图 5 进样时间的优化 Fig. 5 Optimization of sampling time Separation conditions as Fig. 3. System operating parameters: the length of the microextraction monolithic column,20 cm; sampling flow rate,0.04 mL/min; elution flow rate,0.02 mL/min; elution time,5 min.

2.3.4 洗脱流速的影响

为减少固相微萃取整体柱上所吸附杂质的洗脱并使联用系统更加稳定,本实验中以流动相作为洗脱液,洗脱富集在固相微萃取整体柱上的样品。在固定其他条件不变的情况下,考察了洗脱流速对5种除草剂的峰面积的影响。由图6可知:当流速小于0.02 mL/min 时,5种分析物质的峰面积随流速增大逐渐增大,这是由于洗脱液体积增加使得分析对象洗脱得更充分;当流速大于0.02 mL/min 时,5种分析物质的峰面积随流速增大有所下降,这可能是由于高的流速减少了洗脱液在固相微萃取整体柱上的作用时间,反而降低了洗脱能力。因此,选用的洗脱流速为0.02 mL/min。

图6

Fig. 6

图 6 洗脱流速的优化 Fig. 6 Optimization of elution flow rate Separation conditions as Fig. 3. System operating parameters: the length of the microextraction monolithic column,20 cm; sampling flow rate,0.04 mL/min; sampling time,13 min; elution time,5 min.

2.3.5 洗脱时间的影响

在固定其他条件不变的情况下,考察了洗脱时间对这5种除草剂峰面积的影响。由图7可知,在洗脱时间小于5 min时,5种除草剂的峰面积随洗脱时间的增长而增大;当洗脱时间大于5 min以后,5种除草剂的峰面积没有明显变化。这表明当洗脱时间为5 min时,样品已接近完全洗脱。因此,选用的洗脱时间为5 min。

图7

Fig. 7

图 7 洗脱时间的优化 Fig. 7 Optimization of elution time Separation conditions as Fig. 3. System operating parameters: the length of the microextraction monolithic column,20 cm; sampling flow rate,0.04 mL/min; sampling time,13 min; elution flow rate,0.02 mL/min.

通过以上考察,我们得到了in-tube SPME-HPLC联用系统最优运行条件:在线固相微萃取毛细管整体柱长度为20 cm,进样流速为0.04 mL/min,进样时间为13 min,洗脱流速为0.02 mL/min,洗脱时间为5 min。

利用in-tube SPME-HPLC联用系统,我们对水样中添加的5种苯氧羧酸类除草剂进行了同步富集检测,对联用系统检测与直接进样检测进行了比较、并考察了5种苯氧羧酸类除草剂in-tube SPME-HPLC联用检测方法的工作曲线、检出限、回收率和重现性。

2.4.1 联用系统检测与直接进样检测比较

在处理后的水样中添加相同浓度的标准品后,我们进行了联用系统检测与直接进样检测的分离情况对比的实验。从图8可以清晰地看出,直接进样检测时,样品溶剂峰干扰大,样品区带展宽明显,造成分离对象峰形拖尾不对称,峰高下降,部分检测对象分离度无法满足检测要求;采用in-tube SPME-HPLC联用系统检测时,溶剂峰显著下降,各分析对象峰形对称,分离度较好,可以满足分离检测要求。通过计算两种情况下检测对象的峰面积比值,5种苯氧羧酸类除草剂的富集倍数分别为:3倍(PPA)、27倍(2,2-CPPA)、27倍(2,3-CPPA)、21倍(2,4-D)和21倍(2,4-DP)。这说明相比直接进样,联用检测系统的检测灵敏度显著提高。

图8

Fig. 8

图 8 (a)直接进样检测与(b)联用系统检测的分离色谱图 Fig. 8 Chromatograms of (a) direct injection HPLC and (b) in-tube SPME-HPLC Experimental conditions: a. sample concentration,200 μ g/L; injection volume,500 μ L; separation conditions as Fig. 3. b. sample concentration,200 μ g/L; injection volume,500 μ L; separation conditions as Fig. 3. System operating parameters: the length of the microextraction monolithic column,20 cm; carrying flow rate,0.04 mL/min; carrying time,13 min; elution flow rate,0.02 mL/min; elution time,5 min. Peak identifications: 1. PPA; 2. 2,2-CPPA; 3. 2,3-CPPA; 4. 2,4-D; 5. 2,4-DP.

2.4.2 工作曲线与检出限

在最佳联用系统运行以及分离条件下,取不同浓度的空白加标水样进行工作曲线回归参数及检出限的测定。结果如表1所示:5种苯氧羧酸类除草剂在各自的线性范围内具有较好的线性相关性(R²＞0.99);以信噪比为3时对应的质量浓度作为检出限,5种苯氧羧酸类除草剂的检出限均在10 μ g/L 以下,符合国内外相关标准^{[3, 4]}的检测要求。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表 1 5种苯氧羧酸类除草剂的基质工作曲线与检出限 Table 1 Matrix calibration curves and LODs of the five phenoxy acid herbicides Analyte Calibration curve* R2 Linear range/ ( μ g/L) LOD* */ ( μ g/L) PPA Y=247.82X+846.05 0.9941 20-500 9 2,2-CPPA Y=663.49X+489.12 0.9954 10-600 4 2,3-CPPA Y=705.81X+426.00 0.9981 10-600 4 2,4-D Y=463.76X+619.53 0.9965 15-600 5 2,4-DP Y=453.59X+893.94 0.9981 15-600 5 * Y: peak area (mV×s); X: mass concentration ( μ g/L). * * S/N=3.

表 1 5种苯氧羧酸类除草剂的基质工作曲线与检出限 Table 1 Matrix calibration curves and LODs of the five phenoxy acid herbicides

2.4.3 回收率

在联用系统最优条件下,通过向空白水样中准确加入不同浓度的5种苯氧羧酸类除草剂标准溶液,之后对样品进行前处理,并利用联用系统进行检测,以表征方法的回收率(n=5)。表2给出了各加标浓度的回收率结果:5种苯氧羧酸类除草剂的回收率在79.0% ～98.0%之间,而相对标准偏差(RSD)≤3.9% 。本方法成功应用于这5种苯氧羧酸类除草剂的同步富集检测,获得较为满意的结果。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表 2 空白水样品中5种苯氧羧酸类除草剂的回收率(n=5) Table 2 Recoveries of the five phenoxy acid herbicides spiked in a blank water sample (n=5) Analyte Spiked/ ( μ g/L) Found/ ( μ g/L) Recovery/ % RSD/ % PPA 20 15.8 79.0 3.9 200 170.4 85.2 2.8 500 454.0 90.8 2.0 2,2-CPPA 20 18.0 90.0 2.7 200 187.2 93.6 1.9 500 478.0 95.6 1.2 2,3-CPPA 20 18.2 91.0 2.3 200 191.4 95.7 1.8 500 490.0 98.0 1.2 2,4-D 20 17.2 86.0 3.0 200 183.2 91.6 2.5 500 466.0 93.2 1.7 2,4-DP 20 17.4 87.0 2.9 200 185.0 92.5 2.2 500 470.0 94.0 1.5

表 2 空白水样品中5种苯氧羧酸类除草剂的回收率(n=5) Table 2 Recoveries of the five phenoxy acid herbicides spiked in a blank water sample (n=5)

对取自两个地区的水样进行了检测，结果发现，除了2,4-D，未发现其他4种除草剂残留；2,4-D的残留量分别为16.3 μ g/L (厚美村)和22.3 μ g/L (浦口村)。