色谱  2015, Vol. 33 Issue (8): 830-837   PDF (1346KB)    
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达晶
王钢力
曹进
张庆生
QuEChERS-液相色谱-串联质谱法测定植物性食品中30种氨基甲酸酯类农药残留
达晶, 王钢力 , 曹进 , 张庆生    
中国食品药品检定研究院, 北京 100050
收稿日期：2015-04-09
通讯作者：E-mail:duneer@163.com(王钢力);caojin@nicpbp.org.cn(曹进)
摘要：基于欧洲标准化委员会标准方法(EN 15662)对食品基质的分类,选择6种代表性植物性食品作为基质,系统优化了QuEChERS样品前处理方法;在此基础上,建立了30种氨基甲酸酯类农药的液相色谱-串联质谱分析方法。实验结果表明,除涕灭威砜的线性范围为2~100 μg/kg,其他29种氨基甲酸酯类农药的线性范围均为1~100 μg/kg;6种样品基质在3个添加水平(5、20、100 μg/kg)下的回收率为56.13%~127.6%,相对标准偏差为0.47%~16%;以信噪比(S/N)≥10计,30种农药的定量限(LOQ)为0.041~1.9 μg/kg。本文方法灵敏、有效,适用于植物性食品基质中30种氨基甲酸酯类农药残留的测定。
关键词： 液相色谱-串联质谱     QuEChERS     氨基甲酸酯类农药     植物性食品    
Determination of 30 carbamate pesticide residues in vegetative foods by QuEChERS-liquid chromatography-tandem mass spectrometry
DA Jing, WANG Gangli , CAO Jin , ZHANG Qingsheng    
National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China
Received: 2015-04-09
Abstract: Via the classification of vegetative foods in British Standard EN 15662, six representative food matrices were chosen in the current study. The QuEChERS method for each matrix was optimized. The 30 carbamate pesticide residues in the samples after pretreatment were determined by liquid chromatography-tandem mass spectrometry in positive ionization mode. According to the experimental results, the linear ranges were 1-100 μg/kg for aldicarb sulfone and 2-100 μg/kg for the others. The recoveries at three spiked levels of 5, 20 and 100 μg/kg in the six representative matrices were between 56.13% and 127.6%, with the RSDs between 0.47% and 16%. The limits of quantification (S/N≥10) were in the range of 0.041-1.9 μg/kg. In conclusion, this method provides a sensitive and efficient way suitable for the analysis of the 30 carbamate pesticide residues in vegetative foods.
Key words: liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)     QuEChERS     carbamate pesticides     vegetative foods    

随着有机氯农药受到禁用和抗有机磷杀虫剂的昆虫品种日益增多,氨基甲酸酯类农药的用量逐年增加,造成了该类农药在环境、农作物中的残留,各国均制定了氨基甲酸酯类农药的最大残留限量(MRLs)标准。由于氨基甲酸酯类农药的结构特性是氨基直接与甲酸酯的羰基相连,所以极性强,热稳定性差[1],需衍生化后才能在气相色谱(GC)上进行测定。液相色谱-三重四极杆串联质谱灵敏度高,抗干扰能力好,是当前痕量分析的首选方法[2, 3, 4, 5]。

食品基质复杂,农药残留量低,干扰因素多,主要残留成分不易分离、富集和纯化,因而相关农药检测不准确。样品前处理中目标物的提取、基质净化方法的选择与优化成为农药多残留检测的关键。2003年,Anastassiades和Lehotay提出了原创的QuEChERS方法；目前QuEChERS方法包括原创方法、美国分析化学家协会标准方法(AOAC 2007.01)和欧洲标准化委员会标准方法(EN 15662)[6]。

EN 15662方法根据植物性食品的性质将其分为酸性样品、含水样品(含水量≥80% )、含水量低样品(含水量＜80% )、干性样品(谷物)、含色素样品等。虽然QuEChERS样品前处理方法应用广泛,但是基于上述基质分类的系统性研究还较少。因此,本文按照该分类体系,根据不同植物性食品的基质特性系统地优化了QuEChERS方法。

本文选择酸性样品(柠檬,pH 3)、含水样品(苹果、白菜,含水量85% ～90% )、含水量低样品(香蕉,含水量70% )、谷物(大米,含水量≤10% )和含色素样品(菠菜,含叶绿素)共6种代表性基质,系统地探讨了QuEChERS方法对不同基质中氨基甲酸酯类农药残留提取的适用性,优化了提取-净化步骤中试剂的用量。依据《食品中农药最大残留限量》(GB 2763-2014),选择有最大残留限量标准和常用的氨基甲酸酯类农药及其活性代谢产物共30种,建立了这30种氨基甲酸酯类农药多残留的LC-MS/MS测定方法。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

1290 Infinity液相色谱仪-6460三重四极杆串联质谱仪(美国Agilent公司); Milli-Q纯水仪(美国Millipore公司); CF 16RX Ⅱ离心机(日本HITACHI公司); XHF-D高速分散器(宁波新芝生物科技股份有限公司); XP205分析天平(十万分之一)和AL204分析天平(万分之一)(瑞士Mettler公司)。

乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)吸附剂:粒径40～60 μ m (天津博纳艾杰尔科技有限公司);石墨化炭黑(GCB)和C18吸附剂:粒径40 μ m (美国Agilent公司);柠檬酸钠、NaCl为优级纯,无水MgSO4为分析纯(国药集团化学试剂有限公司);柠檬酸氢二钠为分析纯(东京化成工业株式会社)。甲醇、乙腈为色谱纯(美国ThermoFisher公司);甲酸为分析纯(美国Fluka公司)。实验用水为高纯水。灭害威、霜霉威、杀线威、抗蚜威、久效威砜、3-羟基克百威、二氧威、涕灭威、克百威、恶虫威、久效威、混杀威、仲丁威、苯氧威、茚虫威、丙硫克百威、呋线威、丁硫克百威农药对照品购自德国Dr. Ehrenstorfer公司;涕灭威亚砜、涕灭威砜、久效威亚砜、速灭威、残杀威、甲萘威、乙硫苯威、硫双威、异丙威、乙霉威、甲硫威、猛杀威农药对照品购自美国Sigma-Aldrich公司。分别以乙腈配制质量浓度为1 g/L 的各农药标准储备溶液,再以乙腈配制5 mg/L 的30种氨基甲酸酯类农药的混合标准溶液,-18 ℃保存。

基质匹配标准溶液:分别平行移取7份空白样品提取液2 mL于15 mL离心管中,以氮气(N2)缓缓吹干,分别加入2 mL质量浓度为1、2、5、10、20、50、100 μ g/L 的混合标准溶液,配制系列基质匹配对照溶液(现用现配),经0.22 μ m微孔膜过滤后供分析。

1.2 样品前处理方法
1.2.1 苹果、白菜样品

样品去土,切块后置于-18 ℃保存。用前匀浆,称取10.00 g均质样品于50 mL具塞离心管中,加入10 mL乙腈,剧烈振摇1 min。加入4 g无水MgSO4、1 g NaCl、1 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠,剧烈振摇1 min,8000 r/min 下离心5 min。取上层溶液6 mL于预先加有150 mg PSA和900 mg无水MgSO4的15 mL具塞离心管中,涡旋30 s,5000 r/min 下离心2 min。取4 mL上清液,加入40 μ L 5%(v/v)甲酸乙腈溶液。经0.22 μ m微孔滤膜过滤后供分析。

1.2.2 柠檬样品

样品切块后置于-18 ℃保存。用前匀浆,称取10.00 g均质样品于50 mL具塞离心管中,加入10 mL乙腈,剧烈振摇1 min。加入4 g无水MgSO4、1 g NaCl、1 g柠檬酸钠、0.5 g柠檬酸氢二钠和400 μ L 5 mol/L NaOH溶液,剧烈振摇1 min,8000 r/min 下离心5 min。取上层溶液6 mL于预先加有150 mg PSA和900 mg无水MgSO4的15 mL具塞离心管中,涡旋30 s,5000 r/min 下离心2 min。取4 mL上清液,加入40 μ L 5%(v/v)甲酸乙腈溶液。经0.22 μ m微孔滤膜过滤后供分析。

1.2.3 菠菜样品

样品去土,切段后置于-18 ℃保存。用前匀浆,称取10.00 g均质样品于50 mL具塞离心管中,加入10 mL乙腈,剧烈振摇1 min。加入4 g无水MgSO4、1 g NaCl、1 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠,剧烈振摇1 min,8000 r/min 下离心5 min。取上层溶液6 mL于预先加有150 mg PSA、81 mg GCB和900 mg无水MgSO4的15 mL具塞离心管中,涡旋30 s,5000 r/min 下离心2 min。取4 mL上清液,加入40 μ L 5%(v/v)甲酸乙腈溶液。经0.22 μ m微孔滤膜过滤后供分析。

1.2.4 香蕉样品

样品去皮,切块后置于-18 ℃保存。匀浆后称取5.00 g均质样品于50 mL具塞离心管中,加入5 mL乙腈、4 mL冰水,剧烈振摇1 min。加入2 g无水MgSO4、0.5 g NaCl、0.5 g柠檬酸钠和0.25 g柠檬酸氢二钠,剧烈振摇1 min,8000 r/min 下离心5 min。取上层溶液3 mL于预先加有75 mg PSA和450 mg无水MgSO4的15 mL具塞离心管中,涡旋30 s,5000 r/min 下离心2 min。取2 mL上清液,加入20 μ L 5%(v/v)甲酸乙腈溶液。经0.22 μ m微孔滤膜过滤后供分析。

1.2.5 大米样品

样品置于-18 ℃保存。粉碎后过20目筛,称取5.00 g于50 mL具塞离心管中,加入5 mL乙腈、10 mL冰水,剧烈振摇1 min。加入2 g无水MgSO4、0.5 g NaCl、0. 5 g柠檬酸钠和0.25 g柠檬酸氢二钠,剧烈振摇1 min,8000 r/min 下离心5 min。取上层溶液置于-18 ℃静置2 h,8000 r/min 下离心5 min。取3 mL上层溶液于预先加有75 mg PSA和450 mg无水MgSO4的15 mL具塞离心管中,涡旋30 s,5000 r/min 下离心2 min。取2 mL上清液,加入20 μ L 5%(v/v)甲酸乙腈溶液。经0.22 μ m微孔滤膜过滤后供分析。

1.3 LC-MS/MS条件

LC条件：资生堂TYPE MG Ⅲ色谱柱(150 mm×2.0 mm,5 μ m),柱温35 ℃,进样体积2 μ L;流速为0.3 mL/min。流动相:A相为0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相为0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液;梯度洗脱程序:0～3 min,35%B; 3～20 min,35%B～90%B; 20～25 min,90%B；后运行时间5 min。

MS条件：电喷雾离子(ESI)源正离子模式;干燥气温度330 ℃,流速8 L/min;雾化气压力20.7×104 Pa (30 psi);鞘气温度250 ℃,流速11 L/min;毛细管电压 3500 V。扫描方式:分段的多反应监测(MRM)模式。30种氨基甲酸酯类农药化合物提取离子色谱图见图1。

图 1 30种氨基甲酸酯类农药的提取离子色谱图 Fig. 1 Extracted ion chromatograms of the 30 carbamate pesticides
2 结果与讨论
2.1 LC-MS/MS条件的优化

在电喷雾离子源正离子模式下,先对各农药化合物的单标准溶液进行全扫描,获得稳定的母离子,SIM扫描模式优化碎裂电压(fragmentor);再进行子离子扫描,每个化合物选择2对响应值高的特征离子对作为定量、定性离子对,进一步优化碰撞能量(CE)。
优化结果见表1。

表 1 30种氨基甲酸酯类农药的LC-MS/MS分析参数 Table 1 LC-MS/MS parameters of the 30 carbamate pesticides

本文比较了美国Agilent公司的ZORBAX Eclipse XDB C18色谱柱和日本资生堂TYPE MG Ⅲ色谱柱,发现使用后者时先出峰的灭害威、霜霉威的分离度和峰形更佳,而且基线漂移更小,所以本文选择资生堂TYPE MG Ⅲ色谱柱。

比较了不同组成的流动相:NH4Ac (5 mmol/L)-乙腈、NH4Ac (5 mmol/L)-甲醇、0.1%(v/v)甲酸水溶液-0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液、0.1%(v/v)甲酸水溶液-0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液。结果表明:使用乙腈时,甲萘威峰形很差,30种农药的分离效果也不如有机相为甲醇时的效果好;0.1%(v/v)甲酸水溶液-0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液流动相体系配制更方便,且分离效果好,因此选择其作为流动相。

2.2 QuEChERS方法的优化
2.2.1 净化剂种类的选择

QuEChERS方法使用分散固相萃取(DSPE)净化,固相吸附剂直接加入样品提取液以吸附干扰物。PSA可吸附糖、有机酸、脂肪酸等极性干扰物;C18可吸附脂肪等非极性干扰物;GCB可吸附色素、甾醇等大分子非极性干扰物。但吸附剂对目标化合物的吸附也会导致回收率降低,影响测定结果的准确性[7]。

在吸附剂的选择上,以空白苹果基质提取液为例,按照本文方法分别加入PSA、PSA+C18和C18进行净化,考察不同吸附剂组合对基质的净化效果,结果表明3种净化剂组合方式均对基质有较好的净化作用。进一步考察不同吸附剂组合对30种氨基甲酸酯类农药的吸附作用,向10 μ g/L 的30种农药混合标准溶液中分别加入PSA、PSA+C18和C18吸附剂后测定其浓度变化,结果表明C18吸附剂对丙硫克百威和丁硫克百威有很强的吸附作用,二者浓度分别下降了90%和85%(见图2)。因此本文最终确定使用PSA作为吸附剂。

图 2 吸附剂的种类对丙硫克百威和丁硫克百威吸附效果的影响 Fig. 2 Effect of sorbent composition on the adsorption of benfuracarb and carbosulfan

大米等稻谷样品中含有少量脂肪,可能会干扰测定。文献[8]中常使用C18吸附剂去除脂肪。本文方法是将大米样品提取液于-18 ℃静置2 h以去除少量脂肪,实验结果表明,该方法既能有效去除脂肪对测定的干扰,又能避免C18吸附剂造成部分农药的回收率降低[9]。

2.2.2 净化剂的用量

考察了PSA吸附剂用量对空白样品基质提取液净化效果的影响,发现当PSA用量达到25 g/L 时,即可显著减少干扰峰的影响,继续增加用量时净化效果未有明显改善。进一步考察PSA吸附剂用量对30种农药的吸附作用,结果表明,随着PSA用量由20 g/L 增加至35 g/L,灭害威、抗蚜威、二氧威、茚虫威、丙硫克百威、呋线威6种农药的回收率均下降10%以上(见图3)。

图 3 PSA吸附剂的用量对部分农药的吸附作用 Fig. 3 Effect of the amount of PSA sorbent on some pesticide adsorption

考察了GCB吸附剂用量对深色蔬菜菠菜空白基质提取液净化效果的影响,当GCB用量由9.5 g/L 增加至13.5 g/L 时,提取液由深绿色逐渐转变为浅黄色,继续增加用量未见明显改善。进一步考察GCB吸附剂用量对30种农药的吸附作用,结果表明,当GCB用量由9.5 g/L 增加至17.5 g/L 时,乙硫苯威、乙霉威的回收率分别下降19% 、23% 。

可见,吸附剂对部分农药有明显的吸附作用,因此在消除基质干扰的前提下要尽量降低吸附剂的用量。本文最终确定提取液中PSA吸附剂加入量为25 g/L,深色蔬菜提取液中再加入GCB 40.5 g/L。

2.2.3 柠檬样品中碱的加入量

氨基甲酸酯类农药的结构特性是氨基直接与甲酸酯的羰基相连,因此部分此类农药在酸性或碱性条件下会发生水解,如二氧威在酸性条件下不稳定,乙硫苯威在强酸、强碱条件下水解为沙蚕毒素,硫双威在酸性条件下缓慢水解。柠檬样品的pH＜3,对酸不稳定的农药会在其提取液中加速水解,影响测定的准确性。因此应用QuEChERS方法进行提取时,往往加入一定量的5 mol/L NaOH溶液以保持提取液的pH值在5左右。

考察5 mol/L NaOH溶液的用量对30种氨基 甲酸酯类农药回收率的影响(见图4)。 6 mL样品 提取液中加入5 mol/L NaOH溶液,加入量从200 μ L增加到800μL时,硫双威回收率先由40.10%升至66.98%后略有下降,二氧威、恶虫威、甲萘威和乙硫苯威等回收率逐渐降低。因此,本文最终选择每6 mL样品提取液中加入5 mol/L NaOH溶液400 μ L。

图 4 NaOH溶液(5 mol/L)体积与回收率在 70% ～120%之间的农药数量的关系 Fig. 4 Relationship between the volume of NaOH solution (5 mol/L) and the number of pesticides with recoveries in the range of 70% -120%
2.3 基质效应

基质效应会对分析方法的重复性、灵敏度、准确度等产生影响,在使用ESI源时更为突出,主要表现为对目标化合物的离子抑制作用[10]。基质效应=基质匹配校准曲线的斜率/溶剂标准校准曲线的斜率[11],比值越接近1,则基质效应越小,反之亦然。6种样品的基质效应见表2。实验结果表明,菠菜的基质效应最大,柠檬次之。灭害威、丁硫克百威的基质效应最为明显。常采用配制基质匹配标准曲线、加入分析保护剂、盐析等方法降低基质效应的影响。本文使用基质匹配标准曲线的方法。

表 2 30种氨基甲酸酯类农药在6种基质中的基质效应 Table 2 Matrix effects of the 30 carbamate pesticides in the six matrices
2.4 方法学评价
2.4.1 标准曲线与检出限

依据《食品中农药最大残留限量》(GB 2763-2014)对30种目标氨基甲酸酯类农药最大残留量的限定范围(50～5000 μ g/kg),选择比MRLs值高一个数量级、低一个数量级和同一个数量级的3个浓度水平进行考察[12],同时结合各农药的响应值和仪器的饱和效应,分别配制了1、2、5、10、20、50、100、200 μ g/L 的基质匹配混合标准溶液。各农药化合物在1～100 μ g/L(相当于1～100 μ g/kg)范围内线性关系良好;在1～200 μ g/L 范围内,灭害威、霜霉威等17种农药化合物的线性很差,用二次曲线方程拟合可得到较好的相关系数(见图5),这可能是因为检测器或离子源出现了饱和效应[13]。考虑到用二次曲线方程定量准确度不高,且样品浓度过高时色谱峰形也会变差,故将线性曲线最大质量浓度定为100 μ g/L,农药残留量更高的样品需稀释后进行测定,6种植物性样品中的基质匹配曲线的线性相关系数均大于0.998。以3倍信噪比和10倍信噪比确定各农药化合物在6种植物性样品基质中的检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别为0.02～0.36 μ g/kg 和0.06～1.9 μ g/kg,均小于国内外残留限量要求。各目标化合物在菠菜基质中的线性范围、相关系数、LOD和LOQ见表3。

图 5 灭害威在不同质量浓度范围内的标准曲线 Fig. 5 Standard equations of aminocarb in different mass concentration ranges a. linearity fitting (1-100 μ g/L); b. linearity fitting (1-200 μ g/L); c. conic fitting (1-200 μ g/L).

表 3 30种氨基甲酸酯类农药在菠菜基质中的线性关系、LOD和LOQ Table 3 Linear relationships,LODs and LOQs of the 30 carbamate pesticides in spinach matrix
2.4.2 精密度与加标回收率

在香蕉、柠檬、苹果、白菜、菠菜和大米6种空白样品中进行3个水平的加标回收试验,添加量分别为5、20、100 μ g/kg,每个水平进行6次平行实验,基质匹配标准曲线定量。 实验结果表明,香蕉基质中低、中、高3个水平的回收率分别为59.84% ～127.6% 、60.08% ～114.6% 、56.13% ～110.5% ,RSD为1.1% ～15% ;柠檬基质中低、中、高3个水平的回收率分别为62.05% ～91.61% 、69.33% ～98.94% 、71.83% ～107.2% ,RSD为0.47% ～9.3% ;苹果基质中低、中、高3个水平的回收率分别为74.78% ～106.3% 、60.51% ～125.2% 、75.40% ～117.6% ,RSD为3.1% ～16% ;白菜基质中低、中、高3个水平的回收率分别为68.62% ～103.0% 、69.81% ～99.31% 、67.62% ～112.3% ,RSD为1.2% ～13% ;菠菜基质中低、中、高3个水平的回收率分别为71.11% ～115.3% 、77.45% ～125.3% 、57.36% ～103.2% ,RSD为3.2% ～14% ;大米基质中低、中、高3个水平的回收率分别为85.70% ～106.0% 、67.31% ～108.3% 、70.70% ～97.61% ,RSD为0.70% ～8.5% 。

2.5 实际样品的测定

采用本方法对7批菠菜、8批苹果、5批白菜、5批香蕉、3批大米和3批柠檬进行测定。筛查出霜霉威、抗蚜威、苯氧威分别在菠菜、苹果和白菜样品中有残留(见表4),但均未超出国家MRLs值。

表 4 实际样品筛查与定量结果 Table 4 Screening and quantification results of different samples
3 结论

本文选择了6种代表性的植物样品基质,系统性优化了QuEChERS方法,针对不同样品的性质选择净化剂的种类、用量和其他试剂的用量;考察了基质效应,通过配制基质匹配标准曲线降低基质效应影响,提高方法的回收率及重现性。在此基础上建立了6种代表性样品中30种氨基甲酸酯类农药残留的LC-MS/MS测定方法。该方法有效、灵敏,适用于植物性样品中30种氨基甲酸酯类农药残留的定性定量分析。

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