UPLC-TQ-S超高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪(美国Waters公司); Milli-Q纯水仪(美国Millipore公司);高速冷冻离心机(美国Sigma公司);电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

苯乙醇胺A(phenethylamine A)、沙丁胺醇(salbutamol)、沙美特罗(salmeterol)、克伦特罗(clenbuterol)、莱克多巴胺(ractopamine)、d₆-沙丁胺醇(d₆-salbutamol)、d₅-莱克多巴胺(d₅-ractopamine)、d₆-克伦特罗(d₆-clenbuterol)、d₃-沙美特罗(d₃-salmeterol)、d₃-苯乙醇胺A(d₃-phenethylamine A)均购自Dr. Ehrenstorfer GmbH;纯度均高于98.0% 。β -盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(30 ku/60 ku)购自默克公司; MIP Beta-Receptors固相萃取柱(25 mg/10 mL)购自美国SUPELCO公司。

标准储备液的配制:准确称取25 mg的上述标准品,用甲醇溶解在25 mL容量瓶中,配制成 1000 μ g/kg 的标准储备液,于-18 ℃保存。

乙酸-乙酸钠缓冲液的配制:称取43.0 g乙酸钠,加入22 mL乙酸,用水溶解并定容到 1000 mL,用乙酸调节pH到5.2。

样品的酶解：准确量取动物性食品样品2 g,置于离心管内,加入1 mg/L 的同位素标准溶液20 μ L,涡旋混匀,加入10 mL 0.2 mol/L 乙酸铵缓冲液(pH 5.2)和100 μ L β -葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶,于55 ℃酶解2 h。酶解液放至室温后,用0.1 mol/L 的NaOH溶液调pH至7.0左右,涡旋后于0 ℃、10000 r/min 下离心10 min,将上清液转入50 mL离心管中,待净化。

样品的净化：MIP柱依次用6 mL乙腈、1 mL水活化,然后提取液上MIP柱,弃去流出液;用3 mL水淋洗,抽真空使柱中的溶液全部流出;再用1 mL乙腈、3 mL 60%(v/v)乙腈水溶液淋洗,抽真空使柱中的溶液全部流出;用2 mL 1%(v/v)甲酸乙腈溶液洗脱,收集洗脱液,浓缩至近干,以流动相复溶后过0.22 μ m的有机滤膜,待LC-MS测定。

色谱柱:Waters ACQUITY UPLC HSS C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μ m);流动相:0.1%(v/v)甲酸水溶液(B)/甲醇(A)。梯度洗脱: 0～7.0 min,15%A～50%A; 7.0～10 min,50%A～99%A; 10～13 min,99%A; 13.1～16 min,15%A。恒定流速:0.30 mL/min;柱温:40 ℃;进样量:10 μ L。

电喷雾离子源正离子(ESI⁺)模式;毛细管电压:2.59 kV;离子源温度:150 ℃;去溶剂气温度:350 ℃;去溶剂气流量:800 L/h;锥孔气流量:150 L/h;多反应监测模式。10种β₂-受体激动剂的质谱分析参数见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表 1 10种化合物的质谱参数 Table 1 MS parameters for the ten compounds No. Compound Retention time/min Parent ion (m/z) Daughter ion (m/z) Cone voltage/V Collision energy/eV 1 clenbuterol 5.17 277 203* 46 22 259 46 14 2 d6-clenbuterol 5.15 283 265* 32 14 3 ractopamine 4.59 302 164* 8 20 284 8 16 4 d5-ractopamine 4.57 307 167* 24 22 5 salbutamol 1.89 240 148* 28 24 222 28 14 6 d6-salbutamol 1.86 246 228* 28 14 7 salmeterol 9.50 416 398* 32 22 380 32 26 8 d3-salmeterol 9.50 419 387* 18 10 9 phenethylamine A 8.15 345 327* 14 18 118 14 42 10 d3-phenethylamine A 8.13 348 330* 32 18 * Quantitative ion.

表 1 10种化合物的质谱参数 Table 1 MS parameters for the ten compounds

采用超高效液相色谱-串联四极杆质谱分别对5种β₂-受体激动剂进行多反应监测扫描,以两对母离子-子离子、保留时间等对这些化合物进行定性、定量。

由于电喷雾质谱的电离是在溶液状态下的电 离,因此流动相的组成和添加剂除了影响分析物的保留时间和峰形外,还会影响分析物的离子化效率,从而影响目标化合物的检测灵敏度。本实验分别采用甲醇、乙腈、甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液作为流动相,考察了流动相组成对各化合物响应值的影响,结果表明甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液作为流动相时的峰形明显改善,因此以甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液为流动相。最终得到的5种β₂-受体激动剂的总离子流图(total ion chromatogram,TIC)(见图1)。

图1

Fig. 1

图 1 5种化合物的总离子流色谱图 Fig. 1 Total ion chromatograms (TIC) of the five compounds Peaks: 1. salbutamol; 2. clenbuterol; 3. ractopamine; 4. phenylethanolamine A; 5. salmeterol.

食品中β₂-受体激动剂检测中前处理方法的关键是选择提取效率好的提取溶剂,以及合理的净化方案,减少目标化合物在样品前处理过程中的损失。王培龙等^[10]、胡艳云等^[16]已经对提取溶液进行了很好的研究,本文就酶解条件、净化方式等条件进行了优化。

2.2.1 酶解条件的选择

β₂-受体激动剂在动物体内代谢过程中,多数会与硫酸酯蛋白和葡萄糖醛酸作用,最终以硫酸轭合物和葡萄糖醛酸轭合物等结合态形式存在,需要将其转化为游离态进行检测,因此采用β -葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶对样品进行酶解。参考Damasceno等^[17]、杨光等^[18]对β -葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶的活性研究,本文比较了55 ℃下酶解2 h和37 ℃下酶解16 h的效果。结果如图2所示,因此选择55 ℃下酶解2 h。在保证效率和回收率的前提下,本方法与王培龙等^[10]、胡艳云等^[16]方法以及国家标准^[6]等酶解方法相比,提高了工作效率。

图2

Fig.2

图 2 酶解条件对5种 β2-受体激动剂回收率的影响 Fig. 2 Effect of enzyme conditions on the recoveries of the five β2-agonists

2.2.2 净化条件的优化

实验过程中发现,直接用提取剂提取而不净化时,提取溶液中样品基质干扰物质多,基质效应比较强,同时对色谱柱和仪器的损坏较大。样品基质中主要是大分子蛋白质和脂肪,另外也有小分子的碳水化合物等。实验比较了HLB柱(Waters,6 mL/150 mg,30 μ m)、MCX柱(Waters,6 mL/150 mg,30 μ m)、MIP柱和DisQuE净化管(Waters,15 mL,150 mg PSA、150 mg C18、900 mg MgSO₄),以回收率评价提取效果。如图3所示,对于DisQuE 净化管、MCX柱、C18柱,由于目标化合物的种类多,

图3

Fig.3

图 3 不同净化条件下5种 β2-受体激动剂的平均回收率 Fig. 3 Average recoveries under different purification conditions for the five β2-agonists

极性差异比较大,化合物的保留效果差,损失较大,净化效果不理想;MIP柱作为相对比较专一的交换柱,能够特异性地保留目标化合物,采用低温环境净化(-4 ℃)和强酸条件也能起到沉淀蛋白质和脂肪的净化作用。所以选择MIP固相萃取柱。

利用上述方法对不同地区大型超市和市场购买的50份猪肉进行分析,只检出一份猪肉样品中含有0.13 μ g/kg 克伦特罗(见图4)。

图4

Fig. 4

图 4 阳性样品的色谱图 Fig. 4 Chromatogram of a positive sample