高效液相色谱法是目前发展最快、应用最广泛的分离分析技术之一,在药物分析、生命科学、环境监测等领域发挥着越来越重要的作用[1]。色谱填料作为液相色谱分离的核心之一,其性能特点直接影响分离分析的最终结果。面对复杂样品,尤其是药物提取液、多肽、蛋白质等样品的分析需求,单一机理的色谱固定相已经难以满足复杂样品的分离分析要求。虽然多维色谱技术能够满足人们对分辨率的要求,但多维色谱系统存在着操作复杂、设备昂贵、流动相兼容性差等问题[2, 3, 4]。混合色谱固定相在分离样品时能够提供多重保留机理,同时可以通过改变流动相中有机相与水相的比例、pH值的高低、盐浓度的大小等多种方法改变分离选择性,与单一机理的色谱固定相相比,混合色谱固定相选择性好[5]、载样量高[6, 7],还可以降低分析成本,提高分析效率[8]。目前混合模式色谱固定相在多肽、蛋白质[9]、药物分子[10, 11]、无机离子[12]等复杂样品分离中表现出比传统色谱固定相更好的分离选择性。本文对混合模式色谱进行简要概述,着重介绍反相/离子交换、反相/亲水、亲水/离子交换、两性离子交换及三相混合固定相的研究进展及应用,并对混合模式色谱及固定相的发展前景进行了展望。
混合模式色谱是指在固定相与样品之间能实现多重相互作用的一种色谱模式[13]。混合模式色谱并不是一个全新的概念,在单一模式的色谱分析中往往也存在着多种分离机理,如静电效应存在于反相色谱中、疏水作用存在于离子交换色谱中[14, 15]。这些附加的作用力虽然较弱,但也是导致峰形拖尾的原因。在早期的研究中,科研人员极力消除这种附加作用力带来的影响[16, 17]。然而,随着生命科学等学科的发展,面对极其复杂样品的分离分析,人们逐渐认识到色谱分离过程中附加作用力在分离复杂样品时起到的积极作用。混合模式色谱中多种相互作用同时存在,可以通过选择合适的色谱方法使样品在一次分离中存在多种作用力,从而获得更好的分离选择性。
混合模式色谱的类型可以分为3类:(1)串联两根或多根具有不同分离机理的色谱柱,通过不同的接口连接,即多维色谱;(2)将两种或两种以上具有不同分离机理的固定相装填在一根色谱柱中[18, 19, 20]; (3)在固定相表面键合具有不同分离机理的官能团,将其装填在色谱柱中。其优缺点见表1。
第3种类型的混合模式色谱固定相以其相对低廉的设备要求、高效的选择性和良好的装填重复性等优点,成为目前研究的热点[21, 22, 23, 24, 25, 26]。混合模式色谱固定相多将两种具有正交性质的官能团键合到硅胶表面,从而达到最佳的分离选择性。目前,已有研究报道的混合模式色谱固定相包括:反相/离子交换混合固定相[27, 28, 29, 30, 31, 32]、反相/亲水混合固定相[33, 34, 35, 36, 37]、亲水/离子交换混合固定相[38, 39, 40]、两性离子交换混合固定相[41, 42, 43]以及三相混合固定相[44, 45, 46, 47, 48]。表2列举了最近5年来出现的部分混合模式色谱固定相的键合官能团信息、分离模式及应用领域。
反相色谱是目前应用最广泛的一种色谱模式,能实现70%以上化合物的分离,但对大多数极性和离子化合物的分离效果较差。反相色谱与离子交换色谱的组合在多维液相色谱系统中比较常见[52, 53, 54, 55],其分离条件易于保持样品的生物活性,因此多用在生物样品的分离分析中。反相/离子交换色谱固定相是在硅胶填料表面同时键合具有疏水性质的碳链和具有离子交换性质的阴离子或阳离子,将疏水作用与静电作用相结合,使这两种具有正交性质的分离机理融合在单次分离中,从而获得更好的分离选择性。
1986年,Regnier等[56]用合成的阴离子交换固定相分离蛋白质,结果表明对蛋白质的分离呈现疏水和离子交换双重作用机理。1995年,Walshe等[18]将强阳离子交换填料与反相色谱填料装填在一根色谱柱中,并以碱性物质为探针研究了其保留机理。1999年,Link等[57]也使用同样的混合固定相色谱柱结合串联质谱分离检测蛋白质。2000年,Hayes等[58]首次利用含C18基团、季氨基团的硅烷试剂与四甲氧基硅烷经溶胶-凝胶法制备含有C18及季氨基正离子的杂化整体柱,并对材料的形成机理进行了阐述。2009年,Geng等[8]使用反相/弱阳离子交换的混合色谱柱快速分离蛋白质,其分离结果优于单一的弱阳离子色谱柱或反相色谱柱。2012年,Liang等[50]利用极性共聚的方法将具有疏水性的C18基团与带正电荷的季氨基团平行键合到硅胶表面,合成了一种反相/强阴离子混合固定相(见图1a)。该色谱固定相能与100%亲水性流动相兼容,在10 mmol/L、pH=3的醋酸铵流动相条件下分离胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶3种物质,分离结果重复性良好。使用这种混合固定相制备SPE柱,对马兜铃酸能起到很好的富集作用,这为提取和分离马兜铃酸提供了一种方便快捷的方法。同年,Liu等[49]发展了一种类似的反相/阴离子交换色谱固定相,不同点在于该固定相中带正电荷的季氨基内嵌于疏水链中(见图1b)。用该色谱固定相分离果皮中的生物碱类物质,生物碱在8 min内出峰,其他酸性和中性物质在混合色谱柱中比碱性物质保留更强,最后通过质谱共鉴定出22种生物碱。
2013年,彭西甜等[59]采用一种简单的“混合配体”的方法将辛基和磺酸基以平行的方式键合到硅胶表面(见图1c),制备了共同键合辛基和磺酸基的反相/强阳离子交换混合固定相,并在反相色谱流动相条件下,使用几种碱性样品作为探针,研究混合色谱固定相的保留机理。结果表明两点保留机理更加符合混合色谱固定相,可根据两点保留机理的公式分别得出单一的疏水或离子交换作用力对样品保留的影响,为混合色谱固定相的机理研究提供了重要的参考。按照同样的思路,彭西甜等[60]又通过点击化学的方法将辛基和羧基平行键合到硅胶表面,合成了一种反相/弱阳离子交换混合固定相(见图1d)。由于羧酸是一种弱酸,在低pH值时羧基不电离,则此时混合模式色谱固定相主要以疏水作用为主;在高pH值时羧基电离带负电荷,此时的保留作用是疏水和静电作用的结合,使分析物的保留行为更容易得到调节。采用此固定相对3种阳离子表面活性剂、6种抗抑郁药及7种碱性溶质分子进行分离,均取得了良好的分离效果。同年,Song等[51]合成了一种适合于蛋白质分离的新型反相/弱阳离子色谱固定相(见图1e),即先使用环氧硅烷作为偶联剂将聚乙二醇400键合到硅胶表面,然后再将琥珀酸酐连接到聚乙二醇400上。研究发现该混合固定相在分离蛋白质过程中出现一个特殊现象,即随着流动相中盐浓度的增加,蛋白质的保留时间呈现“U”形曲线。产生这种现象的原因是在不同盐浓度的流动相中混合固定相呈现不同的保留机理。该现象在其他文献中鲜有报道。该混合固定相色谱柱可以取代由弱阳离子色谱和疏水色谱组成的二维色谱系统,为单柱二维色谱的发展提供了重要参考,对蛋白质组学的研究具有重要的意义。
亲水作用色谱是一种以极性填料为固定相,以高比例极性有机溶剂和低比例水溶液为流动相的色谱模式。1990年,Alpert[61]首次提出了亲水性色谱概念,为强极性化合物的分离分析提供了很好的选择,已成为色谱科学研究的热点之一[62, 63]。经典的反相色谱在疏水性化合物的分离中具有较大优势,但在分离极性化合物时常常存在一定的局限性。现代分离工作中,样品常常是复杂的极性与非极性的混合物,这两种模式的组合为这些混合物的分离提供了帮助。
黄晓佳等[64]在国内首次合成了内嵌酰胺键的极性基团混合色谱填料,当pH在2.5～7.5之间时稳定性良好。由于内嵌极性基团有效地屏蔽了硅羟基与碱性物质的相互作用,在分离碱性化合物时可以获得良好的峰形。Liu等[35]发展了一种疏水链的末端带有两个羟基的色谱固定相(见图2a)。该固定相在高比例有机相流动相中表现出亲水色谱模式,在低比例有机相流动相中表现出疏水色谱模式,成功地分离了5种不同聚合度的聚乙二醇。Guo等[36]通过点击化学的方法将寡聚乙二醇键合到硅胶表面(见图2b)。寡聚乙二醇分子链中内嵌多个氧原子并且末端的羟基为该固定相提供了一定的亲水性。Xie等[65]通过在甲基丙烯酸十八酯中加入亲水性单体甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯,热聚合后得到一种具有亲水性的新型C18填料,采用该填料制备SPE柱用于富集水中的酚类化合物。与传统的C18富集材料相比,改性后的C18填料对酚类的富集效果更好。Zhang等[34]使用硅胶先后与氨丙基三甲氧基硅烷及葡萄酸内酯反应制备了一种多羟基化合物键合的新型反相/亲水混合固定相,并以6种强极性中药组分作为探针研究其机理。当流动相中有机相的比例在0～100%内变化时,溶质的保留呈“U”形曲线,证明此种混合固定相属于典型的反相/亲水色谱混合模式。Aral等[37]报道了一种将含氮基团与苯基相结合的反相/亲水色谱固定相(见图2c),研究表明该固定相既可以在亲水模式下分离核苷类化合物,也可以在疏水模式下分离酚类化合物,并成功分离了9种核苷类混合物、11种植物激素和7种酚类化合物。武晓玉等[66]报道了一种同时兼具分离和富集功能的填料,通过对该填料的外表面进行亲水性修饰,使其外表面与生物样品中的大分子不发生不可逆变形或吸附,因而大分子洗脱时间接近死时间；对其内表面进行疏水修饰,使小分子分析物可以进入填料内孔,通过疏水作用被保留,使其对生物样品具有很好的初级分离效果。
大多数生物样品都具有一定的极性和亲水性,例如多肽样品具有亲水性的同时还带有电荷,在分离过程中将亲水和静电作用相结合能够极大地改善分离效果。1998年,Mant等[67]报道了亲水性阳离子色谱柱在环形多肽样品分离中的应用。2001年,Olsen[68]报道了亲水性阴离子柱在分离小分子药物上存在的优势。2003年,Hartmann等[69]比较了亲水性阳离子柱与反相柱在分离两性螺旋状多肽时的差异,结果显示两者呈现完全不同的选择性,且对温度变化非常敏感。同年,付红靖等[70]发展了亲水性强阳离子毛细管柱,考察了该柱的亲水/强阳离子交换保留机制,并成功分离了9种两性化合物肽和8种结构差别微小的吡啶化合物。2006年,Ye等[71]通过在硅胶表面键合可电离的极性基团,即利用3-氨基丙基三甲氧基硅烷修饰硅胶基质固定相,制备了一种具有亲水性弱阴离子交换混合模式的色谱柱。2009年,Lin等[72]制备了亲水性阴离子交换毛细管整体柱,其在分离多肽、酸碱混合物等极性样品时有很好的选择性,并在分离碱性样品时不会出现峰拖尾的现象。
近年来有关亲水性离子交换色谱固定相的保留机理也是研究的热点之一。2012年,Dong等[39]研究发现弱阳离子柱存在亲水性与离子交换的混合机理,为了更好地理解其保留机理,具体研究了流动相中有机相的比例、盐浓度的大小对保留行为的影响,结果进一步证明了混合保留机理的存在,最后利用弱阳离子柱分别在亲水模式、离子交换模式和二者的混合模式下对5种壳聚糖进行了分离,并从保留时间、分离度、不对称度等方面对分离结果进行了比较,发现混合模式下的分离结果更好。2013年,Xu等[40]合成了一种同时含有伯氨基和叔氨基的混合固定相(见图3),分别使用核苷化合物、磺胺类化合物和喹诺酮类化合物为探针研究其保留机理,结果表明该混合固定相色谱柱存在亲水、离子交换的保留机理。同时还研究了流动相的pH和离子强度对保留的影响,最后成功地分离了5种核苷类和7种磺胺类化合物。该混合固定相对多肽、蛋白质等复杂样品的分离具有重要的应用价值。
离子交换色谱是使用静电作用对样品实现分离的一种色谱模式。常见的离子交换色谱有4类,即表面键合磺酸基的强阳离子色谱、键合羧基的弱阳离子色谱、键合季氨基的强阴离子色谱和键合氨基的弱阴离子色谱。单一机理的离子交换色谱仅对阴阳离子中的某一种离子有保留作用,分离选择性受到很大限制。两性离子交换固定相是指表面同时键合带有正负电荷基团的固定相,此固定相可以很好地分离离子化合物和极性化合物[73]。最早合成的两性离子固定相是将季铵盐离子和磺酸根离子通过烷基链连接而成,带负电荷的磺酸基位于固定相外部,带正电荷的季铵盐离子位于固定相内部,整个固定相表面带有微弱的负电荷。该固定相已被广泛应用于分离硫代葡萄糖苷、多肽、代谢物等复杂样品。随后,Jiang等[74]合成了一种所带的电荷顺序与上述固定相相反的两性离子固定相,即负电荷位于固定相内部、正电荷位于固定相表面,结果表明该固定相表面仍显示微弱的电负性,证明了固定相表面所示电性与表面电荷分布无直接关系。由于离子交换色谱的分辨率较反相色谱低,在分离复杂样品时分辨率往往达不到要求,但离子交换色谱与反相色谱完全正交,这为阴阳离子混合色谱的应用开辟了方向。Shen等[41]报道了一种半胱氨酸键合硅胶固定相(见图4),由于氨基酸是一种两性化合物,在不同的pH条件下带有不同程度的正负电荷,使用该色谱柱与C18柱组成的二维色谱系统在分离蛋白质的水解产物中正交性高达88% 。Liang等[42]通过水平聚合的方法将烯基硅烷键合到硅胶表面,然后与带巯基的两性离子化合物通过巯基点击反应制备出两性离子固定相,将该固定相用于多肽、果寡糖、生物碱的分离,均取得很好的分离效果。
Qiu等[43]将带正电荷的咪唑鎓盐与末端带有磺酸基的碳链键合到硅胶表面,合成了一种两性离子交换混合固定相,研究表明该固定相对阴离子、碱性化合物、维生素和3种咪唑鎓盐离子液体均具有 较好的分离效果。Boersema等[75]使用两性离子交换混合固定相分离复杂的多肽混合物,表现出了静电和极性两种相互作用;由于离子交换基团的存在,当pH从3到8变化时,分离结果发生了显著变化。以上研究表明,多肽类生物样品带有一定的电荷,在该混合固定相上的分离主要受静电作用的影响,而流动相的pH值是调节静电作用的重要参数,这也为带电样品在该混合固定相上的分离提供了重要的参考。
由于分析物的复杂性和多样性,要在一次分析中同时分离疏水性相近的酸性、碱性、中性的混合物,需要固定相同时具有阴阳离子交换和疏水的混合保留机理。
Liu等[44, 45]采用静电驱动自组装法制备了一种集反相、阴离子、阳离子为一体的三相混合固定相,该填料内部键合的基团提供疏水和阴离子交换保留机理,外部提供阳离子交换保留机理,该设计确保了反相、阴阳离子交换能同时发挥作用。对离子化合物的分离表明,分离结果受流动相中有机相比例、pH值、离子强度的影响,而对中性化合物的分离主要受流动相中有机相的影响。他们应用该混合固定相色谱柱成功分离了含酸碱、阴阳离子的10种混合物。Kazarian等[31]也研究了结构相似的3种反相阴阳离子三相混合模式色谱固定相的保留机理,对强酸、弱酸、强碱、弱碱以及两性化合物在混合固定相色谱柱上的保留行为随流动相pH变化的趋势进行了研究,并将3根色谱柱的分离结果作了对比分析,为其应用和方法开发指明了方向。
2014年,Li等[48]合成了一种全新树枝状聚合物改性的反相亲水性阴离子交换混合固定相(见图5),该固定相结合了苯环、季氨基阳离子和多个羟基,能提供亲水、疏水和阴离子交换3种保留机理,通过分离一系列的标准品分别验证了混合色谱填料的各保留机理以及反相离子交换、亲水离子交换的混合保留机理。该固定相在分离多肽蛋白质方面具有较好的应用前景。
近年来,随着复杂样品分析需求的增加,混合模式色谱固定相已经受到越来越多的关注。与单一机理的色谱固定相相比,混合固定相具有高选择性、高负载量等优点;与多维色谱相比,混合固定相对设备要求低、操作简单。但由于多重分离机理的存在,要合理调控与分配不同的机理较为困难,导致混合固定相色谱柱的分离结果的重复性往往较差。
此外,有关混合模式固定相及色谱柱评价的标准尚未统一,继续深入考察不同样品在混合固定相色谱柱上的保留机理,总结其保留规律,形成不同类型混合固定相色谱柱的相对统一的评价方法,对混合固定相及色谱柱的制备与应用具有重要的意义。
混合模式固定相及色谱柱在复杂样品分析领域具有广阔的市场和应用前景,随着对其保留机理、应用分析及评价方法的深入研究,混合固定相色谱会在分离分析工作中发挥越来越重要的作用。
2015, Vol. 33 Issue (11): 1140-1146
PDF (918 KB)
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