TSQ Quantum Ultra EMR液相色谱-串联质谱仪,配有电喷雾离子源(美国Thermo Fisher公司); AEL200分析天平,感量0.1 mg(日本岛津公司); KDC-140HR离心机,配有2 mL、8 mL转头(安徽中科中佳科学仪器有限公司); Milli-Q高纯水发生器(美国Millipore公司); FW135粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)。

氯噻啉标准样品购自上海安谱实验科技股份有限公司(CAS 105843-36-5,纯度≥96% );乙腈(色谱纯)和甲酸(质谱级)购自美国Thermo Fisher公司;氯化钠和无水硫酸镁(分析纯)购自天津大茂化学试剂厂;PSA(N-丙基乙二胺,primary secondary amine)吸附剂(40～60 μ m)、ODS C₁₈吸附剂(50 μ m,6 nm)和GCB吸附剂(石墨化炭黑,graphitized carbon black,120～400目)购自天津博纳艾杰尔科技有限公司。茶叶样品均购于北京市内的超市、茶叶店和茶叶生产厂,产地涵盖福建、浙江、四川、云南和安徽,其中绿茶17个、乌龙茶14个、茉莉花茶12个、红茶11个、黑茶9个、白茶3个、黄茶1个。实验用水均为超纯水(经Milli-Q高纯水发生器纯化)。

标准储备液:准确称取10 mg(准确到0.1 mg)氯噻啉标准样品于100 mL容量瓶中,乙腈定容至刻度,配制成100 mg/L 的标准溶液,4 ℃冷藏保存,有效期6个月。标准工作液:量取标准储备液,用乙腈-水(1 ∶ 1,v/v)分别稀释成1.0、50、100、200、500 μ g/L 的系列标准工作溶液,使用之前现配。

色谱柱:Hypersil GOLD C₁₈(100 mm×2.1 mm,1.7 μ m);柱温:40 ℃;进样量:10 μ L;流速:0.30 mL/min;流动相:A为含0.1%(v/v)甲酸的水溶液,B为乙腈。梯度洗脱程序:0～1.0 min,99%A; 1.0～5.0 min,99%A～5%A; 5.0～8.5 min,5%A; 8.5～9.0 min,5%A～99%A; 9.0～10.0 min,99%A。

电喷雾离子化正离子(ESI⁺)模式;扫描模式:选择反应监测(SRM);喷雾电压:4 000 V;气化温度:300 ℃;鞘气流速:15 mL/min;辅助气流速:15 mL/min;离子传输管温度:320 ℃;碰撞气体(氩气)压力: 0.2 Pa; SRM监测离子对:m/z 262.0/181.1(定量)和262.0/122.2;管透镜补偿电压(tube lens offset voltage): 100 V;碰撞电压:14 V和26 V;保留时间:4.7 min。

茶叶样品用粉碎机粉碎,过600～1 000 μ m孔径筛。准确称取 1.000 0 g样品粉末置于8 mL离心管中,加入0.50 g氯化钠、0.20 g无水硫酸镁、5.00 mL乙腈,涡旋振荡1 min,静置浸泡10 min,再次涡旋振荡1 min,于 5 000 r/min 离心3 min,取上清液1.00 mL,待净化。将1.00 mL提取液置于2 mL离心管中,依次加入GCB、PSA和C₁₈吸附剂各0.050 g及无水硫酸镁0.15 g,涡旋振荡1 min,于 5 000 r/min 离心3 min。取上清液0.50 mL于2 mL离心管中,加入0.50 mL水,摇匀,经0.22 μ m有机微孔滤膜过滤,待分析测试。

采用ESI⁺模式,以1 mg/L 氯噻啉标准样品溶液进行质谱参数优化,确定特征母离子和子离子。氯噻啉农药标准品的二级碎片离子主要有m/z 181.1、122.2、123.2、132.1、95.2等。进一步优化二级碎片离子的管透镜补偿电压、碰撞电压等参数。根据二级离子的响应强度和特异性,选取m/z 262.0/181.1为定量离子,m/z 262.0/122.2为定性离子,碰撞电压分别为14 V和26 V,管透镜补偿电压为100 V。

比较了甲醇-水和乙腈-水两个流动相体系对分离的影响。实验结果表明,氯噻啉在上述两种体系中的峰形接近,但在乙腈-水体系下保留时间更短。这是由于乙腈的极性弱于甲醇,在反相液相色谱中对氯噻啉的洗脱能力强于甲醇,所以出峰更早。因此选择乙腈-水体系作为流动相。同时,在乙腈-水流动相中添加了0.1%(v/v)的甲酸以增加氯噻啉在正离子模式下的离子化效率^[12],改变洗脱程序以缩短氯噻啉的保留时间。在优化条件下,氯噻啉的保留时间为4.7 min,全部梯度程序时间为10 min,可以实现氯噻啉的较快速检测。

考察了乙腈、乙酸乙酯、丙酮和甲醇4种常见的提取溶剂对氯噻啉提取效率的影响。结果表明,氯噻啉的峰面积按照乙腈≈甲醇＞丙酮＞乙酸乙酯的顺序排列。但是以甲醇作为提取溶剂时同时提取出的干扰物质也较多,定量离子通道有干扰峰存在,基线噪声也较高,因此实验选用乙腈为提取溶剂。

咖啡因是茶叶等少数植物的特有成分,茶多酚是茶叶中含量最多的成分,叶绿素是茶叶色素的主要成分之一^[13]。分别以乙腈、乙酸乙酯、丙酮和甲醇4种溶剂进行提取,对提取液和净化液中咖啡因、茶多酚和叶绿素3种茶叶中主要干扰成分进行测定。咖啡因参照GB/T 8312-2013以液相色谱法进行检测,茶多酚参照GB/T 8313-2008方法二紫外-可见分光光度计法进行检测,叶绿素参照GB/T 22182-2008紫外-可见分光光度计法进行检测。实验结果表明,相较于其他3种溶剂,乙腈作为提取溶剂时提取出的咖啡因和叶绿素最少,提取出的茶多酚仅多于乙酸乙酯(见图1)。因此,选择乙腈为提取溶剂可以最少地提取茶叶中的干扰组分,且乙腈与液相色谱-串联质谱流动相基本一致,减少溶剂置换操作。此外,参考AOAC 2007.01方法,在样品中加入无水硫酸镁脱除水分,加入氯化钠，通过盐析作用提高提取效率,从而增加提取方法的稳定性和提取效率。

图 1

Fig. 1

图 1 4种溶剂对茶叶样品中干扰组分的提取情况 Fig. 1 Extraction of interference components in tea samples with four solvents

茶叶中含有大量的色素、生物碱、多酚和有机酸等物质,提取液需要进一步净化处理,以减少色谱柱和质谱系统的污染,确保检测结果的准确性。PSA能有效去除脂肪酸、碳水化合物、酚类和少量色素;GCB能去除色素、类胡萝卜素、固醇和平面结构的干扰杂质^[14]; C₁₈对非极性物质有较高的容量,对色素、甾醇和维生素的去除能力较强^[15]。本文参照AOAC 2007.01的净化方法,在净化过程中依次加入GCB、PSA和C₁₈等吸附剂各0.050 g、无水硫酸镁0.15 g。实验结果表明,经过本方法净化过的样品溶液中咖啡因、茶多酚和叶绿素的含量分别为94、19.4和 0.005 2 mg/L。计算得到本方法对咖啡因和茶多酚的去除率分别为99.95%和98.66% ,提取液中的色素肉眼不可见。以上结果说明本方法可有效去除茶叶中的主要干扰组分。

考察了不同体积比的乙腈-水溶液作为溶剂溶解样品时对色谱峰形的影响。结果表明,纯乙腈作为样品溶剂时氯噻啉的色谱峰展宽最严重;随着乙腈含量的下降峰形变窄、柱效增加,当乙腈含量低于50%(v/v)后,峰形不再有显著变化。以纯乙腈为溶剂进样时,因样品溶剂和流动相不匹配而产生溶剂效应,导致色谱峰展宽,对乙腈溶剂进行稀释后可以有效缓解这种效应的影响。因此,选择乙腈-水(1 ∶ 1,v/v)作为氯噻啉的样品溶解溶剂可以确保最佳的色谱峰形和检出限。

分别配制1.0、50、100、200和500 μ g/L 氯噻啉标准溶液并进行液相色谱-串联质谱分析。结果表明,在1.0～500 μ g/L 范围内线性关系良好,回归方程为y=299.9+6 874.21x(r=0.999 9)。当茶叶中氯噻啉的含量为GB 2763-2014中规定的茶叶类食品限量值3.0 mg/kg 时,参照1.4节方法处理后对应最终测试液中氯噻啉的质量浓度为300 μ g/L,处于校正曲线的中段,有利于对氯噻啉含量处于上述限量值附近样品进行准确定量。以不含氯噻啉的茶叶样品提取液稀释氯噻啉标准溶液,当定量离子和定性离子色谱峰的S/N≥3时,样品中对应的氯噻啉含量为0.005 mg/kg,即本方法的检出限。当定量离子色谱峰的S/N≥10且定性离子色谱峰的S/N≥3时,样品中氯噻啉对应的含量为0.01 mg/kg,即本方法的定量限。以上结果符合氯噻啉残留的判定要求^[4]。

选取色素及浸出物最多的茶叶品种乌龙茶和绿茶为样品,分别添加0.010 mg/kg(方法定量限)、0.30 mg/kg、3.0 mg/kg(GB 2763-2014中的限量值)的氯噻啉,考察方法的回收率和精密度。实验结果表明,乌龙茶的加标平均回收率为88.5% ～101.0% ,相对标准偏差为2.7% ～13.1% ;绿茶的加标平均回收率为87.0% ～101.0% ,相对标准偏差为2.1% ～11.7%(见表1)。加标回收率和精密度均符合检测方法的相关要求^[16]。

表 1 (Table 1)

表 1 茶叶样品中氯噻啉的平均加标回收率和精密度(n=7) Table 1 Average recoveries and precisions of imidaclothiz in tea samples (n=7) Matrix Spiked level/(mg/kg) Average found/(mg/kg) Recovery range/% Average recovery/% RSD/% Oolong tea 0.0100 0.00885 78.0-103.0 88.5 13.1 0.300 0.303 96.3-104.7 101.0 2.7 3.00 2.80 88.3-99.7 93.3 4.4 Green tea 0.0100 0.00870 72.7-101.0 87.0 11.7 0.300 0.303 98.0-106.0 101.0 3.1 3.00 2.98 96.0-102.3 99.2 2.1

表 1 茶叶样品中氯噻啉的平均加标回收率和精密度(n=7) Table 1 Average recoveries and precisions of imidaclothiz in tea samples (n=7)

以不含氯噻啉的黑茶、乌龙茶、绿茶、红茶、白茶、黄茶和茉莉花茶7种茶叶为样品,用本方法进行分析。实验结果表明,空白样品均不含氯噻啉,定量离子通道离子强度(NL)均小于5×10²,谱图不存在干扰情况。分别以上述7种空白提取液作为标准溶液的稀释液,以各组分的峰面积(Y)对质量浓度(X,μ g/mL)绘制基质加标标准曲线,将其斜率与标准品的标准曲线的斜率相比,斜率比为97.1% ～102.2% 。结果表明以本方法测定上述7种茶叶中氯噻啉残留量时的基质效应不明显。

在茶叶样品中添加氯噻啉和10种常见农药(杀螟丹、多菌灵、灭多威、噻虫嗪、吡虫啉、氯噻啉、啶虫脒、除虫脲、腐霉利、喹螨醚、丁醚脲),按本方法进行测定,考察方法的特异性。实验结果表明,其余10种常见农药成分没有对氯噻啉的检测造成干扰。

采用本方法对67个茶叶样品进行检测,只有1个样品检出氯噻啉,含量为0.055 mg/kg。检出氯噻啉的茶叶样品的色谱图见图2。

图 2

Fig. 2

图 2 含有氯噻啉农药残留的茶叶色谱图 Fig. 2 Chromatograms of imidaclothiz residue in tea sample a. total ion chromatogram (TIC); b. selective reaction monitoring (SRM) transitions for quantification; c. SRM transitions for confirmation.

本方法将QuEChERS法和液相色谱-串联质谱结合,兼具有QuEChERS的便捷、快速、低成本、环保和液相色谱-串联质谱的高选择性、高灵敏度等优点。方法学结果均符合《实验室质量控制规范 食品理化检测(GB/T 27404-2008)》的相关规定,能满足茶叶中氯噻啉农药残留的检测要求,是对《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量(GB 2763-2014)》的有效补充。