P/ACE^TMMDQ型高效毛细管电泳仪带二极管阵列紫外检测器(美国Beckman Coulter公司),数据处理采用32Karat软件;未涂层石英毛细管(57 cm×75 μ m,有效长度50 cm;河北省永年锐沣色谱器件有限公司)。

标准品R-去氧肾上腺素和去氧肾上腺素外消旋体盐酸盐购于美国Sigma公司;L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-组氨酸(L-His)、L-脯氨酸(L-Pro)、L-色氨酸(L-Trp)、L-赖氨酸(L-Lys)、L-亮氨酸(L-Leu)购自上海华美生物工程公司;[BMIM]Cl购于上海迈瑞尔化学技术有限公司。

实验用试剂除特别说明外均为分析纯,水为高纯水。

标准溶液:R-去氧肾上腺素和去氧肾上腺素外消旋体标准储备溶液均用水配制,4 ℃下保存;工作溶液由储备溶液用水稀释得到。

样品溶液:将取自健康人的尿样与血样(云南大学校医院)以及加标后的尿样与血样在 2000 r/min 下离心10 min,上清液用0.45 μ m滤膜过滤后直接进样分析。

运行电解质溶液为含有4.0 mmol/L Cu(Ⅱ)、8.0 mmol/L L-Pro、15.0 mmol/L [BMIM]Cl的20 mmol/L Tris-H₃PO₄缓冲溶液(pH 5.4),使用前用0.45 μ m滤膜过滤;分离电压为20 kV,柱温为25 ℃,检测波长为254 nm,采用压力(3447 Pa)进样5.0 s。为了确保重现性,毛细管柱每天在运行前和两次运行间依次用0.1 mmol/L NaOH溶液、水和运行电解质溶液各冲洗5 min。

基于去氧肾上腺素分子中的相邻位置上含有一个-OH基及一个N原子,具有与Cu(Ⅱ)配位的能力,而且其中的-OH基还处于手性C原子上,其与Cu(Ⅱ)配位的能力随光学结构的不同会有所不同,因此拟采用手性配体交换原理实现去氧肾上腺素外消旋体的分离。为此,实验首先在无其他添加剂的情况下,研究了以手性配体交换毛细管电泳中常用的几种氨基酸(L-Phe、L-His、L-Pro、L-Trp、L-Lys以及L-Leu)与Cu(Ⅱ)的配合物为手性选择剂,对去氧肾上腺素外消旋体进行分离。结果表明,在上述手性配合物存在下,虽经多方案优化电泳条件,去氧肾上腺素外消旋体都没有得到基本分离。考虑到离子液体在电泳中对分离尤其对环糊精分离手性药物的改善作用,实验尝试了在手性配体交换基础上,引入离子液体作为添加剂,利用离子液体对手性配体交换的促进作用,达到对去氧肾上腺素外消旋体分离的目的。

选择了简单易得且溶解性好的咪唑类离子液体[BMIM]Cl为添加剂,在含有10 mmol/L [BMIM]Cl的20 mmol/L Tris-H₃PO₄缓冲溶液(pH 5.0)中添加3.0 mmol/L 的Cu(Ⅱ)以及6.0 mmol/L 氨基酸(L-Pro、L-Trp、L-Phe、L-His、L-Lys及L-Leu),研究了不同的手性配体对分离与检测的影响。结果表明,添加L-Lys和L-Leu与Cu(Ⅱ)的配合物对去氧肾上腺素外消旋体的分离基本没有作用,但添加其余4种手性氨基酸与Cu(Ⅱ)的配合物可以使去氧肾上腺素外消旋体得到一定程度的分离,其中以加入L-Pro与Cu(Ⅱ)的配合物得到的分离度最大,为1.02。因此,实验选择L-Pro与Cu(Ⅱ)的配合物作为分离去氧肾上腺素外消旋体的手性选择剂,并进一步研究了L-Pro与Cu(Ⅱ)的加入比例以及浓度对分离的影响。

固定电解质溶液中Cu(Ⅱ)的浓度为3.0 mmol/L,依次加入不同浓度的L-Pro,组成L-Pro与Cu(Ⅱ)的物质的量比依次为0.5 ∶ 1、1 ∶ 1、2 ∶ 1、3 ∶ 1及4 ∶ 1的配合物体系,考察了L-Pro与Cu(Ⅱ)的比例对去氧肾上腺素外消旋体分离的影响。图 1a的结果表明,去氧肾上腺素外消旋体的分离度随L-Pro与Cu(Ⅱ)加入比例的增加先增大后减小,当加入的物质的量比为2 ∶ 1时,具有最大的分离度。

图1

Fig. 1

图1 图 1 (a)L-脯氨酸(L-Pro)与Cu(Ⅱ)的物质的量比及 (b)Cu(L-Pro)2的浓度对去氧肾上腺素光学异构体分离度的影响 Fig.1 Effects of (a) the mole ratio of L-proline (L-Pro) to Cu(Ⅱ) and (b) concentration of Cu(L-Pro)2 on the resolution for the separation of the optical isomers of phenylephrine

保持L-Pro与Cu(Ⅱ)的物质的量比为2 ∶ 1不变,在1.0~6.0 mol/L 配合物浓度范围内,研究了配合物Cu(L-Pro)₂的浓度对分离的影响。随着配合物浓度的增加,去氧肾上腺素外消旋体的分离度有所提高(见图 1b),但组分的迁移时间有所延长,基线噪声增加,检测灵敏度下降。这是因为随着配合物浓度的增加,电解质溶液的离子强度以及背景吸收都会增加。综合考虑分离度、分析时间、检测灵敏度以及基线噪声,选择4.0 mmol/L Cu(L-Pro)₂为分离去氧肾上腺素外消旋体的手性选择剂。

在固定电解质溶液中Cu(L-Pro)₂的浓度为4.0 mmol/L 以及Tris浓度为20 mmol/L 条件下,用H₃PO₄溶液在pH 3.5~8.0范围内调节电解质溶液的pH,试验了pH值对分离的影响。结果表明,随着电解质溶液pH的增加,去氧肾上腺素两个光学异构体的迁移时间均先缩短后增长,分离度则先增加后降低(见图 2)。当pH为5.4时,去氧肾上腺素异构体的分离度具有最大值,而且迁移时间较短。这可能是因为随着电解质溶液pH的增加,一方面毛细管内壁带负电荷的程度增加,电渗流增加;另一方面去氧肾上腺素的酚羟基的电离能力也随之增强,迁移速度下降,因此去氧肾上腺素异构体的迁移时间随溶液pH的变化有最小值。此外,在电解质溶液的pH较低时,Cu(Ⅱ)与L-Pro之间难以形成稳定的配合物,因此对去氧肾上腺素异构体的分离能力较差;而当pH较高时,Cu(Ⅱ)与L-Pro形成的配合物可能过于稳定,从而难以被去氧肾上腺素异构体置换,因此分离度也不高。实验最终选择电解质溶液的pH值为5.4。

图2

Fig. 2

图2 电解质溶液的pH值对R-去氧肾上腺素和 S-去氧肾上腺素迁移时间的影响 Fig.2 Effect of the pH value of electrolyte solution on the migration times of R-phenylephrine and S-phenylephrine

缓冲溶液的浓度对分离有一定的影响。在10～50 mmol/L 范围内,随着缓冲溶液浓度的增加,组分的分离度变化不明显,但迁移时间和基线噪声特别是基线噪声有所增加。因此,实验选用20 mmol/L Tris-H₃PO₄(pH 5.4)为分离缓冲体系。

图 3是电解质溶液中离子液体[BMIM]Cl的浓度对去氧肾上腺素异构体迁移时间的影响。可见,在没有[BMIM]Cl存在时,两组分重叠严重,基本上没有得到分离。随着[BMIM]Cl的浓度在5～20 mmol/L 范围内不断增加,两组分的迁移时间和分离度均增加。但当离子液体的浓度超过15 mmol/L 以后,基线噪声明显增大,而且峰形有所展宽。这可能是因为随着[BMIM]Cl浓度的增加,不仅电解质溶液的离子强度增加,而且离子液体带正电荷的部分在毛细管内壁上的吸附量增加,因此电渗流降低,组分迁移时间延长,基线噪声增大。同时,随着离子液体浓度的增加,其与被分离物之间的相互作用增加,因此分离度增加。综合考虑,选择[BMIM]Cl的浓度为15 mmol/L。

图3

Fig. 3

图3 氯化-1-丁基-3-甲基咪唑([BMIM]Cl)浓度对R-去氧 肾上腺素和S-去氧肾上腺素迁移时间的影响 Fig.3 Effect of the concentration of 1-butyl-3- methylimidazolium chloride ([BMIM]Cl) on the migration times of R-phenylephrine and S-phenylephrine

在上述选定的电解质溶液中,研究了分离电压、柱温和进样时间对去氧肾上腺素光学异构体分离的影响。结果表明,随着分离电压和毛细管柱温的增
加,去氧肾上腺素两个光学异构体的迁移时间均不断缩短,分离度下降,而且当电压达到25 kV(柱温为25 ℃)或柱温达到30 ℃(电压为20 kV)以上时,基线噪声明显,容易出现断流现象。组分的检测灵敏度随着进样时间(进样压力为 3447 Pa)的增加而增大,但组分的峰形在进样时间大于5 s后逐渐展宽,分离度下降。实验选用了分离电压为20 kV,毛细管柱温为25 ℃,在 3447 Pa压力下进样5.0 s。

图 4为在上述选定的电泳条件下得到的去氧肾上000腺 素外消旋体及加标血清样品的代表性电泳图。可见,在此条件下,去氧肾上腺素的两个光学异构体不管是在标准溶液还是血清样品中都得到了有效分离。

图4

Fig. 4

图4 (a)空白血样、(b)加标血样以及(c)去氧肾上腺素 外消旋体标准溶液的电泳图 Fig.4 Electropherograms of (a) a blank blood sample, (b) the blood spiked with phenylephrine raceme and (c) the standard solution of phenylephrine raceme Separation conditions: running buffer, 20 mmol/L Tris-H3PO4 buffer (pH 5.4) composed of 4.0 mmol/L Cu(Ⅱ), 8.0 mmol/L L-Pro and 15 mmol/L [BMIM]Cl; applied voltage, 20 kV; capillary temperature, 25 ℃; detection wavelength, 254 nm; injection, 5 s at 3447 Pa. Peaks: 1. R-phenylephrine; 2. S-phenylephrine.

在优化后的实验条件下,首先对一系列不同浓度的R-去氧肾上腺素标准溶液进行电泳分析,得到了R-去氧肾上腺素的工作曲线,然后用该工作曲线求得去氧肾上腺素外消旋体标准溶液中R-去氧肾上腺素的浓度,再用总浓度差减后求得外消旋体标准溶液中S-去氧肾上腺素的浓度,并由此得到了S-去氧肾上腺素的工作曲线。同时,实验还对100 mg/L 的外消旋体标准溶液进行了5次平行测定,得到了两个光学异构体的峰面积A与迁移时间t的相对标准偏差(RSD)。表 1的结果表明,方法具有较好的重现性和一定的实际应用价值。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 方法的线性关系与精密度 Table 1 Linear relationships and precisions of the method Component Linear range/ (mg/L) Regression equation ( n=7) r Migration time/ min RSDs ( n=5)/% Migration time Peak area R-Phenylephrine 12.5-150.0 A=789.88 C-1901.5 0.9987 10.87 0.58 1.94 S-Phenylephrine 15.0-150.0 A=564.62 C-1024.8 0.9965 11.24 0.69 2.18 A: peak area; C: mass concentration, mg/L.

表1 方法的线性关系与精密度 Table 1 Linear relationships and precisions of the method

将处理后的空白及加标血液与尿液样品,用优化后的电泳条件进行了分离分析,结果见表 2。可见,在空白血液与尿液中均没有检测到R-去氧肾上腺素与S-去氧肾上腺素,而R-去氧肾上腺素与S-去氧肾上腺素在尿液中的加标回收率为93.7%~108.2% ,相对标准偏差在3.18%(n=3)以内,在血液中的加标回收率为91.4%~113.1% ,相对标准偏差在4.82%(n=3)以内。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 样品测定结果及加标回收率(n=3) Table 2 Results and spiked recoveries for the determination of samples (n=3) Sample R-phenylephrine S-phenylephrine Spiked/(mg/L) Found/(mg/L) Recovery/% RSD/% Spiked/(mg/L) Found/(mg/L) Recovery/% RSD/% Urine 0.00 0.00 - - 0.00 0.00 - - 20.00 18.74 93.7 3.06 20.00 19.10 95.5 2.08 50.00 48.62 97.2 1.98 50.00 54.11 108.2 2.96 100.0 104.9 104.9 2.74 100.0 103.1 103.1 3.18 Blood 0.00 0.00 - - 0.00 0.00 - - 20.00 18.28 91.4 2.73 20.00 22.62 113.1 3.83 50.00 52.33 104.7 4.82 50.00 53.69 107.4 2.15 100.0 97.40 97.4 3.11 100.0 104.1 104.3 3.73

表2 样品测定结果及加标回收率(n=3) Table 2 Results and spiked recoveries for the determination of samples (n=3)

研究结果表明,离子液体氯化-1-丁基-3-甲基咪唑对Cu(Ⅱ)与L-脯氨酸手性配合物体系电泳分离去氧肾上腺素光学异构体具有促进作用。而且基于配体交换与离子液体协同作用建立的分离分析去氧肾上腺素光学异构体的毛细管电泳方法具有较好的分离度与较高的定量分析准确度,有一定的实际应用价值。