色谱  2016, Vol. 34 Issue (6): 602-607   PDF (3172 KB)    
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汪永忠
柳清
姜辉
韩燕全
李钰馨
基于气相色谱-飞行时间质谱技术的佐剂性关节炎大鼠尿液代谢组学的研究
汪永忠1, 柳清2, 姜辉1, 韩燕全1, 李钰馨2     
1. 安徽中医药大学第一附属医院, 国家中医药管理局中药制剂三级实验室, 安徽 合肥 230031;
2. 安徽中医药大学药学院, 安徽 合肥 230038
收稿日期：2016-01-15
基金项目：安徽省自然科学基金项目(1508085MH201)
通讯联系人： Tel:(0551)62838556,E-mail:wyzhmail@163.com.
摘要：采用弗氏完全佐剂(FCA)诱导佐剂性关节炎(AA)大鼠模型,观察大鼠足趾肿胀度和踝关节组织的病理学形态变化。应用气相色谱-飞行时间质谱(GC-TOF MS)技术检测AA大鼠尿液代谢物谱,并对数据进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)及正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA),探讨可能的发病机制。通过变量重要性投影值(VIP>1)和P值(<0.05),筛选出尿液中的差异代谢物。在模型组大鼠的尿液中共发现异柠檬酸、α-酮戊二酸、柠康酸、肌酸、3-羟基丁酸等20种差异代谢物。推断AA代谢组学的发病机制可能与能量代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢途径有关。
关键词： 气相色谱-飞行时间质谱     佐剂性关节炎     代谢组学     尿液    
Metabolomics study in rat urine of adjuvant arthritis using gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry
WANG Yongzhong1, LIU Qing2, JIANG Hui1, HAN Yanquan1, LI Yuxin2     
1. The First Affiliated Hospital of Anhui University of Traditional Chinese Medicine, Grade 3 Laboratory of Traditional Chinese Medicine Preparation, State Administration of Traditional Chinese Medicine(TCM), Hefei 230031, China ;
2. College of Pharmacy, Anhui University of Traditional Chinese Medicine, Hefei 230038, China
Received: 2016-01-15
Foundation Item: Project of Natural Science Foundation of Anhui Province (No. 1508085MH201).
* Corresponding author. Tel:(0551)62838556,E-mail:wyzhmail@163.com.
Abstract: Adjuvant arthritis (AA) rats induced by Freund's complete adjuvant (FCA) were used to observe the changes of the degree of swelling in the toes and pathomorphology of ankle joint tissue. Gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry (GC-TOF MS) was employed to detect the metabolite spectrum in rat urine with AA, and the data were analyzed by principal component analysis (PCA), partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA) and orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA), and to explore its possible pathogenesis. Several metabolites based on the variable importance in the projection values (VIP>1), P value (<0.05) and screening in databases were identified. The results showed that 20 potential biomarkers such as isocitric acid, α-ketoglutaric acid, citraconic acid, creatine and 3-hydroxybutyric acid which had a significant contribution to classification were selected. Comparing with the normal group, AA rats present an abnormal metabolism. This study illustrates that AA metabolomics pathogenesis may be related to regulating the dysfunction of energy metabolism, amino acid metabolism and fatty acid metabolism.
Key words: gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry (GC-TOF MS)     adjuvant arthritis (AA)     metabolomics     urine    

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种累及多关节滑膜炎病变的自身免疫性疾病,临床上以慢性、对称性、周围性多关节炎性病变为主要特征[1,2],主要表现为关节疼痛、肿胀等,目前发病机制尚不明确[3]。

代谢组学(metabolomics)是以生物体内低分子质量物质的动态变化规律来表征生物体生理病理变化趋势,并最终还原相关联的生物事件以揭示生物体生理病理变化实质和药物作用机制的一种全新组学技术[3]。代谢组学方法应用于疾病的发病机制等研究领域具有广阔的应用前景[4,5]。

本课题组已对RA大鼠的机制进行了初步的研究[6]。虽然RA的病因仍未明确,但仍有研究表明,RA与内源性代谢物有关[7]。佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)模型在发病机理等方面与类风湿性关节炎相似,是研究类风湿性关节炎的一种经典模型。代谢组学作为生物学研究的新平台,已广泛应用于疾病研究等领域。本实验通过弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant,FCA)建立AA大鼠模型,运用气相色谱-飞行时间质谱(GC-TOF MS)技术,比较AA模型组和正常组大鼠尿液代谢组学的差异,寻找AA尿液的标志性代谢物,从代谢组学的角度,探讨AA可能的发病机制。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

Agilent 7890A气相色谱仪(美国Agilent公司); LECO Chroma TOF PEGASUS HT质谱仪(美国LECO公司); Rxi-5Sil MS毛细管柱(美国Restek公司); PV-200足趾容积测量仪(成都泰盟软件有限公司); GL-20A全自动冷冻高速离心机(湖南仪器仪表总厂离心机厂); Eclipse 80i显微镜(日本Nikon公司); LNG-L2×96冷冻浓缩干燥仪(太仓市华美生化仪器厂); MDF-U71V超低温冰箱(日本三洋公司)。

FCA、脲酶(美国Sigma公司); L-2-氯苯丙氨酸(上海恒柏生物科技有限公司); N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA,含1%(v/v)三甲基氯硅烷(TMCS))(美国REGIS公司);甲醇为色谱纯(国药集团化学试剂有限公司);甲醛(纯度＞36%)、氯仿(纯度＞99.8%)(中国阿达玛斯公司);甲氧胺盐酸盐(纯度＞98%)、吡啶(纯度＞99.5%)(美国Sigma-Aldrich公司)。

1.2 AA模型的建立

SD雄性大鼠20只,体重(220±20) g,由安徽医科大学实验动物中心提供,无特定病原体(SPF)级。SD大鼠在室温18～22 ℃、相对湿度40%～60%下自由进食、饮水,适应性饲养1周。随机分为正常组和模型组,每组10只。模型组每只大鼠于右后足趾皮内注射0.1 mL FCA。

1.3 足趾容积的测量

于造模后第12、16、20、24和28天测量大鼠右后足爪的容积,计算肿胀度:△=致炎后足爪容积的平均值-致炎前足爪容积的平均值。

1.4 尿液样品的收集与处理

造模28天后,将大鼠放置于代谢笼中,禁食不禁水；收集正常组、模型组大鼠24 h尿液,于-80 ℃冰箱中保存。

将收集的尿液样品于室温下融化。取100 μL尿液样品,加入10 μL 160 g/L脲酶,振荡混匀,于37 ℃培养箱孵育1 h后,依次加入0.35 mL甲醇-氯仿(3∶1,v/v)混合液、50 μL L-2-氯苯丙氨酸,旋涡混匀,于4 ℃以13 000 r/min离心10 min,在冷冻浓缩干燥仪中干燥提取物；于干燥后的代谢物中加入80 μL 20 g/L甲氧胺盐试剂(甲氧胺盐酸盐溶于吡啶),于37 ℃烘箱孵育中2 h后,迅速加入100 μL BSTFA(含有1%(v/v)TMCS),将混合物于70 ℃孵育1 h后,冷却至室温,经0.22 μm微孔滤膜过滤,滤液待分析。

1.5 组织病理学检查

麻醉大鼠,取大鼠完整右后足(致炎侧)踝关节,置于10%(v/v)甲醛水溶液中固定,经常规脱钙、脱水、透明、石蜡包埋、切片后,用苏木精-伊红染色法(HE)染色,光镜下观察病理形态学变化。

1.6 GC-MS分析条件

Rxi-5Sil MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);进样口温度:280 ℃;程序升温:初始温度50 ℃,保持1 min,以10 ℃/min升温至290 ℃,保持12 min;载气:高纯氦气;流速:1 mL/min;进样量:1 μL。

离子源:EI源;接口温度:270 ℃;离子源温度:230 ℃;电离能量:-70 eV;扫描范围:m/z 20～600;溶剂延迟:6.1 min。

1.7 数据分析与处理

采用Chroma TOF 4.3X软件和Leco-Fiehn Rtx 5数据库对色谱图进行峰提取、识别和归一化处理后,将共有峰的相对峰面积导入SIMCA-P的DEMO(Umetrics AB,Umea,Sweden)版软件进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)及正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)。采用Student-t检验处理所得的GC-TOF MS数据。

2 结果与讨论
2.1 对AA模型大鼠关节肿胀度的影响

AA大鼠造模后出现红肿等症状,正常组和模型组大鼠在不同时间下的肿胀度如表1所示。造模后的前20天,模型组大鼠足趾容积随着时间增加而逐渐增大,在20天时足趾肿胀度最大,且与正常组相比,差异具有统计学意义(P＜0.01);造模20天后,模型组大鼠足趾容积逐渐下降。

表 1 正常组和模型组大鼠足趾容积在不同时间下的肿胀度(x±s,n=10) Table 1 Degrees of swelling in the toes of rats between normal group and model group (x±s,n=10)
2.2 组织病理形态学变化

正常组和模型组大鼠踝关节组织的光镜图如图1所示。与正常组相比,模型组大鼠踝关节滑膜细胞排列紊乱,关节软骨组织结构遭到破坏,滑膜细胞增生变形,大量炎性细胞浸润及滑膜血管翳形成。提示AA模型复制成功。

图 1 (a)正常组和(b)模型组大鼠踝关节组织的光镜图 (HE,×400) Fig. 1 Light microscope maps (HE,×400) of the anklesjoint tissue of rats in (a) normal group and (b) model group HE: hematoxylin-eosin.
2.3 大鼠尿液的代谢组学分析

将采集的尿液样本按1.4节处理后,采用GC-TOF MS技术进行分析,正常组与模型组大鼠尿液样品的典型总离子流色谱图如图2所示。通过对原始数据的分析,确定了尿液样品的代谢物谱,为了进一步说明代谢谱的不同,运用PCA、PLS-DA、OPLS-DA进行分析。

图 2 正常组和模型组大鼠尿液样品的典型总离子流色谱图 Fig. 2 Typical total ion chromatograms of rat urine samples from normal and model group
2.3.1 大鼠尿液样本的PCA

PCA是将分散在一组变量的信息集中到2或3个综合指标(主要成分)上,利用主要成分提取数据集的特征,对原始数据真实再现。正常组和模型组鼠尿液样品的PCA得分图见图3。由于PCA的计算过程完全无参数限制,无法通过参数化等方法对处理过程进行干预,未能使正常组和模型组完全分开。

图 3 正常组和模型组鼠尿液样品的PCA得分图 Fig. 3 PCA score plot of rat urine samples obtained from the normal and model groups
2.3.2 大鼠尿液样本的PLS-DA

为获取组间分离和增强对分类贡献大的变量的识别,进行了有监督的PLS-DA分析(见图4)。结果表明,正常组和模型组在PLS-DA分析模式下完全分开,表示模型解释能力的参数R2Y和预测能力的参数Q2分别为0.998和0.899,可见该模型稳定性及预测能力均较好。通过随机多次(n=200)改变分类变量y的排列顺序得到相应不同的随机Q2值,对模型的有效性做进一步检验,得到R2=0.968、Q2=0.219,表明该模型可靠。

图 4 正常组和模型组大鼠尿液样品的PLS-DA得分图及置换检验图 Fig. 4 PLS-DA score plot and cross-validation of rat urine samples from the normal and model groups
2.3.3 大鼠尿液样本的OPLS-DA

为最大化凸显模型内部不同组别之间的差异,通过对PLS-DA模型进行正交矫正处理,构建了OPLS-DA得分图(见图5)。结果表明,正常组和模型组可完全分开,提示造模后的大鼠的机体生理及物质代谢情况已发生明显改变。

图 5 正常组和模型组大鼠尿液样品的OPLS-DA得分图 Fig. 5 OPLS-DA score plot of rat urine samples from the normal and model groups
2.4 差异代谢物的鉴定及代谢途径分析

通过变量重要性投影值(VIP＞1)及P值(＜ 0.05)筛选出差异性化合物。利用Leco-Fiehn Rtx 5数据库进行结构鉴定,共鉴定出肌酸、α-酮戊二酸和5-羟基吲哚-3-乙酸等20种差异代谢物(见表2)。

表 2 正常组和模型组大鼠尿液中的差异代谢物 Table 2 Differential metabolites in rat urines between the normal and model groups

采用层次聚类的分析方法,考察20种差异性标志物在正常组与模型组中的含量差异(见图6)。与正常组相比,模型组中去氢莽草酸、衣康酸、肌酸、3-羟基丁酸、丙二酸、5-羟基吲哚-3-乙酸、壬酸、柠康酸、泛醇、甘氨酸、间甲酚、甘油和半胱胺的含量显著升高;丙酮酸、半乳糖醇、α-酮戊二酸、3-羟基-3-甲基戊二酸、异柠檬酸、1,5-脱水葡萄糖醇和半乳糖酸的含量显著降低。

图 6 20种差异代谢物的热图 Fig. 6 Heat map of the 20 differential metabolites

通过HMDB(http://www.hmdb.ca/)和KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)数据库构建生物标志物之间的关系,有助于更加清晰地了解类风湿性关节炎体内代谢异常的路径。20种差异性代谢物主要涉及能量代谢、氨基酸及脂肪酸代谢,主要分布于三羧酸循环、色氨酸、苯丙氨酸及不饱和脂肪酸代谢等途径,主要差异性代谢物发生紊乱的代谢通路如图7所示。

图 7 差异性代谢物在相关代谢通路的代谢网络图 Fig. 7 Metabolic networks of differential metabolites in the relevant metabolic pathways Red: content increased in model group; green: content reduced in model group.

泛醇是维生素B5的衍生物,性质不稳定,易转化为泛酸,而泛酸是辅酶A的前体,在脂肪酸和三羧酸循环中起重要的调控作用,泛醇水平的增加使能量代谢紊乱[8]。3-羟基丁酸、衣康酸和柠康酸代谢物水平的增加会导致严重的关节损伤[9]。肌酸由3种氨基酸(精氨酸、甘氨酸及甲硫氨酸)合成,肌酸水平的升高,表明AA的病理机制与能量代谢和氧化损伤有关[10,11]。

α-酮戊二酸和异柠檬酸参与三羧酸循环,体内三羧酸循环代谢活动的异常可能与关节软骨及软骨细胞的生化代谢紊乱有关[12],α-酮戊二酸和异柠檬酸水平的下降,表明弗氏完全佐剂诱导的AA大鼠存在三羧酸循环紊乱。在炎症刺激下,更多的半乳糖转化为葡萄糖,半乳糖还可通过代谢旁路还原为半乳糖醇或氧化为半乳糖酸,半乳糖酸水平的显著降低,提示AA可能导致代谢紊乱。去氢莽草酸是莽草酸途径的中间产物,自身具有抗炎、镇痛、调节能量代谢的作用[13],去氢莽草酸水平的升高,提示能量代谢紊乱。

5-羟基吲哚-3-乙酸是色氨酸的代谢产物,色氨酸是人体必需的氨基酸,具有免疫调节作用,主要通过5-HT通路影响免疫系统,类风湿关节炎发病可能与色氨酸代谢异常有关[14,15]。间甲酚是苯丙氨酸产生的厌氧菌,苯丙氨酸是一种必需氨基酸,体内不能合成,间甲酚水平的升高,表明苯丙氨酸代谢紊乱[16]。3-羟基-3-甲基戊二酸是亮氨酸的代谢产物,亮氨酸是一种支链氨基酸,其水平的升高直接影响氨基酸代谢[17]。甘氨酸为人体非必需氨基酸,与佐剂性关节炎免疫应激有关,甘氨酸水平的升高表明可能与甘氨酸代谢异常有关[18]。

甘油是甘油酯代谢的中间产物,甘油脂代谢紊乱在AA患者中相当普遍,可能与炎症状态及AA疾病活动相关[19]。丙二酸易转化为丙二醛。丙二醛是常用的膜脂过氧化指标,可反映机体脂质过氧化水平,有研究[20]表明脂质过氧化在类风湿关节炎的发生、发展过程中发挥着重要的作用。

半胱胺是同型半胱氨酸的代谢产物,可加重炎症介质的释放,其水平与炎症指标有关,AA患者体内普遍存在同型半胱氨酸升高的现象[21,22]。

3 结论

本实验以佐剂性关节炎大鼠和正常大鼠为研究对象,应用GC-TOF MS技术,通过多元统计分析等手段,确定了异柠檬酸、α-酮戊二酸、柠康酸、肌酸、3-羟基丁酸等20个差异代谢物,主要与能量代谢、色氨酸代谢、苯丙氨酸代谢和半乳糖代谢等途径有关,从而揭示了AA体内代谢的网络途径,有助于进一步了解类风湿关节炎可能的发病机制,为类风湿关节炎的早期疾病预测和诊断提供了依据。

参考文献
[1] Alghasham A, Rasheed Z, Autoimmunity,2014, 47 (2):77.
[2] Li R, Meng Q G, Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine,2007, 25 (7):1348. 李瑞, 孟庆刚, 中华中医药学刊,2007, 25 (7):1348.
[3] Ding X H, Hu J B, Li J F, et al, Anal Biochem,2014, 458 :49.
[4] Wang F R, Wu Y, Ai Y, et al, Biomed Chromatogr,2016, 30 (3):396.
[5] Lauridsen M B, Bliddal H, Christensen R, et al, J Proteome Res,2010, 9 (9):4545.
[6] Deng L F, Wang Y Z, Han Y Q, et al, Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology,2015, 31 (2):153. 邓龙飞, 汪永忠, 韩燕全, 等, 细胞与分子免疫学杂志,2015, 31 (2):153.
[7] Zhang D, [MS Dissertation][M]. 2010 : 269 张迪, [硕士学位论文][M]. 沈阳: 沈阳药科大学, 2010 :269
[8] Qi Y, Pi Z F, Liu S, et al, Mol Biosyst,2014, 10 (10):2617.
[9] Terkeltaub R, Nat Rev Rheumatol,2010, 6 (1):30.
[10] Zhang H W, Fu P, Ke B, et al, J Ethnopharmacol,2014, 154 (1):55.
[11] Zabek A, Swierkot J, Malak A, et al, J Pharm Biomed Anal,2016, 117 :544.
[12] Qi Y, Li S Z, Pi Z F, et al, J Chromatogr B,2014, 953/954:11 :.
[13] Sun W Y, Sun J N, Liu Z Q, et al, Chinese Journal of Pharmaceutical Sciences,2005, 40 (9):678. 孙文燕, 孙建宁, 刘振权, 等, 中国药学杂志,2005, 40 (9):678.
[14] Yue R C, Zhao L, Hu Y H, et al, J Ethnopharmacol,2013, 145 (2):465.
[15] Xu T F, Liu S, Zhao J D, et al, Mol Biosyst,2015, 11 (11):3081.
[16] Yue R, Zhao L, Hu Y, et al, Evid Based Complement Alternat Med,2013, 2013 :439690.
[17] Wang Z G, Tang Z Y, Wang F, et al, Chinese Journal of Practical Department of Internal Medicine,1999, 19 (4):205. 王振刚, 唐志毅, 王芳, 等, 中国实用内科杂志,1999, 19 (4):205.
[18] Yang S B, Li X, Su M M, et al, Journal of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,2009, 23 (1):33. 杨松滨, 李昕, 苏明明, 等, 上海中医药大学学报,2009, 23 (1):33.
[19] Kim S, Hwang J, Xuan J H, et al, PloS One,2014, 9 (6):97501.
[20] Zhang C F, Zhang S L, He X, et al, J Ethnopharmacol,2014, 153 (3):793.
[21] Lin Y, Cui D H, Shen B, Journal of Medical Research,2014, 43 (9):108. 林艳, 崔栋华, 沈波, 医学研究杂志,2014, 43 (9):108.
[22] Chen J, Tang Q, Xu J H, Anhui Medical Journal,2011, 32 (8):1083. 陈军, 唐茜, 徐建华, 安徽医学,2011, 32 (8):1083.