柚子(citrus junos tanaka),又名文旦,是芸香科柑橘亚科柚子属植物,我国是世界上柚类种植面积最大,产量居第二位的生产大国。我国柚类品种资源丰富、品种(品系)繁多,目前主栽品种有沙田柚、琯溪蜜柚、玉环柚等,占全国柚子栽培面积的80%左右,种植面积均达0.37万公顷以上,年产量超过1.2万吨,主要分布于福建、浙江、台湾、广西、广东等多个省份[1]。柚子由于其特殊的芳香味以及丰富的营养价值和药用价值,目前已被广泛应用于食品和化妆品上[2]。近年来,色谱-质谱联用分析技术的发展,为柚子的化学组分特别是挥发性物质的分析提供了一种手段,柚子的果皮、果肉、精油的挥发性成分研究国内外均有报道[3-10]。为了研究不同品种柚子的挥发性成分种类和含量的异同,臧燕燕等[11]利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对琯溪蜜柚、沙田柚、胡柚等5种柚子的外果皮挥发性物质组成进行了分析比较,发现不同品种柚子间挥发性物质的种类、数量和含量上都存在差异。洪鹏等[12]运用感官评价和气相色谱-质谱联用技术研究了琯溪蜜柚、沙田柚和梁平柚果皮精油的香味特征和挥发性成分,研究结果表明,3种柚子精油主要的挥发性成分相似,但不同品种柚子的精油存在特征性差异。
随着柚子的营养价值和药用价值日益受到重视,假冒名优品种柚子的现象时有发生,品质等级划分和原产地的鉴定技术就显得尤为重要,建立起柚子的化学指纹图谱是目前最为有效的鉴定手段。中药的化学指纹图谱已广泛用于评价中药质量的标准,高效液相色谱指纹图谱[13]、气相色谱指纹图谱[14]、气相色谱-质谱(GC-MS)联用图谱[15]、超高效液相色谱-质谱联用图谱[16]等方法均有报道,利用指纹图谱的表现形式来反映中药的质量,通过在指纹图谱数据中找到标志性的化合物是目前最有效的中药品质评价方法。本研究利用气相色谱-质谱联用和两种液相色谱-质谱联用(高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱(HPLC-ESI-IT-MS)和高效液相色谱-电喷雾三重四极杆质谱(HPLC-ESI-QqQ-MS))技术对我国目前主栽的3种柚子(沙田柚、琯溪蜜柚、玉环柚)[1]的外表皮、内表皮、内果皮、果肉、种子5个部位的化学组分种类和含量进行差异性分析。在此基础上,将指纹图谱技术应用到柚子的产地和质量识别上,初步建立起不同品种柚子的多个部位的GC-MS指纹图谱,以指纹图谱的形式实现对柚子产地的识别和质量的控制,从建立在指纹图谱中的大量化学数据中找到相应的标志物的差异来评价和鉴定柚子的质量和产地是非常有意义的,同时也为柚子的原产地溯源和品种的鉴定提供一种新的更客观、准确、快捷的新方法、新思路。
试剂:乙腈(色谱纯,CNW公司);标准品:蛇床子素(osthol)、诺卡酮(nootkanone)、谷甾醇(sitosterol)、柠檬烯(limonene)、菜油甾醇(campesterol)、油酸酰胺((Z)-9-octadecenamide),购自Dr. Ehrenstorfer GmbH。
样品:广西容县沙田柚(Shatian pomelo)采自广西容县自良镇大里村浪头队,福建琯溪蜜柚(Guanxi pomelo)采自福建漳州平和县文峰镇柴船村坎下,浙江玉环柚(Yuhuan pomelo)采自浙江省台州市玉环县楚门村,2012～2014年连续3年在同一种植园进行采样,随机采摘完全成熟、大小适中、色泽相近、无病斑的果实。
柚子表皮用蒸馏水清洗2次,小心切开，分离外表皮(油泡层)、内表皮(絮状层)、内果皮(即果肉外果皮)、果肉、种子(琯溪蜜柚无种子)共得到5种样本,每种样本分别切成约2 cm小块并匀浆,匀浆后的样本分别装进样品袋,并标记。分别称取匀浆后的柚子样品外表皮、内表皮、内果皮、果肉、种子各5 g到100 mL离心管中,加入20 mL乙腈,涡旋2 min,超声振荡30 min,然后在4 500 r/min的转速下离心3 min,取上清液过0.22 μm的有机膜,待测。每个部位做3个平行样品。
GC-MS: Agilent 7890A-5975C。色谱条件:色谱柱为HP-5MS(5% phenyl methyl silox 325 ℃,30 m×250 μm×0.25 μm);进样口温度260 ℃;检测器温度280 ℃;柱箱温度(程序升温):初始温度为50 ℃,维持5 min;以10 ℃/min升至200 ℃,维持5 min;再以10 ℃/min升至280 ℃,维持15 min。质谱条件:四极杆温度150 ℃,离子源温度230 ℃,电离能70 eV,全扫描模式,扫描范围50~600。
HPLC-ESI-IT-MS: Agilent 1100 Series LC,ESI-MS Ion Trap system。处理软件:LC/MSD Trap 5.2 SW。色谱条件:ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为乙腈-水(含0.1%三氟乙酸)(80∶20,v/v);流速0.6 mL/min;柱温30 ℃;进样量20 μL。质谱条件:喷雾压力172 kPa (25 psi),干燥气流速8 L/min,干燥气温度325 ℃,ESI+模式,扫描范围50～550。
HPLC-ESI-QqQ-MS: Agilent 1260 Series LC,ESI-G6460 QqQ MSD。色谱条件:Agilent eclipse plus C18色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.8 μm),流动相为水(含0.1%甲酸)-甲醇(20∶80,v/v),流速0.3 mL/min,柱温30 ℃,进样量5 μL。质谱条件:喷雾压力241 kPa (35 psi),干燥气流速8 L/min,干燥气温度350 ℃,毛细管电压3.0 kV,电离方式ESI+,扫描范围50～550。
定性:样品在上述色谱条件下进行GC-EI-MS、HPLC-ESI-IT-MS、HPLC-ESI-QqQ MS测定,对GC-MS中得到的信噪比(S/N)在10倍以上的物质进行NIST08标准物质谱库检索比较,再对GC-MS、HPLC-MS下得到的各个物质主要的质谱碎片进行推导,并选择购买了其中6种主要化学组分的标准物质(蛇床子素、诺卡酮、谷甾醇、柠檬烯、菜油甾醇、油酸酰胺)对定性结果进一步确证。
定量:以同一条件下GC-MS峰面积归一化法进行主要化学组分定量,得到各组分的相对含量,并对定量结果进行差异性分析,将只在单一品种中检测到且含量≥0.1%的化学组分定义为特有化学组分。
使用SPSS19.0(IBM公司,美国)对各部位的化学组分进行聚类分析,聚类方法采用组间距离,度量标准用余弦度量相似性,并绘制聚类分析树状图。分别对3个产地柚子的5个部位的共有色谱峰进行相似度分析,采用夹角余弦法和相关系数法计算3个产地柚子之间的相似度。
为了保证鉴定结果的重现性和稳定性,我们分别进行了3年(2012～2014)的重复采样及检测分析,比较了同一品种的柚子同一部位化学组分的稳定性，色谱图见图 1。
结合GC-MS的NIST08标准物质谱库检索结果及HPLC-MS质谱碎片的推导,本实验共鉴定出沙田柚中43种、琯溪蜜柚中48种、玉环柚中48种化学组分,3种柚子5个部位共计68种不同化学组分,包括醇类19种、酯类15种、烯烃类9种、有机酸类8种、酮类7种、烷烃类4种、其他物质6种(样品的GC-MS指纹图谱见图 2，各组分峰面积归一化含量结果见表 1～5)。
沙田柚5个部位共检出化学组分43种,其中外表皮中18种,包括醇类4种、酯类1种、烯烃3种、有机酸类3种、酮类3种、烷烃类1种和其他物质3种;内表皮中13种,包括醇类5种、酯类3种、烯烃类1种、有机酸类3种和其他物质1种;内果皮中16种,包括醇类5种、酯类7种、烯烃1种、有机酸类3种;果肉中19种,包括醇类7种、酯类5种、烯烃类2种、有机酸类3种、酮类1种和其他物质1种;种子中16种,包括醇类1种、酯类8种、烯烃类4种、有机酸类3种。
琯溪蜜柚5个部位共检出化学组分48种,其中外表皮中26种,包括醇类7种、酯类3种、烯烃类5种、有机酸类2种、酮类4种、烷烃类2种和其他物质3种;内表皮中12种,包括醇类4种、酯类1种、烯烃类1种、有机酸类3种、酮类2种和其他物质1种;果皮中15种,包括醇类4种、酯类5种、烯烃类1种、有机酸类3种、烷烃类1种和其他物质1种;果肉中17种,包括醇类5种、酯类3种、烯烃类1种、有机酸类3种、酮类2种和其他物质3种。
玉环柚5个部位共检出化学组分48种,其中外表皮中20种,包括醇类3种、酯类4种、烯烃类5种、有机酸类2种、酮类1种、烷烃类3种和其他物质2种;内表皮中16种,包括醇类6种、酯类3种、烯烃类1种、有机酸类3种、酮类2种和其他物质1种;果皮中21种,包括醇类6种、酯类7种、烯烃类1种、有机酸类3种、酮类2种和其他物质2种;果肉中17种,包括醇类3种、酯类7种、烯烃类1种、有机酸类3种、酮类1种和其他物质2种;种子中16种,包括醇类1种、酯类7种、烯烃类4种、有机酸类3种和其他物质1种。
由表 1～5可知,3种柚子外表皮的化学组分种类均比较丰富，含有醇类、酯类、烯烃类、有机酸类、酮类、烷烃类以及其他类别的物质;其次为果肉,含有除烷烃类之外的所有上述类别的化学组分;内表皮、果皮、种子共同含有的化学组分以醇类、酯类、烯烃类、有机酸类为主。
比较不同品种柚子同一部位的化学组分可知,外表皮中,沙田柚特有化学组分有3种,琯溪蜜柚特有化学组分有6种,玉环柚特有化学组分有4种(见表 1);内表皮中,沙田柚特有化学组分有3种,琯溪蜜柚特有化学组分有4种,玉环柚特有化学组分有8种(见表 2);内果皮中,沙田柚特有化学组分有1种,琯溪蜜柚特有化学组分有4种,玉环柚特有化学组分有6种(见表 3);果肉中,沙田柚特有化学组分有4种,琯溪蜜柚特有化学组分有4种,玉环柚特有化学组分有2种(见表 4);种子中,沙田柚和琯溪蜜柚特有化学组分各有1种(见表 5)。不同品种的柚子同一部位的化学组分种类和数量差异明显,其中玉环柚的特有化学组分最多,沙田柚的特有化学组分最少。
沙田柚、琯溪蜜柚、玉环柚4个部位检出共有的化学组分17种(包括醇类4种、酯类4种、烯烃1种、有机酸类4种、酮类2种、烷烃类1种和其他物质1种);沙田柚和玉环柚种子共有的化学组分有15种(包括醇类1种、酯类7种、烯烃类4种、有机酸类3种)。其中沙田柚、琯溪蜜柚、玉环柚外表皮共有的化学组分中相对含量最高的分别是柠檬烯44.03%、诺卡酮11.60%、柠檬烯18.63%,内表皮中共有化学组分相对含量最高的分别是软脂酸16.12%、油酸酰胺44.62%、软脂酸7.34%,内果皮中共有化学组分相对含量最高的分别是软脂酸16.07%、谷甾醇30.75%、亚油酸12.08%,果肉中共有化学组分相对含量最高的分别是软脂酸20.02%、吡喃酮7.62%、软脂酸16.38%;沙田柚和玉环柚种子相对含量最高的化学组分分别是软脂酸占16.39%、亚油酸45.83%。结果显示,不同品种柚子同一部位的化学组分不仅在种类上有所不同,在相对含量上差异也明显。沙田柚因含有柠檬烯较多,香味比玉环柚和琯溪蜜柚要浓,口味较好,琯溪蜜柚和玉环柚含有油酸类和酯类的物质较多,营养价值较高。
运用聚类分析进一步比较3种柚子5个部位间的化学组分的差异,将组距小于10的组分划分为一类,结果表明,3种柚子外表皮的化学组分可分为3类(见图 3a),第一类是琯溪蜜柚外表皮区别于其他两种柚子外表皮的特有组分:月桂烯、反油酸、香叶醇、2,6-octadiene-1,8-diol,6-methyl-2-(4-methyl-3-penten-1-yl)-8-acetate,(2Z,6E)和β-D-mannofuranoside,(2E,6E)-3,7,11-trimethyl-2,6,10-dodecatrien-1-yl以及2,4-methylenecycloartan-3-one;
且诺卡酮和香豆素的相对含量都远高于其他两种柚子。第二类是柠檬烯,该类是沙田柚外表皮区别于其他两种柚子外表皮的化学组分,该物质在沙田柚外表皮中远高于琯溪蜜柚和玉环柚。第三类是玉环柚区别于其他两种柚子的化学组分橙皮油素,其在玉环柚外表皮中的相对含量远高于其他两种柚子外表皮。
3种柚子的内表皮的化学组分以组距小于5划分为一类,可分为4类(见图 3b),第一类中的乙酰乙醇、反油酸甲酯、丙酮醇、α-亚油酸甲酯、乙基胆酸、吡喃酮、诺卡酮是浙江玉环柚内表皮的特有化学组分,吡喃葡萄糖苷、软脂酸乙酯是容县沙田柚特有内表皮化学组分,而油酸、维生素E、黄柏酮、柠檬苦素是琯溪蜜柚内表皮的特有化学组分,可知玉环柚的内表皮特有化学组分的种类比其他两种柚子多。第二类化学组分是甘油,这是沙田柚区别于其他两种柚子的内表皮化学组分,甘油在沙田柚内表皮的相对含量远高于其他两种柚子;第三类化学组分是油酸酰胺,其在琯溪蜜柚内表皮的相对含量远高于其他两种柚子;第四类是2,3-丁二醇,是玉环柚内表皮特有的化学组分,且在其化学组分中相对含量占最高,是区别于其他两种柚子的主要化学组分。
3种柚子的内果皮的化学组分以组距小于15划分为一类,可分为3类(见图 3c),第一类化学组分中,甲基戊醇、吡喃酮、二环氧丙醚、异丙醇、诺卡酮、吡喃葡萄糖苷是琯溪蜜柚的特有化学组分,二十七烷、甘油二棕榈酸酯、8-tetradecen-1-ol,7-methyl-1-acetate,(8Z)和oleic acid,3-(octadecyloxy)propyl ester是琯溪蜜柚特有的化学组分,在此类化学组分分类中,玉环柚的内果皮特有化学组分明显多于其他两种类型的柚子;第二类内果皮的化学组分是甘油和软脂酸,沙田柚中这两种化学组分的相对含量明显高于其他两种柚子;第三类是油酸酰胺和谷甾醇,这两种物质是琯溪蜜柚区别于其他两种柚子的化学组分,相对含量高于其他两种柚子。
3种柚子的果肉的化学组分以组距小于10划分为一类,可分为3类(见图 3d),第一类中,鲨烯、2,3-丁二醇、丙酮醇是沙田柚果肉的特有组分,2,5-dimethyl-2,4-dihydroxy-3(2H)-furanone、甘油二棕榈酸酯、糠醛、黄柏酮是琯溪蜜柚果肉特有的化学组分,acetic acid,2-(acetyloxy),4-methyl-1-(2-methylpropyl)-4-penten-2-yn-1-yl ester、8-tetradecen-1-ol,7-methyl-1-acetate,(8Z)是玉环柚特有的化学组分,琯溪蜜柚的特有化学组分多于其他两种柚子;第二类是软脂酸,是沙田柚果肉区别于其他两种柚子的化学组分,相对含量高于其他两种柚子;第三类是羟甲基糠醛,琯溪蜜柚中此化学组分的相对含量明显高于其他两种柚子。
将组距小于20的组分划分为一类,可将两种柚子种子的化学组分分为2类(见图 3e),第一类,软脂酸乙酯和油酸酰胺分别是沙田柚种子和玉环柚种子的特有化学组分,其他化学组分的相对含量相似;第二类化学组分α-亚油酸是玉环柚种子区别于沙田柚的化学组分,其含量明显高于沙田柚。
采用夹角余弦法和相关系数法进行了柚子各部位化学组分GC-MS指纹图谱的相似度分析。对3个产地柚子的5个部位的GC-MS谱图进行分析,分别利用7、6、10、11和15个特征峰的相对峰面积进行相似度计算。从表 6可以看出,广西容县沙田柚的外表皮、内表皮和果肉化学组分与浙江玉环柚的相似度很高,夹角余弦和相关系数分别达到了0.987、0.995、0.983和0.995、0.986、0.952;内果皮化学组分在3个产地的柚子间相似性不高,广西容县沙田柚和浙江玉环柚的相似度较其他两个产地的比较要高;广西容县沙田柚种子和浙江玉环柚的相似度较差,夹角余弦和相关系数值均不大于0.500。因此本实验建立的3个产地的柚子5个部位的化学组分的指纹图谱能够反映它们之间的共同特性,同时也反映了化学组分之间的差异性,可为产品的质量控制和真伪提供理论依据。
利用感官分析、化学元素分析和元素指纹鉴定等评价手段,研究不同品种柚子的品质特性差异来对柚子原产地溯源鉴定的技术已有提出。但以上的鉴定评价手段受外界因素(气候、环境、人)的影响较大,并不能对柚子的原产地进行准确的溯源。本研究采用常规色谱-质谱技术,对3个不同品种(不同产地)柚子5个部位的化学组分进行全组分分析,对所有化学组分进行结构推导定性,同时用峰面积归一化法进行定量,并进一步用聚类分析方法、相似度分析法分析了3种柚子5个部位化学组分的种类、含量的差异性和相似度。结果显示,不同品种(不同产地)的柚子同一部位上的化学组分在种类和含量上存在相似性,但差异性也明显存在,每个部位间均存在多种明显的特有物质,同时一些化学组分含量上明显高于其他两种柚子。研究结果表明,不同品种(不同产地)柚子的化学组分的种类和含量上的差异性明显,可为柚子品种鉴定、原产地溯源鉴定提出一种新的色谱指纹思路,在本研究的基础上,可建立不同品种、同一品种不同产地柚子的色谱(气相色谱、液相色谱)-质谱指纹图谱库,为我国柚子品质质量控制、原产地及品牌保护提供一种可量化、快捷、准确、简易的方法。本文未对柚子的种植环境(施肥、阳光、土壤性质等)对其化学组分的种类以及含量的影响进行研究讨论,环境与化学组分之间的关系还有待进一步研究。
2016,
Vol. 34 Issue (6): 558-566
PDF (1855 KB)
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