色谱  2016, Vol. 34 Issue (6): 567-571   PDF (1023 KB)    
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韩吉春
李广林
王小臣
骆亦奇
液相色谱-串联质谱法检测干血点中的同型半胱氨酸
韩吉春, 李广林, 王小臣, 骆亦奇     
杭州量康医学检验所, 浙江 杭州 310052
收稿日期：2016-02-06
通讯联系人： Tel:(0571)86538317,E-mail:rubenluo@gmail.com.
摘要：建立了一种高通量液相色谱-串联质谱技术检测干血点(DBS)中同型半胱氨酸(homocycteine, Hcy)的方法。以DBS为样本,homocystine-D8为同位素内标,二硫苏糖醇(DTT)为蛋白结合态Hcy的还原剂,使用含0.1%(v/v)甲酸、0.05%(v/v)三氟乙酸的乙腈溶液萃取。整个前处理过程使用自动移液平台及96孔板实现高通量自动化操作。处理后的样本经过Phenomenex CN柱分离,使用多反应监测模式进行LC-MS/MS分析。结果表明:Hcy的检出限为0.12 μ mol/L(S/N=3),定量限为0.46 μ mol/L(S/N=10)。Hcy在1.16~148.00 μ mol/L范围内线性关系良好,R2=0.994。Hcy的平均回收率为(103.0±4.97)%~(112.0±2.13)%,日内相对标准偏差(RSD)为1.9%~4.6%,日间RSD为1.5%~7.1%。DBS样本在不同温度(-4、-20、22和37℃)下储存不同时间(0、1、2、3、4、5、6、14天)后的稳定性试验显示样本总体RSD<15%,经前处理后的样本在48 h内的稳定性试验显示样本总体RSD<5%。该方法与传统生化分析方法的相关性好(R2=0.9818, n=47)。
关键词： 液相色谱-串联质谱     自动移液平台     同型半胱氨酸     干血点    
Determination of homocysteine in dried blood spots using liquid chromatography-tandem mass spectrometry
HAN Jichun, LI Guanglin, WANG Xiaochen, LUO Yiqi     
Quantum Health Medical Laboratory, Hangzhou 310052, China
Received: 2016-02-06
* Corresponding author. Tel:(0571)86538317,E-mail:rubenluo@gmail.com.
Abstract: A high-throughput method to measure homocysteine (Hcy) in dried blood spots (DBS) by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was established. The DBS sample processing includes adding homocystine-D8 as internal standard, dithiothreitol (DTT) as reducing agent for bound Hcy forms, acetonitrile containing 0.1% (v/v) formic acid and 0.05% (v/v) trifluoroacetic acid for Hcy extraction. This procedure was carried out in a 96-well plate format in an automated liquid handling platform to facilitate high-throughput analysis. The processed samples were separated on a Phenomenex CN column and quantitated by LC-MS/MS in multiple reaction monitoring (MRM) mode. The limit of detection was 0.12 μ mol/L (S/N=3) and the limit of quantification was 0.46 μ mol/L (S/N=10). The linear range was 1.16-148.00 μ mol/L (R2=0.994). The average recoveries were (103.0±4.97)%-(112.0±2.13)%. The intra-day relative standard deviations (RSDs) were 1.9%-4.6% and the inter-day RSDs were 1.5%-7.1%. DBS sample stability was confirmed by measuring same DBS samples stored for 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 and 14 days at -4, -20, 22 and 37℃, and an overall sample RSD<15% was found under each temperature. Processed sample stability within 48 hours was also confirmed with an overall sample RSD<5%. The comparison of this method with conventional biochemistry assay was made by measuring 47 blood samples both in an automated biochemistry analyzer (samples in plasma form) and with the LC-MS/MS method (samples in DBS form), which showed excellent correlation (R2=0.982).
Key words: liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)     automated liquid handling platform     homocysteine     dried blood spots (DBS)    
 

同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)是一种含硫氨基酸,它是蛋氨酸代谢的中间产物。随着Hcy体内代谢途径的确立,国内外学者围绕高Hcy与冠心病、周围血管疾病及脑血管疾病等多种疾病的关系进行了大量研究,认为Hcy是心脑血管疾病的独立危险因素；同时,Hcy与神经管缺陷、肾病、老年痴呆症等多种疾病有关[1-6]。因此快速准确检测Hcy浓度可为某些疾病的预防、诊断及治疗提供依据。血浆中约75%的Hcy与白蛋白结合,为结合态的Hcy,部分以二硫键结合的Hcy-Hcy、Hcy-半胱氨酸化合物形式存在,只有1%～2%以还原态Hcy存在于血浆中。

目前,同型半胱氨酸的测定方法有很多种,高效液相色谱(HPLC)法[7-9]、气相色谱-质谱联用(GC-MS)法[10]、生化法[11]、免疫法[12]、液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)法[13],其中临床检测中常用的有HPLC法、生化法和免疫法。这些方法中,HPLC法、GC-MS法需要进行Hcy衍生等步骤,操作比较复杂且耗时。生化法和免疫法虽然可以自动化,但方法特异性不甚理想,且试剂昂贵[14]。相对较新的LC-MS/MS法具有选择性广、特异性好、灵敏度高、检测速度快等特点,近年来在临床检测中的应用越来越广泛。

在使用LC-MS/MS检测样本时,前处理过程往往较为复杂,耗时较长,且人工操作的误差容易导致方法的不稳定。样本前处理的自动化能够很好地解决人为因素导致的误差,同时可以对样本进行批量分析,提高检测效率。本方法使用高通量自动移液平台实现样本前处理的自动化,提高了LC-MS/MS检测的精确度和效率。

干血点(dried blood spot,DBS)采样法是一种便捷的临床血液样本采集方法,既保证了待检测样本的生物稳定性,又便于储存和运输,在临床诊断上已经用于新生儿遗传代谢性疾病的筛查。同常规采样方法(血清、全血、血浆)相比,DBS具有下面几个明显的优势[15]: (1)样本采集过程简单、成本低、无需专业人士操作,无需常规采样所必需的离心、冷冻等特殊设备;(2)采样无地域限制,无时间和频率限制,适合疾病的长期监控;(3)对于大部分检测指标,采集后的样本干燥后可以通过邮寄的方式寄达检测实验室,无需冷冻或冷藏;(4)降低了交叉感染的风险,具有很好的生物安全性。DBS早在20世纪60年代就已被用于新生儿苯丙酮尿症的筛查[16]。近年来,随着自动化检验技术的发展,DBS在遗传代谢类疾病的诊断及筛查中的应用价值日渐突显。

本文提供了一种基于LC-MS/MS与高通量自动移液平台联用检测DBS样本中Hcy的方法,前处理过程实现了自动化操作,用LC-MS/MS多反应监测(MRM)模式进行分析。该方法单个样本分析时间为2 min,可实现每日近800个样本的分析检测。该方法简单、快速、准确度高、灵敏度高。

1 实验部分
1.1 仪器和材料

Agilent 1290-6495液相色谱-串联质谱联用仪(美国Agilent公司),Bravo自动化液体处理平台(自动移液平台,美国Agilent公司),Beckman Coulter AU5821全自动生化仪(美国Beckman Coulter公司),分析天平(德国Sartorius公司),3 mm打孔器(美国Ted Pella公司),在线过滤器(美国Agilent公司),超声波分析仪(杭州法兰特超声波科技有限公司),超纯水仪(德国EMD Millipore公司)。Phenomenex CN柱(100 mm×2.0 mm,3 μm,美国Phenomenex公司),96孔深孔板(美国Axygen公司),96孔进样板(美国Bio-Rad公司),Whatman 903 CF12滤纸(美国GE公司)。

Hcy标准品(纯度≥95%,美国Sigma-Aldrich公司);氘代标记二聚同型半胱氨酸(homocystine-D8)(纯度98%,加拿大CDN Isotopes公司);二硫苏糖醇(DTT,纯度99%,上海如吉生物科技公司);甲酸(FA,质谱级,上海安谱有限公司);乙腈(质谱级,西班牙Scharlau公司);盐酸(试剂级,西班牙Scharlau公司);三氟乙酸(TFA,纯度≥99%)及乙酸铵(纯度≥99%)为国产试剂。乙二胺四乙酸钠(EDTA)抗凝全血样本采自杭州第一人民医院。

标准溶液的配制:用20 mmol/L盐酸配制7.4 mmol/L的Hcy储备液,分装后保存于-20 ℃,使用时根据需要配制成所需浓度的标准工作液。用20 mmol/L盐酸配制3.7 mmol/L的homocystine-D8,分装后保存于-20 ℃,使用时根据需要配制成所需浓度的工作液。准确称取适量的DTT,制备成500 mmol/L的DTT溶液,需现用现配。

1.2 DBS的制备及样本前处理

将抗凝全血滴于滤纸片上,直径约12 mm,室温下晾干,保存于-20 ℃冰箱,待测。

样本的前处理根据文献[17]报道的方法有所改动,用打孔器取3 mm直径的DBS样本2片至96孔深孔板中,加入20 μL 3.7 μmol/L的homocystine-D8内标工作液、20 μL 500 mmol/L还原剂(DTT),振荡2 min,常温下静置15 min。homocystine-D8经DTT还原二硫键后,成为单体氘代标记同型半胱氨酸Hcy-D4。加入400 μL的萃取剂(含体积分数为0.1%的FA、体积分数为0.05%的TFA的乙腈溶液),振荡2 min,以4 000 r/min的速度离心5 min,吸取70 μL上清液至96孔进样板中,用LC-MS/MS检测。除打孔采样外,其他步骤均在Bravo自动化液体处理平台上进行,整个前处理过程在1 h内即可完成。

1.3 LC-MS/MS分析

选用Phenomenex CN柱为色谱柱,前端配Agilent在线过滤器。流动相A为水(含体积分数为0.1%的FA),流动相B为乙腈(含体积分数为0.1%的FA)。分离方法采用A-B(25∶75,v/v)等度洗脱,流速为0.4 mL/min,进样体积为1.0 μL。柱温箱温度为25 ℃。质谱采用电喷雾离子源(ESI),正离子采集,多反应监测(MRM)模式检测。干燥气温度为150 ℃,流速为16 L/min;鞘气温度为350 ℃,鞘气流速为11 L/min;毛细管电压为3 000 V;喷嘴电压为500 V;离子漏斗(iFunnel)高、低射频电压分别为150 V和60 V。质谱采集参数见表 1。

表 1 Hcy和Hcy-D4的质谱采集参数 Table 1 MS parameters of Hcy and Hcy-D4
2 结果与讨论
2.1 色谱-质谱条件的优化

Hcy分子极性较强,在C18色谱柱上没有保留,因此选择对极性分子保留较强的Phenomenex CN柱作为色谱柱。为了获得更佳的灵敏度、峰形及保留时间,优化流动相的添加成分(乙酸铵及FA),优化流动相中乙腈的比例及流速,最终确定等度洗脱,流动相为水(含体积分数为0.1%的FA)与乙腈(含体积分数为0.1%的FA),比例为25∶75(v/v),洗脱时间为2 min。

在LC参数确定的条件下,为获得最佳的S/N值,对质谱条件进行优化,确定了雾化气的温度及流速、鞘气的温度及流速、毛细管电压、加速电压、碰撞能量及定性、定量离子等质谱参数,使样本中Hcy离子化效率及质谱响应达到最佳,优化的质谱条件见1.3节。

2.2 方法学验证
2.2.1 标准曲线及检出限

为准确定量检测DBS样本中的Hcy,采用基质添加的方法制备标准曲线。取抗凝全血,平均分为9份,分别添加不同浓度的Hcy标准品(0.00、1.16、2.31、4.62、9.25、18.50、37.00、74.00和148.00 μmol/L)。混匀后按照1.2节所述方法进行DBS样本的制作及前处理,每个浓度重复测定5次。以扣除空白后抗凝全血中Hcy和Hcy-D4的峰面积比值为y、以添加的Hcy的浓度为x(μmol/L)绘制标准曲线,结果显示Hcy在1.16～148.00 μmol/L范围内线性关系良好,线性方程为y=0.136x+0.138,R2=0.994。

由于全血中含有内源性的Hcy,本试验以内标Hcy-D4评估检出限(LOD)。在空白抗凝全血中添加不同浓度的homocystine-D8,混匀并制备DBS,前处理步骤在1.2节所述内容的基础上略有改变(添加内标步骤变为以20 μL 20 mmol/L盐酸替代20 μL 3.7 μmol/L的homocystine-D8),之后按1.3节所述方法进行LC-MS/MS分析。结果显示检出限为0.12 μmol/L(S/N=3),定量限为0.46 μmol/L(S/N=10)。图 1是Hcy-D4浓度分别为0.12、0.46和7.40 μmol/L的MRM图。由于人血清中Hcy正常值范围为5～15 μmol/L,所以能满足DBS样本中Hcy的检测。

图 1 不同浓度Hcy-D4的多反应监测提取离子色谱图 Fig. 1 MRM extracted ion chromatograms of the Hcy-D4 with different concentrations
2.2.2 精密度和回收率

取抗凝全血,分别添加5.00、10.00和100.00 μmol/L的Hcy标准品,按本方法制备DBS样本并经前处理后进行LC-MS/MS分析。每天重复测定5次,连续测定5天。日内RSD为1.9%～4.6%,日间RSD为1.5%～7.1%,精密度良好。平均回收率为(103.0±4.97)%～(112.0±2.13)%。验证了检测方法的准确性,结果见表 2。

表 2 Hcy的精密度和回收率(n=5) Table 2 Precisions and recoveries of Hcy (n=5)
2.2.3 样本稳定性

DBS样本稳定性:取1份全血样本,按照1.2节所述方法制备成DBS样本,分别储存于-20、4、22和37 ℃,放置0(只储存于22 ℃)、1、2、3、4、5、6和14天。按本方法进行前处理后，使用LC-MS/MS进行分析。在不同时间测得不同温度下Hcy含量的RSD依次为3.5%、12.9%、10.6%和10.1%,结果显示,DBS在-4、-20、22和37 ℃下14天内的稳定性良好。

前处理后的样本稳定性:取1名患者的全血样本平均分为3份,制备添加不同浓度(4.62、18.5和74 μmol/L)Hcy标准品的DBS,按照1.2节所述方法进行前处理,处理后的样本在4 ℃下(LC-MS/MS进样器设定温度)分别放置0、24和48 h后,按照1.3节进行LC-MS/MS分析。各加标浓度下Hcy含量的RSD依次为4.0%、0.9%和1.1%,结果显示处理后的样本在4 ℃下48 h内的稳定性良好。

2.2.4 与常规方法的比较

用临床诊断中常规使用的Beckman Coulter AU5821全自动生化仪检测47个样本血浆中的Hcy,与其对应的抗凝全血按本方法制备DBS样本并经前处理后进行LC-MS/MS检测。以Beckman Coulter AU5821全自动生化仪检测的血浆中Hcy的浓度为x(μmol/L)、以LC-MS/MS检测的DBS中Hcy的浓度为y(μmol/L)绘制线性方程,得到y=0.5577x+2.9937,R2=0.9818(见图 2)。常规实验方法检测血浆中的Hcy通常采用循环酶法,其基本原理是通过特异性的Hcy甲基转移酶和S腺苷同型半胱氨酸水解酶催化同型半胱氨酸转变为S腺苷同型半胱氨酸,S腺苷同型半胱氨酸再水解生成同型半胱氨酸,使反应循环进行,以放大检测信号。用本实验方法检测DBS中的Hcy,即全血中的Hcy,在样本方面区别于常规实验方法检测血浆中的Hcy。全血中血浆的体积约占50%～60%,文献[14]报道全血的血细胞中Hcy的含量远低于血浆中的Hcy,可以忽略不计,因此DBS中的Hcy检测值应为血浆检测值的50%～60%。此推论同本试验中线性方程的斜率数值0.5577一致。该方法快速准确,每天可处理近800个样本。

图 2 LC-MS/MS检测DBS样本中Hcy浓度与传统生化方法 检测血浆中Hcy浓度的比较(n=47) Fig. 2 Comparison of Hcy concentrations in the DBS samples determined by LC-MS/MS and in the plasma samples determined by conventional biochemistry assay (n=47)
3 结论

本研究建立了一种基于液相色谱-串联质谱检测DBS样本中Hcy的方法,通过DBS样本采样可以避免检测血浆中Hcy时随分离时间延长检测值增高的问题。该方法简单方便,生物稳定性好,方便储存和运输。该方法在前处理过程使用Bravo自动化液体处理平台及高通量的96孔板降低人为误差,提高了检测精密度与检测效率。使用同位素内标避免了基质效应,使用LC-MS/MS检测实现了高准确度和高灵敏度。日分析样本近800个,实现了高通量分析。经验证,与临床检测方法的相关性好。该方法适用于有限采血条件下Hcy的检测及Hcy相关疾病的大规模筛查。

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