在线加压溶剂微提取-湍流色谱-高效液相色谱法同时测定管花肉苁蓉中3种苯乙醇苷


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宋青青^1,2, 刘瑶^1,2, 张玲玲^1,2, 周利^1,2, 屠鹏飞¹, 宋月林¹

1. 北京中医药大学中药现代研究中心, 北京 100029;
2. 北京中医药大学中药学院, 北京 100102

收稿日期：2016-02-20

基金项目：国家自然科学基金项目(81403073);中医药行业科研专项(201507002)

通讯联系人： Tel:(010)64286100,E-mail:syltwc2005@163.com

摘要：建立了在线加压溶剂微提取-湍流色谱-高效液相色谱(online PLME-TFC-HPLC)法,并将其应用于管花肉苁蓉中松果菊苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷3种苯乙醇苷类成分含量的同时测定。微量样品粉末(0.5 mg)置于空预柱芯中并用正相硅胶填充,得到提取池后装入预柱套(Security Guard^TM)。将预柱套置于70℃柱温箱中,将一根长聚醚醚酮(PEEK)管线(1000 mm×0.13 mm)连于预柱套末端,采用0.1%(v/v)甲酸水为提取溶剂,以2.5 mL/min的速度流经PEEK管线,产生高压,实现管花肉苁蓉的在线加压溶剂微提取,通过TurboFlow cyclone色谱柱在线净化和富集。引入两个电子六通阀,将整个分析过程分为提取阶段和洗脱阶段,并在洗脱阶段将TurboFlow cyclone色谱柱中的分析物反冲至Capcell PAK C₁₈ AQ分析柱上,以0.1%(v/v)甲酸水-乙腈为流动相进行梯度洗脱,以340 nm为检测波长同时定量分析松果菊苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷3种苯乙醇苷类成分。结果表明,3种苯乙醇苷类在1~200 mg/L范围内线性良好,相关系数r均大于0.999,定量限分别为0.50 mg/L(松果菊苷)、0.25 mg/L(毛蕊花糖苷)和0.38 mg/L(异毛蕊花糖苷),加标回收率为83.13%~114.00%,相对标准偏差为1.89%~13.34%。该方法简便、快速、可靠,不仅节约了药材和溶剂的使用量,而且极大地简化了前处理方法,省时省力,同时显著降低了化学成分在提取过程中降解的几率,适用于管花肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物的含量测定。

关键词：在线加压溶剂微提取湍流色谱高效液相色谱苯乙醇苷管花肉苁蓉

Simultaneous determination of three phenylethanoid glycosides in Cistanche tubulosa by online pressurized liquid microextraction-turbulent flow chromatography-high performance liquid chromatography

SONG Qingqing^1,2, LIU Yao^1,2, ZHANG Lingling^1,2, ZHOU Li^1,2, TU Pengfei¹, SONG Yuelin¹

1. Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China ;
2. School of Chinese Meteria Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China

Received: 2016-02-20

Foundation Item: National Natural Science Fundation of China (No. 81403073); Quality Guarantee System of Chinese Herbal Medicines (No. 201507002).

^* Corresponding author. Tel:(010)64286100,E-mail:syltwc2005@163.com

Abstract: An online pressurized liquid microextraction-turbulent flow chromatography-high performance liquid chromatography (online PLME-TFC-HPLC) platform was configured for simultaneous determination of three phenylethanoid glycosides in Cistanche tubulosa. Micro amount powder of crude material (0.5 mg) was mixed with clean diatomaceous earth and packed into a vessel which then was put into a hollow guard column. To generate high temperature and high pressure, a long polyetheretherketone (PEEK) tube (1000 mm×0.13 mm) was linked to the end of the hollow guard column that was warmed in the column oven (70℃). The water containing 0.1% (v/v) formic acid acted as the extraction solvent and was delivered at 2.5 mL/min. Two electronic 6-port/2-channel valves were responsible for dividing the whole program into extraction and elution phases. The analytes were purified and enriched in a TurboFlow cyclone column, and back-flushed onto a Capcell PAK C₁₈ AQ column under a gradient elution program with 0.1% (v/v) aqueous formic acid-acetonitrile at the elution phase. The ultraviolet wavelength was set at 340 nm to monitor phenylethanoid glycosides. The calibration curves for the three phenylethanoid glycosides revealed good linearities in the range of 1-200 mg/L (r>0.999). The limits of quantification (LOQs) were 0.50 mg/L (echinacoside), 0.25 mg/L (acteoside) and 0.38 mg/L (isoacteoside). The spiked recoveries were in the range of 83.13%-114.00% with the relative standard deviations (RSDs) between 1.89% and 13.34%. All the results indicated that this method is facile, efficient, reliable, and advantageous at time, labor, solvent, and material savings. The method also reduces the degradation risks and is suitable for the determination of phenylethanoid glycosides in Cistanche tubulosa.

Key words: online pressurized liquid microextraction (online PLME) turbulent flow chromatography (TFC) high performance liquid chromatography (HPLC) phenylethanoid glycosides Cistanche tubulosa

肉苁蓉为传统名贵药材,素有“沙漠人参”之称,是历代补肾壮阳方剂中使用频度最高的补益药物之一。自2005年起,《中华人民共和国药典》中肉苁蓉的基原植物在荒漠肉苁蓉的基础上增加了管花肉苁蓉(拉丁名为Cistanche tubulosa (Schenk) R. Wight,英文名为Cistanche tubulosa)。管花肉苁蓉是目前肉苁蓉属植物中野生资源最丰富、产量最大的一种^[1]。肉苁蓉中主要含有苯乙醇苷类化合物,该类化合物是肉苁蓉化学成分及药理活性研究报道中最多的一类,也是肉苁蓉补肾阳、抗衰老、增强记忆力等功能的主要活性成分。中药分析中通常采用回流、超声等提取方法对样品进行前处理,这些方法不仅溶剂和药材消耗量大,而且费时、费力^[2-5]。因此建立新型的提取方法,减少前处理步骤,对于管花肉苁蓉中苯乙醇苷类的定量分析及在提取过程中可能发生的成分降解尤为重要。目前国内外对于管花肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物的含量测定研究多采用HPLC法^[6-8]。周晔等^[9]将HPLC-MS法应用于肉苁蓉中7种有效成分的含量测定。

本研究建立了在线加压溶剂微提取的方法,采用水作为提取溶剂,通过升温和加压改变水的理化性质,从而提高其溶解和提取能力,实现微量样品的直接定量分析。结合湍流色谱技术(turbulent flow chromatography,TFC),在高流速条件下形成湍流,通过扩散溶解、尺寸排阻、柱层析等技术将大分子物质滤掉,保留小分子物质^[10]。基于湍流色谱的前处理技术已广泛应用于鸡肉中抗生素^[11]、尿液中甾体激素^[12]、血清中药物^[13]等的检测中。本文所建方法实现了样品处理和检测的同时进行,不仅节约了药材和溶剂的使用量,而且省去了前处理步骤,省时省力,更加环保。并且在线操作环境封闭,避免了提取过程中由于与空气接触引发的成分降解。该方法所建立的装置简单可靠,可有效提高样品分析通量,减少操作误差。本文利用建立的在线加压溶剂微提取-湍流色谱-高效液相色谱法(online PLME-TFC-HPLC)同时对管花肉苁蓉中松果菊苷(echinacoside)、毛蕊花糖苷(acteoside)和异毛蕊花糖苷(isoacteoside)3种苯乙醇苷类成分的含量进行了测定。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

高效液相色谱仪(2台LC-20AD泵,SIL-20A自动进样器,CTO-20A柱温箱,SPD-M20A紫外检测器,DGU-20A脱气机,CBM-20A控制器,2个FCV-12AH切换阀,日本岛津公司); Milli-Q超纯水净化系统(美国Millipore公司); METTLER XS105型电子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)。Strata C₁₈-E固相萃取柱、空预柱芯(4.0 mm×3.0 mm)和Security Guard^TM预柱套(美国Phenomenex公司),TurboFlow cyclone色谱柱(50 mm×1.0 mm)和TurboFlow C18-P XL色谱柱(50 mm×1.0 mm)(美国Thermo Fisher公司),Capcell PAK C18 AQ色谱柱(250 mm×4.6 mm,3.0 μm)(日本Shiseido公司),Discovery HS F5-3色谱柱(150 mm×3.0 mm,3.0 μm)和Ascentis Express F5色谱柱(150 mm×2.1 mm,2.7 μm)(美国Sigma-Aldrich公司),聚醚醚酮(PEEK)管线(美国Agilent公司)。

松果菊苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷均由本实验室制备、鉴定所得,并经HPLC-二极管阵列检测器(DAD)检测含量,纯度均大于98%。色谱级甲酸、甲醇、乙腈均购自美国Thermo Fisher公司,水为超纯水。11批管花肉苁蓉药材(CT-1～CT-11)经北京大学药学院屠鹏飞教授鉴定,均为列当科植物管花肉苁蓉干燥带鳞叶的肉质茎,样本存放于北京中医药大学中药现代研究中心。

1.2 标准溶液以及样品制备

精密称取适量松果菊苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷标准品,分别溶于二甲基亚砜(DMSO)中,配成4.0 g/L的标准品储备液。精准吸取各标准品储备液适量,混匀,用50%(v/v)甲醇水溶液逐步稀释,制备系列浓度的混合标准溶液。

11批次管花肉苁蓉药材均在40 ℃烘箱中干燥处理4天,粉碎后过24目筛,取过筛粉末用于实验。

1.3 Online PLME-TFC-HPLC

1.3.1 提取净化

精密称取0.5 mg管花肉苁蓉粉末(CT-4)置于空预柱芯内,用正相硅胶填充,两端用滤膜密封,制成在线提取池,将其装入匹配的预柱套内,放入70 ℃的柱温箱中。将一根PEEK管线(1000 mm×0.13 mm)连于预柱套出口处,在提取溶剂高速通过时提供约13 MPa的高压,并置于柱温箱外以降低进入色谱柱的溶液温度。提取溶液为0.1%(v/v)甲酸水(流动相A),流速为2.5 mL/min,提取时间为3.0 min。净化富集色谱柱为TurboFlow cyclone。Online PLME-TFC-HPLC系统提取净化示意图及阀切换状态如图 1a所示,提取过程由自动进样器吸取10.0 μL 0.1%(v/v)甲酸水触发。

图 1 在线加压溶剂微提取-湍流色谱-高效液相色谱系统示意图 Fig. 1 Schematic diagrams of online pressurized liquid microextraction-turbulent flow chromatography-high performance liquid chromatography (online PLME-TFC-HPLC) system a. extraction phase; b. elution phase. DAD: diode array detector.

1.3.2 液相色谱条件

分析柱为Capcell PAK C₁₈ AQ柱,所用流动相A为0.1%(v/v)甲酸水,流动相B为乙腈,检测波长为340 nm。流动相梯度洗脱程序:0～3 min,100%A,2.5 mL/min; 3.00～3.01 min,0～10%B,2.5～1.0 mL/min; 3.01～5.00 min,10%B～15%B,1.0 mL/min; 5.00～10.00 min,15%B～20%B,1.0 mL/min; 10.00～25.00 min,20%B～25%B,1.0 mL/min; 25.00～30.00 min,25%B～30%B,1.0 mL/min; 30.10～35.00 min,100%A,1.0 mL/min。Online PLME-TFC-HPLC系统洗脱示意图及阀切换状态如图 1b所示。

2 结果与讨论

2.1 系统条件优化

2.1.1 提取条件优化

水作为绿色分析溶剂,可以使得分析过程更加环保。Online PLME-TFC-HPLC的提取过程采用高温、高压,使水的氢键减弱,界面张力降低,并有效提高水分子进入固体基质的速度,不仅提高了对大极性成分的提取效率,同时也具备了从药材中有效提取中、小极性化合物的能力^{[14, 15]}。提取效率的决定因素包括提取温度、提取流速、PEEK管线尺寸等,本试验通过单变量试验对各因素分别进行了优化。将提取液从PEEK管线接出,用HPLC分析提取效率。对比了不同提取温度(50、60和70 ℃)、不同提取流速(1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mL/min)、不同长度的PEEK管线(500、600、700、800、900、1000和1100 mm)和不同提取时间(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和5.0 min)对提取效率的影响。最终选取PEEK管线长度为1000 mm,提取溶剂流速为2.5 mL/min,温度为70 ℃,提取时间为3.0 min。在此条件下可得到较高的提取效率。

2.1.2 TFC柱的选择

在线固相萃取柱在该系统中起到净化提取液并富集分析物的作用。对比了常见的Strata C₁₈-E固相萃取柱、TurboFlow C₁₈-P XL色谱柱和TurboFlow cyclone色谱柱,结果表明,基于湍流色谱技术的TFC色谱柱能更好地保留不同极性的化合物,且洗脱时在分析柱上得到的峰形更好;而TurboFlow cyclone色谱柱比TurboFlow C₁₈-P XL色谱柱能更好地保留极性大的化合物,所以选择TurboFlow cyclone色谱柱为在线固相萃取柱。在线提取所得溶液以2.5 mL/min的流速注入TFC柱(见图 1a),可形成湍流,能更好净化样品、保护色谱柱。

2.1.3 色谱条件的优化

分析比较了水-乙腈、水-甲醇和0.1%(v/v)甲酸水-乙腈作为流动相对目标化合物的保留和峰形的影响,结果表明使用水-乙腈为流动相时,苯乙醇苷类化合物的色谱峰均有拖尾,因此采用0.1% (v/v)甲酸水-乙腈作为流动相。该条件下的峰形及分离度最佳(见图 2)。由于在洗脱程序30～35 min时用100%A平衡色谱柱和TFC柱,所以需要可以耐纯水的色谱柱。Capcell PAK C₁₈ AQ色谱柱在100%水系溶液下仍有良好的重现性,能够满足此分析条件。管花肉苁蓉成分在Capcell PAK C₁₈ AQ柱上分离效果较好,而在耐100%水的Discovery HS F5-3和Ascentis Express F5色谱柱上色谱峰峰形拖尾。

图 2 采用不同检测方法的混合标准溶液和管花肉苁蓉色谱图 Fig. 2 Chromatograms of mixed standard solution and Cistanche tubulosa sample using different methods 1. echinacoside; 2. acteoside; 3. isoacteoside.

2.2 方法学验证

将预柱芯用正相硅胶填充,通过自动进样器吸取10.0 μL混合标准溶液,注入1.3节所构建的系统中进行方法学考察。由于对管花肉苁蓉样品直接进行分析,无需对经过前处理的样品进行储存,未进行考察稳定性的试验。

2.2.1 线性范围、检出限和定量限

按1.2节所述方法用甲醇-水(1∶1,v/v)溶液配制质量浓度分别为200.0、100.0、80.0、50.0、25.0、10.0、5.0、2.5、1.0 mg/L的混合标准溶液。以目标化合物峰面积(y)为纵坐标、质量浓度(x,mg/L)为横坐标绘制标准曲线,得到线性回归方程。各化合物在各自线性范围内相关系数r均大于0.999。以3倍信噪比和10倍信噪比分别作为各化合物的检出限和定量限,结果见表 1。

表 1 3种苯乙醇苷类化合物的线性方程、检出限与定量限(n=5) Table 1 Linear equations,limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) for the three phenylethanoid glycosides (n=5)

2.2.2 重复性

分别称取5份0.5 mg同一批次的管花肉苁蓉(CT-2)粉末,分别用正相硅胶填充后,置于online PLME-TFC-HPLC系统中分析,计算各化合物峰面积的RSD值(见表 1),各化合物重复性良好,RSD值均不大于8.72%。

2.2.3 日内精密度与日间精密度

取高(80.0 mg/L)、中(25.0 mg/L)、低(5.0 mg/L)3个质量浓度的混合标准溶液,分别连续进样6次,考察日内精密度。将该溶液分别连续进样3天,每天进样3次,考察日间精密度。按1.3节所述条件进行测定,松果菊苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的日内RSD值分别为0.48%～0.79%、0.53%～3.17%和0.35%～0.98%,日间RSD值分别为1.32%～2.49%、2.10%～4.00%和2.86%～3.62%,表明精密度良好。

2.2.4 回收率

分别称取9份0.5 mg同一批次的管花肉苁蓉(CT-2)粉末,同时按低、中、高3个浓度配制松果菊苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷混合标准溶液。按1.3节所述方法将粉末置于预柱芯内,通过自动进样器吸取混合标准溶液进行分析,计算回收率(见表 2)。

表 2 3种苯乙醇苷的加标回收率及相对标准偏差(n=3) Table 2 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the three phenylethanoid glycosides (n=3)

2.3 与超声法对比验证

为验证该方法的有效性,参考中国药典方法,将超声提取^{[6, 16]}所得样品注入HPLC系统进行分析。具体方法如下:取1.0 g管花肉苁蓉(CT-4)粉末,加入10.0 mL 50%(v/v)甲醇水溶液超声30 min,以10000 r/min的速度离心10 min,取5.0 μL上清液进样,按1.3.2节所述方法进行分析(图 2c和2d)。由图 2可知,本文所建立的方法与常规的超声提取法结合HPLC分析得到的各峰分离度基本一致。

2.4 实际样品测定

采用本方法对采集的11批管花肉苁蓉中的松果菊苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷进行测定。测定结果(见表 3)显示,松果菊苷含量在管花肉苁蓉中为主要成分,此含量测定结果与文献^[12]中常规的HPLC方法所得结果一致。

表 3 11批管花肉苁蓉(CT-1～CT-11)中3种苯乙醇苷成分含量 Table 3 Contents of the three phenylethanoid glycosides in 11 batches of Cistanche tubulosa (CT-1 to CT-11)

3 结论

建立了在线加压溶剂微提取-湍流色谱-高效液相色谱同时测定管花肉苁蓉中3种主要的苯乙醇苷类化合物(松果菊苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷)的方法。该方法不仅省去了繁杂的前处理步骤,而且实现了实时快速分析,避免了样品在提取过程中成分的改变。同时,用水作药材的提取溶剂,减少了有机溶剂的使用。该方法只需微量药材便可进行定性定量分析,更适用于珍贵药材的检测分析。

参考文献

[1]	Tu P F, Chen Q L, Jiang Y, et al, Modern Chinese Medicine,2015, 17 (4):349. 屠鹏飞, 陈庆亮, 姜勇, 等, 中国现代中药,2015, 17 (4):349.
[2]	Mustafa A, Turner C, Anal Chim Acta,2011, 703 (1):8.
[3]	Ramos L, Kristenson E M, Brinkman U A, J Chromatogr A,2002, 975 :3.
[4]	Camel V, Analyst,2001, 126 (3):1182.
[5]	Liu Y, Xiu X Y, Wang W Y, Journal of Anhui Agricultural University,2015, 42 (2):294. 刘洋, 修效友, 汪维云, 安徽农业大学学报,2015, 42 (2):294.
[6]	Lu D Y, Zhang J Y, Yang Z Y, et al, J Sep Sci,2013, 36 (12):1945.
[7]	Guo W H, World Journal of Intergrated Traditional and Western Medicine,2014, 9 (5):496. 郭卫红, 世界中西医结合杂志,2014, 9 (5):496.
[8]	Tian Y B, Yang G A, Huang W J, et al, Journal of Anhui Agricultural Sciences,2015, 43 (33):171. 田玉彪, 杨广安, 黄维杰, 等, 安徽农业科学,2015, 43 (33):171.
[9]	Zhou Y, Li W, Han L F, et al, Spectroscopy and Spectral Analysis,2015, 35 (4):1056. 周晔, 李薇, 韩立峰, 等, 光谱学与光谱分析,2015, 35 (4):1056.
[10]	Zhang L, Kong X H, He Q, et al, Chinese Journal of Chromatography,2014, 32 (6):559. 张璐, 孔祥虹, 何强, 等, 色谱,2014, 32 (6):559.
[11]	Bousova K, Senyuva H, Mittendorf K, J Chromatogr A,2013, 1274 :19.
[12]	Guo F, Shao J, Liu Q, et al, Talanta,2014, 125 (11):432.
[13]	Marzinke M A, Breaud A R, Clarke W, Clin Chim Acta,2013, 417 :12.
[14]	Carr A G, Mammucari R, Foster N R, Chem Eng J,2011, 172 (1):1.
[15]	Kilpelainen P O, Hautala S S, Byman O O, et al, Green Chem,2014, 16 (6):3186.
[16]	Pharmacopoeia Commission of People's Republic of China, Pharmacopoeia of People's Republic of China, Part 1. Beijing:Chinese Medical Science and Technology Press,2010 :126. 国家药典委员会, 中华人民共和国药典, 一部. 北京:中国医药科技出版社,2010 :126.