色谱  2016, Vol. 34 Issue (6): 583-590   PDF (2894 KB)    
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丁博
王志元
谢建军
曾广丰
李荀
佘志刚
陈文锐
QuEChERS前处理技术联合液相色谱-四极杆飞行时间质谱法检测保健食品中24种违禁降血糖、降血压和降血脂药物
丁博1,2, 王志元1, 谢建军1, 曾广丰1, 李荀1, 佘志刚2, 陈文锐1     
1. 广东出入境检验检验局检验检疫技术中心, 广东 广州 510623;
2. 中山大学化学与化学工程学院, 广东 广州 510275
收稿日期：2016-02-21
基金项目：广州市科信局科学技术项目(201300000062).
通讯联系人： Tel:(020)38290345,E-mail:chenciq119@163.com.
摘要：建立QuEChERS前处理技术联合液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱(LC-Q-TOF-MS)测定保健食品中24种违禁降血糖、降血压和降血脂药物成分的分析方法。采用响应曲面设计实验优化了前处理萃取条件:乙腈与水体积比、硫酸镁与氯化钠用量和吸附剂C18用量。依据目标物的一级母离子的精确质量数、同位素丰度比、二级碎片离子的精确质量数和色谱保留时间等信息定性、定量地分析降血糖、降血压和降血脂违禁药物。结果显示,QuEChERS前处理技术与LC-Q-TOF-MS分析方法检测保健食品中违禁降血糖、降血压和降血脂药物的选择性好,检出限和定量限低,灵敏度高,线性关系良好(r2>0.997)。将该方法用于15个保健食品样品的检测,发现5个样品含有违禁药物。
关键词： QuEChERS     液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱     降血糖     降血压     降血脂     保健食品     响应曲面设计    
Determination of 24 antihyperglycemic, antihypertensive and antihyperlipidemic drugs illegally added in health food samples by liquid chromatography-quadrupole- time of flight mass spectrometry
DING Bo1,2, WANG Zhiyuan1, XIE Jianjun1, ZENG Guangfeng1, LI Xun1, SHE Zhigang2, CHEN Wenrui1     
1. Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center, Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Guangzhou 510623, China ;
2. School of Chemistry and Chemical Engineering, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China
Received: 2016-02-21
Foundation Item: Guangzhou Project of Science & Technology Planning (No.201300000062).
* Corresponding author. Tel:(020)38290345,E-mail:chenciq119@163.com.
Abstract: A liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry (LC-Q-TOF-MS) coupled with QuEChERS pretreatment analytical method was established for the identification and quantification of 24 antihyperglycemic, antihypertensive and antihyperlipidemic drugs illegally added in health foods. The extraction conditions, including the volume ratio of ACN and H2O, the amount of MgSO4 & NaCl used, and the amount of C18 used, were optimized by response surface methodology. The quantitative analysis was based on the accurate masses of the first level of parent molecular ions and isotopic patterns, and accurate masses of the second level of fragment ions and a priori known retention times. The established QuEChERS pretreatment method combined with LC-Q-TOF-MS was effective for the simultaneous characterization and quantification of antihyperglycemic, antihypertensive and antihyperlipidemic drugs with high selectivity, a high linearity (r2>0.997) in wide range, low LODs and LOQs, and high precision. The method was successfully applied to determinate the drugs illegally added in the fifteen health food samples, the five of which were positive samples.
Key words: QuEChERS     liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry (LC-Q-TOF-MS)     antihyperglycemic drugs     antihypertensive drugs     antihyperlipidemic drugs     health foods     response surface methodology    
 

随着社会生活水平与饮食的发展,社会上出现了越来越多的肥胖人群。肥胖的人面临高血糖、高血压和高血脂症状的风险比较突出。为了降低患高血糖、高血压和高血脂疾病,人们日益关注降血糖、降血压和降血脂类保健食品,希望通过饮食来降低患高血糖、高血脂和高血压等疾病的概率。保健食品是通过食用含有天然功效活性成分的食品[1, 2]来调节人们的机体,促进人体健康,比如常见的深海鱼油,其含有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸,具有改善血糖、血压和血脂等功能[3];然而国内外研究显示,市场上销售的各类降血糖、降血压和降血脂等保健食品非法添加西药的问题比较严重[4-8]。因此,检测保健食品中非法添加降血糖、降血压和降血脂类药物的研究具有非常重要的意义和价值。

QuEChERS最早由Anastassiades等[9]报道用来检测蔬菜与水果中的农药残留,作为一种高效前处理技术广泛应用于食品中农药残留检测分析领域[10]。近年来有报道[11, 12]QuEChERS技术被用于提取分离大豆中异黄酮类化合物,可见QuEChERS前处理技术具有广泛的适应性。本研究选择常见的24种降血糖、降血压和降血脂类药物(见图 1)为研究对象,考察固相萃取和QuEChERS等前处理技术提取保健食品中非法添加药物,建立了液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱(LC-Q-TOF-MS)检测保健食品中违禁药物的分析方法。

图 1 24种降血糖、降血压和降血脂药物 Fig. 1 24 kinds of antihyperglycemic antihypertensive and antihyperlipidemic drugs
1 实验部分
1.1 仪器与试剂

Triple TOF 5600+高分辨质谱仪(美国AB Sciex公司),HPLC 20AD高效液相色谱仪(日本岛津公司),Atlantis T3色谱柱(100 mm×3 mm,3 μm，美国Waters公司),4k-15离心机(美国Sigma公司),VORTEX 4涡旋混匀器(德国IKA公司),Milli-Q超纯水装置(美国Millipore公司)。

格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列吡嗪、格列美脲、甲苯磺丁脲、烟酸苯乙福明、盐酸二甲双胍、盐酸吡格列酮、盐酸可乐定、尼非地平、尼莫地平、尼群地平、酒石酸美托洛尔、阿替洛尔、盐酸普奈洛尔、盐酸地尔硫卓、利血平、辛伐他汀、洛伐他汀、烟酸、苯扎贝特、氟伐他汀钠、非诺贝特等标准品(纯度大于98%,德国Dr. Ehrestorfer公司),甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯,美国Fisher公司),无水硫酸镁、氯化钠(分析纯,广州化学试剂厂),石墨化碳(GCB)吸附剂(美国Sigma公司),C18吸附剂(德国CNW公司),微孔滤膜(0.22 μm,天津津腾公司),实验用水为经Milli-Q纯水系统制得的超纯水(电阻率为18.2 MΩ·cm)。

1.2 实验方法
1.2.1 溶液配制

标准储备液：准确称量24种降血糖、降血压和降血脂药物标准品各5.00 mg,用甲醇溶解，配制质量浓度为0.50 g/L的标准储备液；根据需要用甲醇稀释成质量浓度为20 mg/L的混合标准工作液,于棕色瓶中4 ℃下保存,有效期3个月。

标准溶液：用甲醇稀释20 mg/L混合标准工作液,配制质量浓度分别为1、5、10、25、50、100、200、400 μg/L混合标准溶液，待LC-Q-TOF-MS测定。

1.2.2 液相色谱条件

色谱柱:Atlantis T3色谱柱(100 mm×3 mm,3 μm);进样体积:5 μL;流速:0.5 mL/min;柱温:40 ℃;梯度洗脱:流动相A为0.1%(v/v)甲酸水溶液,流动相B为乙腈;梯度洗脱程序:初始为10%B,于12 min内升至100%B,保持2.5 min;于0.5 min内降至10%B,保持1 min。

1.2.3 质谱条件

离子源:电喷雾(ESI)和大气压化学电离(APCI)复合源;正离子扫描方式;APCI源连接AB Sciex公司自动校正系统(CDS),每10个样品自动校正1次,APCI正离子校正液流速:0.3 mL/min;气帘气压力:275.8 kPa (40 psi);离子源雾化气压力:344.7 kPa (50 psi);离子源加热辅助气压力:344.7 kPa (50 psi);离子源温度:500 ℃;离子源电压:5 500 V。一级TOF-MS扫描准确质量范围:m/z 100～1 000;数据采集时间:100 ms;去簇电压(DP):100 V;碰撞电压(CE):10 V;二级数据信息依存获取质谱(IDA-MS)扫描准确质量范围:m/z 50～1 000; DP：100 V; CE：(35±15) V;高灵敏模式;数据采集时间:50 ms;信号阈值:100 cps; IDA实验每循环采集6次数据,动态背景减法扣除。

1.2.4 数据分析方法

所有质谱数据采用AB Sciex公司的Analyst TF 1.6软件采集,数据在PeakView 2.0、MasterView 2.0和MultiQuant 3.0等软件上定性及定量处理分析。根据TOF-MS和IDA-MS高分辨质谱获得化合物的准确相对分子质量,定性、定量分析保健食品中添加的违禁降血糖、降血压和降血脂药物。

1.2.5 QuEChERS前处理方法

准确称量200.0 mg的保健食品样品,置于50 mL离心管中,依次加入15 mL乙腈-水(70∶30,v/v)溶液、1.0 g硫酸镁、0.25 g氯化钠、50 mg C18吸附剂,立即在振荡器上振荡1 min；接着在室温条件下超声15～20 min,于8 000 r/min下离心5 min,转移上清液,定容至25.00 mL刻度管中；取1 mL样液过0.22 μm有机滤膜,滤液待上机测试。

1.2.6 响应曲面设计

实验前期研究发现超声时间对违禁药物的提取影响差别不显著,为此实验设计超声时间为15 min;另外,实验应用响应曲面设计方法优化QuEChERS与超声辅助提取联合方法的硫酸镁与氯化钠用量、乙腈与水体积比、C18用量等3个萃取条件。应用Box Behnken设计模型设计萃取因素条件。该设计模型的理论[13]为:

(1)

其中:Xi为独立变量值,X0为在中心位置的值,xi、ΔX为变量截距值。三因素响应因素设计变量分别是乙腈与水体积(X1,%(v/v))、硫酸镁与氯化钠用量(X2,g)、C18用量(X3,mg)。

实验测试所得数据,通过二次非线性方程模型预测理论优化最佳萃取条件;模型预测方程[14]为:

(2)

其中:Y为模型预测值,b0、Ai、Aii和Aij为预测方程系数,由实验值推测出来。Design-expert 8.05软件处理响应曲面所得数据,进行ANOVA方差分析评价数据结果。

2 结果与讨论
2.1 违禁药物定性、定量分析依据

采用LC-Q-TOF-MS方法检测分析保健食品样品中非法添加的24种降血糖、降血压和降血脂等违禁药物,根据目标违禁药物一级母离子的精确质量数、同位素丰度比、二级碎片离子的精确质量数和色谱保留时间等信息进行定性、定量分析。24种目标化合物定量分析的质谱依据见表 1。

表 1 24种药物定量分析的质谱数据 Table 1 Mass fragmentation patterns for the identifications of the 24 drugs
2.2 前处理方法选择

保健食品的样品基质比较复杂,选择固体粉末和胶囊油状两种基质的样品考察固相萃取技术和QuEChERS技术两种前处理方法的效果。

本实验考察了采用C18和HLB两种固相萃取小柱处理保健食品样品的效果。样品为40 μg/L的24种混合药物标准溶液,以样品加标回收率考察方法优劣,结果见图 2。结果显示采用固相萃取方法处理保健食品中非法添加的24种降血糖、降血压和降血脂药物的回收率均在35%以下,由此可见固相萃取前处理方法不适合应用于保健食品中非法添加的24种药物的检测。

图 2 采用固相萃取方法处理鱼油胶囊时24种违禁药物的加标回收率 Fig. 2 Recoveries of the 24 illicit drugs spiked in fishoil capsules by the solid phase extraction method

本实验考察了QuEChERS技术与超声辅助萃取技术相结合的前处理方法提取保健食品中24种降血糖、降血压和降血脂违禁药物的效果,同样采用加标回收率验证方法的优劣,结果见图 3。实验所用样品同样为40 μg/L的24种混合药物标准溶液。同时考察GCB和C18两种吸附剂净化样品对回收率的影响。结果显示选择C18吸附剂净化样品时,除了盐酸可乐定的回收率在56.8%～73.2%之间外,其他目标物的加标回收率在86.5%～112.3%之间;使用GCB吸附剂净化样品时,盐酸可乐定、酒石酸美托洛尔和辛伐他汀的回收率分别为52.8%、67.3%和59.8%,其他目标分析物的回收率在78.4%～114%之间。由此可见,使用C18吸附剂时目标物的加标回收率明显高于GCB吸附剂。故以下实验均选择使用C18吸附剂的QuEChERS技术与超声辅助萃取技术相结合的前处理方法。

图 3 采用QuEChERS方法处理鱼油胶囊时24种违禁药物的加标回收率 Fig. 3 Recoveries of the 24 illicit drugs spiked in fishoil capsules by the QuEChERS method
2.3 响应曲面设计优化前处理条件

为了获得QuEChERS技术前处理方法提取保健食品中违禁降血糖、降血压和降血脂等药物的最佳萃取条件,利用响应曲面设计优化乙腈与水的体积比(X1,%)、硫酸镁与氯化钠用量(X2,g)、C18用量(X3,mg)等提取条件。实验首先单因素考察超声时间对目标分析违禁药物回收率的影响,结果发现超声10、15和20 min对回收率影响差别不显著,为此实验选择超声时间为15 min。响应曲面设计优化实验结果见表 2。

表 2 Box-Behnken设计及实验结果(3种代表性药物的提取回收率) Table 2 Box-Behnken design and experimental results (the extraction recoveries of three representative drugs)

实验选择格列苯脲、尼非地平和非诺贝特的回收率为代表分析对象,采用ANOVA方差分析评价数据结果。

对格列本脲的分析结果显示,乙腈与水体积比的一次因素和二次因素为显著影响因素,检验P值分别是0.025 0和0.043 8,Lack of Fit F-value的P值为0.759 4,拟合相关系数R2为0.75。由此得到格列本脲的拟合曲线预测方程为:

(3)

对尼非地平的分析结果显示,乙腈与水体积比的一次因素和硫酸镁与氯化钠用量的二次因素为显著影响因素,检验P值分别是0.015 6和0.009 3,Lack of Fit F-value的P值为0.536 3,模型的P值为0.032 8,显示显著水平,拟合相关系数R2为0.84,由此得到尼非地平的拟合曲线预测方程为:

(4)

对非诺贝特的分析结果显示,乙腈与水体积比的二次因素为显著影响因素,检验P值是0.008 9,Lack of Fit F-value的P值为0.833 6,拟合相关系数R2为0.80,由此得到非诺贝特的拟合曲线预测方程为:

(5)

为了进一步表示模型中三因素及三因素交互效应对降血糖、降血压和降血脂等违禁药物萃取的影响,实验得到相应曲面设计的三维立体影响因素(见图 4)。响应曲面设计模型根据实验所得降血糖、降血压和降血脂等违禁药物的回收率进行模型建立与预测,获得最佳的因素水平组合,结果发现硫酸镁与氯化钠用量为1.0 g和0.25 g、乙腈与水体积比为80∶20、C18吸附剂用量为50 mg,该因素水平组合下可以获得最佳的降血糖、降血压和降血脂等违禁药物的回收率,为此实验检测样品时,均采用此因素水平组合条件处理样品。

图 4 响应曲面设计实验结果的三维图 Fig. 4 3D plots showing the correlative effects of different parameters 3D ANOVA results of a,d and g for glibenclamide; b,e and h for nifedipine; c,f and i for fenofibrate.
2.4 方法的线性范围、检出限与定量限

LC-Q-TOF-MS检测保健食品中24种降血糖、降血压和降血脂违禁药物的提取离子流色谱图见图 5;结合目标分析物一级母离子的精确质量数、同位素丰度比、二级碎片离子的精确质量数和色谱保留时间等信息进行定量分析保健食品中24种违禁药物。分别选择固体粉末和胶囊油状两种基质的样品,以3倍信噪比对应的浓度和10倍信噪比对应的浓度确定24种降血糖、降血压和降血脂违禁药物的检出限(LOD)和定量限(LOQ)。目标分析物的线性方程、相关系数、检出限和定量限见表 3。

图 5 24种药物的提取离子流色谱图 Fig. 5 Extracted ion chromatograms of the 24 drugs
表 3 24种药物的线性关系、检出限和定量限 Table 3 Linear relationships,LODs and LOQs of the 24 drugs

结果显示,24种违禁药物均有较好的线性方程,相关系数R2都在0.997以上,LOD在0.1～4.0 μg/L之间,LOQ在1～12 μg/L之间。由此可见,QuEChERS技术与超声辅助萃取技术相结合的前处理方法联合LC-Q-TOF-MS可以很好地应用于保健食品中24种违禁药物的检测。

2.5 回收率

为了进一步验证QuEChERS技术与超声辅助萃取技术相结合的前处理方法提取保健食品中违禁药物分析方法的可行性与准确性,实验随机选择保健样品进行加标回收率验证,加标水平分别为6.25、12.5和25.0 μg/g,结果见表 4。

表 4 样品中目标物的加标回收率(n=3) Table 4 Spiked recoveries of target analytes in the sample (n=3)

由回收率结果可见,QuEChERS技术与超声辅助萃取技术相结合基本可以用于保健食品中非法药物检测领域,除了盐酸二甲双胍,其他23目标分析物的回收率基本符合分析方法要求。

2.6 实际样品测定

采用建立的QuEChERS与超声辅助萃取前处理技术联合LC-Q-TOF-MS方法检测了15个保健食品中非法添加的降血糖、降血压和降血脂类药物,结果显示15个保食品样品中有5个样品检出非法添加违禁药物。1号样检出了烟酸(4.02 μg/g),3号样检出了烟酸(1.89 μg/g)和洛伐他汀(6.51 μg/g),8号样检出了尼群地平(1.26 μg/g),9号检出了烟酸(2.24 μg/g)和盐酸二甲双胍(0.84 μg/g),14号样检出了尼群地平(2.38 μg/g)。

3 结论

本文建立了QuEChERS前处理技术联合LC-Q-TOF-MS测定保健食品中24种违禁降血糖、降血压和降血脂药物成分的分析方法。采用响应曲面设计实验优化了前处理萃取条件。依据目标物的一级母离子的精确质量数、同位素丰度比、二级碎片离子的精确质量数和色谱保留时间等信息定性、定量地分析降血糖、降血压和降血脂违禁药物。结果显示,QuEChERS前处理技术与LC-Q-TOF-MS分析方法检测保健食品中违禁降血糖、降血压和降血脂药物的选择性好,检出限和定量限低,灵敏度高,线性关系良好(r2＞0.997)。应用本文建立的方法对15个保健食品样品进行检测,发现5个样品含有违禁药物。

参考文献
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