2012年底爆发的“酒鬼酒塑化剂事件”中塑化剂被查出超标2.6倍,将酒类食品中塑化剂含量的食品安全问题推到了风口浪尖。国家食品安全风险评估中心根据国际通用原则和方法,依据我国居民食品消费量和主要食品中塑化剂含量数据,对成人饮酒者的健康风险进行了评估。国家食品安全风险评估专家委员会根据评估结果认为,白酒中邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)和邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的含量分别在5和1 mg/kg以下时,对饮酒者的健康风险为可接受水平。
由于酒中含有的乙醇对邻苯二甲酸酯类化合物具有较好的溶解性,因此酒类中存在这类化合物污染的风险,需要对其进行监测。目前文献中有关邻苯二甲酸酯的测定方法主要有离子迁移谱法[1]、高效液相色谱法[2-4]、气相色谱-质谱法[5-8]、气相色谱-串联质谱法[9-15]和液相色谱-串联质谱法[16-21]。上述检测技术中,离子迁移谱技术尚未普及;液相色谱检测灵敏度低;气相色谱-质谱法和气相色谱-串联质谱法分析邻苯二甲酸二异壬酯(DINP)、邻苯二甲酸二异癸酯(DIDP)和邻苯二甲酸二异辛酯(DINOP)时,会出现很多异构体峰,准确定量有一定难度。液相色谱-质谱联用法因具有液相色谱高效分离和质谱高灵敏度的双重优势,被广泛应用于酒类及其他食品中邻苯二甲酸酯类化合物(PAEs)的测定[16-21]。
液相色谱大量使用塑料管路,管道中必然存在迁移的邻苯二甲酸酯,而且迁移量和仪器品牌、仪器管路的新旧程度等都密切相关。已有的文献[22]报道都是采取扣除空白迁移量的方法对邻苯二甲酸酯进行检测,对于管路比较新的仪器,邻苯二甲酸酯的迁移量很大,会对样品的检测结果影响较大。本研究以24种邻苯二甲酸酯为目标化合物,建立了使用超高压液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)的测定方法,将Eclipse XDB-C18柱接于液相色谱的混合器和进样器之间作为前吸附柱,有效地吸附管路中的本底邻苯二甲酸酯,使本底化合物在被测物出峰之后的3 min左右才被洗脱出来,无需扣除空白就能保证检测的准确性。
API4000+型串联四极杆质谱仪(美国AB公司),配Agilent 1260 UPLC超高压液相色谱仪(美国Agilent公司);Kinetex-C18柱(100 mm×4.6 mm,2.6 μm),Eclipse XDB-C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)(美国菲罗门公司);Spursil C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm,北京迪马公司);Oasis HLB Glass柱(200 mg,5 mL,美国Waters公司);C18固相萃取柱(200 mg,5 mL,美国Agilent公司);C8固相萃取柱(200 mg,5 mL,美国Waters公司); ProElut CARB/PSA固相萃取柱(1 g,6 mL,北京迪马公司);自动吸引器(天津市利迈豪工贸有限公司);固相萃取装置(美国Supelco公司);氮吹仪(美国Caliper公司)。
24种邻苯二甲酸酯标准品均购自美国Sigma公司,相关信息见表 1。甲醇、乙腈、丙酮和甲酸均为色谱纯,购自德国Merck公司。市售12°葡萄酒、18°白酒、40°洋酒、58°白酒。超纯水由Milli Q系统(美国Millipore公司)制得。
分别准确称取24种邻苯二甲酸酯标准品各25 mg,用正己烷溶解并定容至25 mL,配制标准储备液,于4 ℃冰箱中避光保存。准确移取适量邻苯二甲酸酯标准储备液,用甲醇配制适当浓度的混合标准工作液。
色谱柱为Kinetex-C18柱;将Eclipse XDB-C18柱接于液相色谱的混合器和进样器之间,用于推迟管路中的邻苯二甲酸酯本底化合物流出时间;柱温:35 ℃;进样量:10 μL;流速:0.3 mL/min。流动相A: 0.1%(体积分数,下同)甲酸水溶液;流动相B:甲醇。梯度洗脱程序:0～2.0 min,40%B～80%B; 2.0～6.0 min,80%B; 6.1～10.0 min,80%B～95%B; 10.1～18.0 min,95%B～98%B; 18.1～28.0 min,98%B～40%B。外标法定量。
多反应监测(MRM)模式;电喷雾电离正离子(ESI+)模式;气帘气(氮气)压力(CUR): 0.2 MPa;离子源喷雾电压(IS): 5 500 V;雾化温度(TEM): 550 ℃;雾化气(氮气)压力(GAS1): 0.33 MPa;加热辅助气(氮气)压力(GAS2): 0.33 MPa。
准确称取混合均匀的样品1 g,置于25 mL烧杯中,根据样品中乙醇的体积分数加水稀释,混匀,使乙醇的体积分数小于5%。将稀释液加入事先活化好的Oasis HLB Glass柱,流速控制在1 mL/min内,之后用5 mL 5%甲醇水溶液淋洗,待淋洗液流干后,用5 mL乙酸乙酯洗脱,收集洗脱液,吹氮浓缩至近干,用甲醇定容至1 mL,供LC-MS/MS分析。
比较了C18固相萃取柱、C8固相萃取柱、ProElut CARB/PSA固相萃取柱和Oasis HLB Glass柱的富集、净化效果。结果表明,C18固相萃取柱和C8固相萃取柱对空白加标样品中DMP和DEP的吸附明显大于其他22种邻苯二甲酸酯,平均回收率为35.2%～50.5%;另外,C18固相萃取柱和C8固相萃取柱要求前处理过程中SPE柱必须保持润湿,不能干涸,对处理过程要求比较高,控制难度大。ProElut CARB/PSA固相萃取柱是石墨化碳和乙二胺基-N-丙基填装的双层柱,溶液的pH值不仅能改变目标物的存在状态,而且能改变石墨化碳表面官能团的类型和密度,进而影响对目标物的吸附量[23],而且ProElut CARB/PSA固相萃取柱对萃取时间、解吸溶剂等都有较高的要求,因此不适合使用。由于邻苯二甲酸酯类是弱极性或中等极性物质,同时测定多种邻苯二甲酸酯时,其在反相介质上的保留特异性差别较大,样品处理过程中极性较大的邻苯二甲酸酯类化合物损失严重,回收率不理想。而由于HLB (hydrophile-lipophile balance)介质具有良好的两亲特性,能在一定程度上克服反相介质的不足,24种塑化剂的回收率最高(67.3%～109.3%),因此选择Oasis HLB Glass柱进行富集、净化。
比较5 mL甲醇和5 mL乙酸乙酯的洗脱效果,发现乙酸乙酯洗脱效果较甲醇好,各组分的回收率为67.3%～109.3%,所以选择乙酸乙酯作为洗脱剂。
将乙腈、甲醇和乙酸乙酯作为定容溶液,分别进行试验。甲醇溶液在液相色谱-质谱联用仪上的色谱图显示其基线平稳、杂质峰少、干扰小、峰形尖锐对称、灵敏度高,最终选择甲醇为定容溶剂。
分别配制5 mL质量浓度均为0.2 mg/L的24种邻苯二甲酸酯的2.5%、5%、7.5%、10%和15%无水乙醇水溶液,分别用Oasis HLB Glass柱富集、净化。结果显示,在2.5%和5%无水乙醇水溶液下,被测物的回收率基本稳定;在7.5%无水乙醇水溶液下,回收率下降很快,平均回收率仅有36.2%～45.9%;而在15%无水乙醇水溶液下,回收率仅有6.9%～19.1%。说明乙醇体积分数超过5%之后,邻苯二甲酸酯类化合物会随溶液一起流出,在Oasis HLB Glass柱上没有保留,因此测定前应将样品中乙醇的体积分数稀释到5%或以下。
分别对0.1 mg/L的24种邻苯二甲酸酯标准溶液进行分析,在正离子模式下进行母离子全扫描,确定各种化合物的母离子,然后对各母离子进行子离子全扫描,选取丰度较强、干扰较小的两对子离子为定性和定量离子,在MRM模式下优化去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)等质谱参数。24种邻苯二甲酸酯化合物的质谱检测条件见表 2。
对于管路较新的仪器,邻苯二甲酸酯的迁移量很大,如采取扣除空白迁移量的方式,会对样品的检测影响较大。本研究采用前吸附技术解决该问题,其工作原理是当平衡色谱柱时,在流动相起始比例中水相比例较高,这时从仪器管路迁移出来的本底化合物随着流动相溶液从二元泵进入预吸附柱并被预吸附柱保留。当分析样品时,样品随自动进样器进样,随即进入色谱分析柱中进行分离。梯度洗脱时,由于流动相梯度变化,有机相的比例提高,预吸附柱中保留的本底化合物被洗脱出来,也进入色谱分析柱中,但因本底化合物与样品中的目标化合物进入色谱分析柱的时间不同,从而得到不同的保留时间,使目标化合物与本底化合物实现色谱分离,成功排除系统本底化合物的干扰。为了更有效地降低系统本底化合物的含量,也可尝试不使用前吸附柱,而是对液相色谱系统进行改造,将液相色谱流动相储液瓶至泵头等处的聚四氟乙烯管路更换成金属管路。本实验所用仪器改造图见图 1。
一般仪器管路中的邻苯二甲酸酯本底化合物为DBP。不同的仪器和不同的吸附柱其本底化合物迁移的时间不同,本研究尝试了同样长度、内径和粒径(150 mm×4.6 mm,5 μm)的两种不同填料的C18色谱柱(Eclipse XDB-C18和Spursil C18),样品中本底化合物的保留时间和目标化合物的保留时间推迟3～7 min。试验表明,相同仪器和相同吸附柱本底化合物保留时间的RSD≤10%。另外,因为本底化合物被吸附了之后再进入分离柱,此时的液相色谱条件产生了变化,本底化合物不会像标准品一样是尖锐的色谱峰,而是一个峰宽相对较大的色谱峰。本研究中,将Eclipse XDB-C18柱接于液相色谱的混合器和进样器之间,因为分离柱和吸附柱内径都是4.6 mm,Eclipse XDB-C18柱填料直径是5 μm,因此加入Eclipse XDB-C18柱后,系统压力从0.76 MPa增加至0.93 MPa,并没有太大增加。接入吸附柱前后空白试剂中的DBP和接入吸附柱之后标准溶液中DBP的MRM图见图 2。可见前吸附柱能有效地吸附管路中的邻苯二甲酸酯本底化合物,使邻苯二甲酸酯本底化合物推迟3 min左右才被洗脱出来,保证了检测的准确性。
在不同型号仪器上试验了前吸附技术的通用性,结果表明不同仪器上的系统压力均未见过激反应,色谱柱死体积增加也不大,保留时间推迟3～7 min,因此这种前吸附技术适用于多种仪器。在选择吸附柱时可以使用内径较大、颗粒度较大、柱长较短的C18色谱柱(如50 mm×4.6 mm,5 μm或150 mm×4.6 mm,5 μm),这样不会造成色谱柱死体积过大和系统压力大幅增加的情况。
在色谱分离条件的选择上,分别试验了不同的色谱柱、流动相体系和梯度洗脱系统。最后使用Kinetex-C18柱作色谱柱,采用0.1%甲酸水溶液和甲醇作为流动相进行梯度洗脱,按1.3.1节所述条件进行分离,可以达到较好的分离效果。24种邻苯二甲酸酯在色谱柱上有较好的保留,与基体杂质可以很好地分离,色谱峰形对称,满足质谱检测的要求。总离子流色谱图见图 3。
24种邻苯二甲酸酯的线性方程见表 3,在线性范围内线性关系良好,符合定量要求。在空白酒类样品中添加24种邻苯二甲酸酯标准溶液,按信噪比(S/N)等于3和S/N等于10分别计算检出限和定量限,结果见表 3。
分别向12°葡萄酒、18°白酒、40°洋酒、58°白酒基体中添加24种PAEs,做空白添加回收试验,其中DAP的添加水平为0.01、0.05、1.0 mg/L,其余23种化合物添加水平均为0.1、1.0、10 mg/L,各添加水平分别做6次平行试验,结果见表 4。可见目标物的加标回收率为75.4%～118.2%,相对标准偏差(RSD)为4.0%～11.2%,方法的精密度及回收率均满足定量检测的要求。
本文建立的前吸附技术-超高压液相色谱-串联质谱法测定酒中24种邻苯二甲酸酯含量的方法能有效排除管路中邻苯二甲酸酯本底的干扰,具有较低的定量限和较好的重复性,不但简单、灵敏、稳定,而且选择性高、抗干扰能力强。
2016,
Vol. 34 Issue (7): 673-680
PDF (955 KB)
2016,
Vol. 34 Issue (7): 673-680
PDF (955 KB)