食品过敏原是指食品中存在的能够选择性激活人体细胞,诱导产生特异性抗体应答、引起变态反应的抗原性物质^[1]。一般来说,食品过敏原为蛋白质或糖蛋白,分别属于不同的蛋白质家族^[2]。目前大约有160多种食品含有可以导致过敏反应的过敏原,大约有260种分子被标记为食品过敏原^[3]。流行病学研究显示,90%的食物过敏是由8类食物引起的,通常被称为“8大”致敏食物,包括奶类、蛋类、大豆、花生、坚果、小麦、鱼类和贝类^[2]。食物过敏的症状包括荨麻疹、呕吐和哮喘等,严重时甚至会危及生命。在世界卫生组织报告的威胁人类健康的因素中,食物过敏排在第4位^[4]。在近年来国内外食品有关的警示通报中过敏原问题数量排名第2,仅次于微生物污染,成为国际普遍关注的行业热点。食品过敏原问题在不同国家、不同地区有着各不相同的理解和关注程度。国外发达国家对食品过敏原已经有着诸多的报道和研究,甚至有较具体的立法,如欧盟2003/89/EC指令对食品生产和经销者进行监管^[1],欧盟2006/142/EC指令则列出了14种必须明确标注的食品过敏原^[2]。而我国对食品过敏原的研究和关注较少,食品过敏原问题也是目前我国食品出口企业被外方通报的最主要问题。食品安全标签法规《预包装食品标签通则》中没有强制要求进行过敏原标示^[5],消费者对由此引发的过敏反应也没有引起足够的重视。随着国家对食品安全工作的深入开展以及促进进出口食品贸易的发展,食品过敏原研究的重要性日益凸显。

目前广泛使用的食品过敏原分析方法主要有酶联免疫(ELISA)法、聚合酶链式反应(PCR)法和质谱(MS)法。ELISA法的基础是抗原或抗体的固定化及酶标记,最常用的是双抗体夹心ELISA法,将抗体结合在固相载体表面使其与样品蛋白质反应,加入酶标记的二抗来检测已结合于固相载体表面的样品蛋白质,由此对样品中蛋白质过敏原进行定量分析^[4]。ELISA法已经发展成商业试剂盒的形式,但是目前大部分试剂盒都是针对单一食品中的单一过敏原设计的,无法对食品中多种蛋白质过敏原同时进行高通量检测,并且容易发生交叉反应^[2]。PCR法基于对致敏食品中特异的DNA片段进行扩增,目标物质明确,假阳性率降低,但是检测物是DNA而非致敏蛋白质^[1]。质谱法既克服了免疫学方法存在的通量低和交叉干扰的弊端,也克服了PCR技术不能直接检测致敏蛋白质的缺点,能够对蛋白质和多肽进行明确鉴定,并且可以同时检测多种过敏原^{[1, 3]}。

食品中过敏原蛋白质的质谱检测研究按照技术路线主要可以分为“top down”方法和“bottom up”方法^[2]。“top down”方法是将完整蛋白质离子化后直接进入高分辨质谱进行检测,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是该方法常用的分析平台。通过完整蛋白质分析能够鉴定出相关的蛋白质亚型和翻译后修饰位点,但给出的信息相对有限,分析通量也相对较低。“bottom up”方法是目前蛋白质组学分析最为常用的方法,该方法首先用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白质切成小相对分子质量的多肽片段混合物,利用一级质谱(MS)或串联质谱(MS/MS)技术检测混合物中各多肽的相对分子质量或碎片信息,将得到的一系列多肽相对分子质量或碎片离子的数据输入数据库,搜索与之相对应的已知蛋白质,实现蛋白质的鉴定,即肽质量指纹图谱法(PMF)或肽段碎片离子鉴定法(PFI)。然后根据检测结果结合相关蛋白质组学软件挑选出符合要求的一条或多条特征肽段,建立多反应监测(MRM)方法进行定量分析,工作流程如图 1所示。本文依据蛋白质分析流程,主要从过敏原蛋白质的前处理、肽段色谱分离、过敏原蛋白质的定性鉴定和定量检测4个方面,对食品过敏原蛋白质检测的研究进展进行总结和评述。

图 1

Fig. 1

图 1 基于质谱的食品过敏原蛋白质分析工作流程图[2] Fig. 1 Mass spectrometry-based techniques for food allergenic protein analysis[2] 2D-LC: two dimensional liquid chromatography; AC: affinity chromatography; PMF: peptide mass fingerprint; PFI: peptide fragments identification.

1 食品样品中过敏原蛋白质的前处理

1.1 过敏原蛋白质的提取和纯化

蛋白质提取一般选择pH 8.0左右的缓冲盐溶液,较为常用的是碳酸氢铵、Tris-HCl和磷酸盐缓冲液,提取方法一般为先将致敏食品制成固体粉末或均质液体,加入缓冲液,于60 ℃水浴振荡提取数小时^[6-10],得到过敏原蛋白质的粗提液。由于食品基质的复杂性会影响色谱、质谱检测的灵敏度和选择性,蛋白质粗提后往往需要进一步的纯化和富集。

目前常用的蛋白质纯化方法有有机溶剂沉淀法、固相萃取法、超滤法以及磁珠捕获法。Ceglie等^[6]比较了冷丙酮沉淀法、己烷/丙酮沉淀法、二乙基乙醚/三氯乙酸沉淀法、碳酸氢铵提取法、Tris缓冲液提取法和Bligh-Dyer提取法对蛋白质回收率的影响,最终选择冷丙酮沉淀法对特级初榨橄榄油中隐含的榛子油蛋白质进行提取,再经酶解,用MALDI-TOF-MS平台测定了榛子油中主要的过敏原蛋白质Cor a 9,Cor a 11和Cor a 1。Mattarozzi等^[7]考察了使用C18固相萃取(SPE)柱、聚合物基体的固相萃取(PVPP)柱、体积排斥纯化(SE)柱对蛋白质回收率的影响,用SE柱纯化可以得到最高的蛋白质回收率。Bignardi等^[8]将蛋白质提取物通过一个6 kDa限制的Bio-Spin 6尺寸排阻色谱柱离心纯化,实现了黑巧克力和饼干样品中5种坚果类过敏原(Ana o 2,腰果;Cor a 9,榛子;Pru 1,杏仁;Jug r 4,核桃;Ara h 3/4,花生)的高灵敏检测。该纯化方法仅需约10 min的时间,与常规滤膜纯化方法^[9]相比可以将检测灵敏度提高约1个数量级。Careri等^[10]采用免疫磁珠捕获的方法进行了花生过敏原蛋白质Ara h 3/4的分离富集。将蛋白A包被的磁珠作为载体,抗Ara h 3/4单克隆抗体作为选择性捕获分子,结合微波辅助酶解,实现了早餐谷类食品中的痕量Ara h 3/4过敏原的快速检测。

1.2 过敏原蛋白质的酶解

目前大部分的蛋白质谱分析工作都采用“bottom up”方法,需将蛋白质酶解为多肽进行质谱检测,因此提高酶解效率对于蛋白质的定性确证和定量检测具有重要意义。由于蛋白质是以三维结构的形式存在的,为了将蛋白质高级结构内部的酶切位点暴露,被蛋白质酶识别并水解,首先需要对蛋白质进行变性,使蛋白质舒展。Mattarozzi等^[7]考察了3种蛋白质变性剂对强化红酒中的酪蛋白和卵清蛋白检测的影响。比较了使用尿素、硫脲和十二烷基磺酸钠(SDS)作为蛋白质变性剂以及变性剂加入时间的影响。结果表明在蛋白质浓缩后加入终浓度为6 mol/L的尿素、2 mol/L的硫脲和0.2%(w/v)的SDS作为变性剂使蛋白质变性,经还原和烷基化后,得到较高的酶解效率。但是尿素等变性剂对胰蛋白酶活性的抑制作用较大,还会有副反应的发生。大量使用的高浓度盐会干扰质谱分析的离子化过程,从而导致分析物峰强度降低和离子源污染,致使检测无法进行^[11]。常规蛋白质酶解方法耗时较长,一般需数小时^[7-9],缩短酶解时间,提高工作效率一直是研究者们重点关注的问题。Carrera等^[12]发展了一种快速直接检测鱼类过敏原β-小清蛋白(β-PRVBs)的新方法。该方法利用β-小清蛋白的稳定性,采用加热纯化、超声加速酶解的策略,纯化过程需45 min,酶解过程仅需2 min,整个检测流程缩短至2 h以内,并且该方法适用于可能含有鱼类β-小清蛋白的所有食品的检测。

2 过敏原蛋白质的色谱分离

过敏原蛋白酶解后形成一系列多肽的混合物,对于复杂多肽混合物的质谱检测来说,良好的色谱分离是基本前提和保障。由于多肽是由20种氨基酸以不同组成和排列方式形成的化合物,而各种氨基酸的极性即疏水性不同,因此可以采用反相色谱进行分离^[13]。Bignardi等^[9]比较了C18填充色谱柱和硅胶基质的C18整体柱在分离谷物和饼干中的5种坚果过敏原(Ana o 2,腰果;Cor a 9,榛子;Pru 1,杏仁;Ara h 3/4,花生;Jug r 4,核桃)时的色谱性能。结果表明在色谱峰形、分辨率、分析时间和选择性上,C18填充色谱柱具有更好的分析性能。纳流液相色谱具有高分离度、低样品消耗和高灵敏度等优势,已经成为蛋白质组学分析中的重要分离手段。Nitride等^[14]采用纳升级超高效液相色谱-电喷雾-四极杆-飞行时间质谱(nanoHPLC-ESI-Q-TOF)实现了榛子中公认的过敏原11S globulin Cor a 9的分离和鉴定。毛细管色谱(CapLC)能够实现优于传统HPLC系统的保留时间重现性、分辨率以及灵敏度。Monaci等^[15]首次采用CapLC结合电喷雾质谱实现了白葡萄酒中的痕量澄清剂酪蛋白的分离和鉴定。

二维色谱(2D-LC)是将分离机理不同而又相互独立的两支色谱柱串联起来构成的分离系统。通常采用两种不同的分离机理分析样品,在一维分离系统中不能完全分离的组分,可能在二维系统中能得到更好的分离,分离能力、分辨率得到极大的提高。2D-LC能够解决目标蛋白质与其他共洗脱组分之间的干扰问题,并且能够实现并行分析。Julka等^[16]提取出了天然的内源性大豆过敏原蛋白质Gly m 4,利用2D-LC将Gly m 4与其亚型和其他基质分开,结合紫外(UV)/MS检测系统首次实现了内源性的完整Gly m 4蛋白质的定量分析。Kuppannan等^[17]在2D-LC-UV/MS平台上实现了大豆过敏原Gly m 4和豆类疏水蛋白质HPS的同时定量检测。

3 过敏原蛋白质的确证

基于质谱技术的蛋白质鉴定基本原理是将蛋白质酶解成多肽,将多肽混合物色谱分离后进行MS或MS/MS分析,得到的数据与蛋白质数据库进行比对,从而确证蛋白质。质谱用于蛋白质的序列测定主要分为两种方法:PMF和PFI。PMF的理论基础是认为每个蛋白质经过酶解成为长短不一的肽段后,在同一时间获得所有肽段的相对分子质量,而形成一个肽段分子质量图谱,这个图谱对蛋白质应该是专一的、特异的,因此称为肽质量指纹图谱。该方法不需对图谱进行人工解析,只需将实验获得的PMF与蛋白质数据库中蛋白质的理论PMF比对,就可以鉴定该蛋白质。该方法比传统方法速度快、通量高,是最早用于大规模蛋白质鉴定的质谱方法,也是目前最简便的蛋白质鉴定方法之一。PFI方法是利用串联质谱技术,选择某一质荷比肽段进行MS/MS分析,将产生的碎片离子的数据进行数据库检索,实现蛋白质的鉴定。由于MS/MS的结构分析功能,可以获得检测到的每一肽段的序列。因此,根据MS测得的精确分子质量和MS/MS所得的序列信息,通过蛋白质数据库的检索,无疑大大增加了蛋白质鉴定的准确性。这一方法多在具有碰撞诱导解离(CID)功能的质谱中进行。常用的谱库搜索软件和食品过敏原数据库列于表 1。

表 1 (Table 1)

表 1 常用谱库搜索软件和食品过敏原数据库 Table 1 Common library search software and databases for food allergens Software Database Name Website Name Website SEQUEST fields.scripps.edu/sequest Uniport www.uniprot.org Mascot www.matrixscience.com Allallergy www.allallergy.net PeptIdent www.expacy.ch/tools Allergome www.allergome.org ProteinProspector prospector.ucsf.edu Allergenonline www.allergenonline.org ProFound prowl.rockefeller.edu ADFS allergen.nihs.go.jp/ADFS PepFrag prowl.rockefeller.edu SDAP fermi.utmb.edu Pfind www.pfindstudio.com InformALL www.foodallergens.info

表 1 常用谱库搜索软件和食品过敏原数据库 Table 1 Common library search software and databases for food allergens

3.1 肽质量指纹图谱法

MALDI-TOF-MS是目前利用PMF方法鉴定蛋白质的主要技术平台。Cucu等^[18]利用该系统筛选乳清蛋白中经一系列加工过程后保持稳定不变的多肽标记物。将蛋白质经过不同的食品加工处理模拟反应,筛选出两种高度稳定的多肽片段,保证该方法能够适用于未标明乳清蛋白残留的加工食品的检测。该课题组^[19]还有目标地选择一些经过不同加工处理的豆类过敏原蛋白质,利用MALDI-TOF-MS作为筛选工具,鉴定在经过能够使过敏原蛋白质发生分子水平的变化(如美拉德反应或者蛋白质氧化反应)后仍然保持稳定的多肽标记物。Abdel等^[20]在MALDI-TOF-MS系统中利用蛋白质组学方法鉴定了雪蟹中的5种蛋白质,包括钙结合肌浆蛋白、精氨酸激酶、肌钙蛋白、α-肌动蛋白以及滑面内质网Ca²⁺腺苷三磷酸酶,并对精氨酸激酶进行了从头测序,经过一致性和同源性分析,识别出了精氨酸激酶的特征肽。Yadzir等^[21]首先利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对淡水虾中主要的过敏原原肌球蛋白和精氨酸激酶进行分离,然后利用MALDI-TOF-MS平台对经电泳分离后主要的过敏原蛋白质点进行鉴定。Liu等^[22]结合二维SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS平台进行了淡水鱼团头鲂中的过敏原蛋白烯醇酶和肌氨酸激酶的分离和鉴别。

3.2 肽段碎片离子鉴定法

近年来随着蛋白质数据库的快速增长和完善,使PFI方法的适用性大大增强。2006年,Shefcheck等^[23]在Q-TOF-MS平台上实现了黑巧克力中mg/kg级花生过敏原Ara h 1的鉴定。Chassaigne等^[24]在nano-ESI Q-TOF MS/MS平台上进行了热处理花生中过敏原蛋白质Ara h 1、Ara h 2和Ara h 3的鉴定。采用Waters Nanoease喷射器作为纳升喷雾源,通过一个零死体积的聚醚醚酮(polyetherether-ketone,PEEK)熔融石英毛细管微固定装置将从毛细管液相色谱中分离出的待测物直接引入纳升喷雾源中。将所得质谱数据进行谱库检索(Waters Protein Lynx Global Server 2.1),结合自动从头测序,鉴定出3种主要过敏原的大多数序列标签。通过对生花生和烘烤花生中过敏原蛋白酶解多肽的分析,得出5种特征肽可用于Ara h 1、Ara h 2和Ara h 3的鉴定和定量检测。Monaci等^[25]采用蛋白质组学分析方法,结合谱库搜索和从头测序,在毛细管液相色谱Q-TOF-MS系统进行了加工食品如饼干中牛奶过敏原α-S1酪蛋白的鉴定、确认和定量检测。同期,该课题组又进行了红酒中的牛奶过敏原α-酪蛋白和β-酪蛋白的鉴定和确认^[15]。傅里叶变换回旋共振质谱仪(FTICR-MS)由于具有高的分辨率和质量精度,在过敏原蛋白质谱检测中被用于精确质量数和分子组成的确定。Carrera等^[26]首先利用FTICR-MS确定完整鱼类过敏原小清蛋白亚型的精确质量数,并借助液相色谱-电喷雾离子阱质谱(LC-ESI-IT-MS/MS)平台和谱库搜索功能获得酶解多肽的氨基酸顺序,然后结合多肽的氨基酸顺序生成最终蛋白质的序列。作者利用该方法获得了25个小清蛋白亚型的氨基酸序列。但是由于FTICR-MS价格昂贵,操作复杂,限制了它在常规实验室的普及。

4 过敏原蛋白质的定量检测

目标过敏原的定量检测主要采用MRM方式,MRM的显著优点是具有较高的灵敏度和特异性,能够在复杂的样品中对靶微量蛋白质进行精确测定。要建立、评估和验证新的MRM方法,需要考虑几个关键步骤:(1)选择适当的特征肽。MRM方法通过对所选的特征肽进行定量检测,进而根据等量摩尔关系计算蛋白质的量。(2)选择合适的内标物。内标物应当在前处理时加入,用来监测整个分析过程中的损失及消除误差。(3)应当计算该方法的定量限、重现性、精密度、线性范围、准确度和回收率。最后还要考察方法的适用范围。

4.1 特征肽的选择

MRM定量最关键的步骤是选择适当的特征肽,特征肽一般应满足下列标准^[27]: (1)特征肽必须是目标蛋白质中所特有的,并且易被质谱系统检测;(2)特征肽为一段保守氨基酸序列,不会发生翻译后修饰;(3)所选择的特征肽不一定是质谱中信号最强的,但必须保证有较高的丰度,即使在含量比较低的情况下它们的信号也足够强,以保证能与其他肽或MS背景明确分开;(4)特征肽段必须非常稳定;(5)不会发生错切或漏切,酶解具有较高的重现性;(6)6～12个氨基酸长度的肽为优先选择。MRM方法的建立可以基于一个单一的特征肽,但最好每个蛋白质选2～3个肽,以实现更好的特异性。表 2列出了文献报道的“8大”最常见食物过敏原部分种类蛋白质的特征肽。

表 2 (Table 2)

表 2 常见过敏原蛋白质的特征肽 Table 2 Signature peptide of common food allergens Food Allergenic protein Signature peptides References Milk α-S1-casein HQGLPQEVLNENLLR,YLGYLEQLLR [9, 28, 29] α-S2-casein YIPIQYVLSR,NAVPITPTLNR [9, 29] β-casein VLPVPQK,AVPYPQR [14, 30, 28] κ-casein SPAQILQWQVLSNTVPAK [9] α-lactoalbumin VGINYWLAHK [31] β-lactoglobulin IDALNENK,IPAVFK [28] Egg ovalbumin GGLEPINFQTAADQAR,EDTQAMPFRV [2] ovotransferrin TDERPASYFAVAVAR,ATYLDCIK [12] Soybean β-conglycinin-α-chain ESYFVDAQPK,TISSEDKPFNLR [28] glycinin NLQGENEGEDKGAIVTVK,VFDGELQEGR [1] glycinin G2 VFDGELQEGGVLIVPQNFAVAAK [28] glycinin G4 AIPSEVLAHSYNLR [28] Cashew Ana o 2 VFGDEVR,ADIYTPEVGR [8, 9] Peanut Ara h 3/4 SPDIYNPQAGSLK,FNLAGNHEQEFLR [8] Ara h 1 VLLEENAGGEQEER,DLAFPGSGEQVEK [24, 25] Ara h 2 RQQWELQGDR [25] Ara h 3 SPDIYNPQAGSLK,SQSENFEYVAFK [25] Hazelnut Cor a 9 ADIYTEQVGR,QEWER [8, 9] Almond Pru 1 ALPDEVLANAYQISR,GNLDFVQPPR [1] Walnut Jur 4 LDALEPTNR,ADIYTEEAGR [8] Wheat Gluten QPQQPLPQPQQPF,RPQQPYPQPQPQY [29] α-amylase FIALPVPSQPVDPR,IALPVPSQPVDPR [30] Fish β-parvalbumins AVGAFSAAESFNYK,SGFIEEEELK [12] Crab arginine kinase LVSAVNEIEK [32]

表 2 常见过敏原蛋白质的特征肽 Table 2 Signature peptide of common food allergens

4.2 内标物的选择

特征肽选好后,内标物的选择也非常重要。内标物应具有与蛋白质本身相似的酶解效率和色谱、质谱行为,对被分析物不产生干扰,且在试样中不存在。内标物可以来自重组的过敏原、合成的肽段或者同位素标记的多肽,用合适的内标,可以优化LC-MS/MRM参数以提高目标肽的灵敏度。同位素标记法是MRM定量小分子最常用的方法。最好的内标物是同位素标记的蛋白质,然而这些蛋白质价格昂贵。同位素标记肽是一个现实的选择,同位素标记的肽与目标肽具有相似的理化和色谱性能以及电离效率。由于同位素的存在,同位素标记的肽与目标肽的质荷比稍有不同,因此可以与目标肽区分开来。同位素标记肽的主要缺点是成本较高。除同位素标记外,选择与目标肽的LC和MS参数一致的合成肽或者重组蛋白质也是不错的选择。Zhang等^[31]采用MRM模式质谱,创新性地选择具有相近色谱性能的非同位素合成肽作为内标,对21种婴幼儿配方奶粉和8种乳清蛋白粉中的α-乳白蛋白进行了定量检测,检出限为0.1 mg/g。内标物的选择对质谱定量的准确性起关键作用。Newsome等^[33]比较了分别使用¹⁵N标记的α-S1-casein完整蛋白质和同位素标记的多肽作为内标物时,烘焙食品中牛奶α-S1-casein定量的准确性。结果表明,使用¹⁵N标记的α-S1-casein完整蛋白质作为内标物可以提高正选择反应监测(SRM)模式质谱的准确度。

4.3 质谱定量平台及灵敏度

随着质谱技术的不断发展,以及为满足各种不同分析目的的需要,不同类型的质量分析器被用于食品中过敏原蛋白质定量,包括三重四极杆质谱(QqQ-MS)、四极杆-线性离子阱质谱(Q-LIT-MS)、Q-TOF-MS等^[34],表 3列出了常用的定量方法及灵敏度。

表 3 (Table 3)

表 3 基于质谱的过敏原蛋白质定量方法及其灵敏度 Table 3 MS-based methods for quantification of food allergens and their sensitivities Analytes Food matrix Analysis method Sensitivity (LOD) Reference Prunin,ovalbumin,11S globulin,α-S1-casein,Ara h1,Ara h 3/4,Glycinin,Jug r 1 bread LC-Q-Trap-MS 10-70 μg/g [1] α,β-Casein,ovalbumin fortified red wine LC-LIT-MS 0.5,0.01,0.8 mg/L [7] Ana o 2,Cor a 9,Pru 1,Ara h 3/4,Jug r 4 biscuit,dark chocolate LC-LIT-MS 0.1-1.3 mg/kg for biscuit [8] 5-15 mg/kg for chocolate Ana o 2,Cor a 9,Pru 1,Ara h 3/4,Jug r 4 biscuit,dark chocolate LC-LIT-MS 14-55 mg/kg for nut [9] Ara h 3/4 breakfast cereals LC-LIT-MS 3 mg/kg for peanuts [10] Ovalbumin,ovotransferrin β-casein,α-S1-casein,lysozyme wine LC-Q-TOF-MS 120 ng/L [12] α,β-casein wine CapLC-Q-TOF-MS 1 mg/L [15] Ara h 1 dark chocolate LC-Q-TOF-MS 20 mg/kg [23] Ara h 1,Ara h 2,Ara h 3 raw and roasted peanuts CapLC-Q-TOF-MS(nano-ESI) 10-40 ng/g [24] 2S Albumin,β-conglycinin,ovalbumin,ovotransferrin α-S1-casein,β-lactoglobulin cookie CapLC-LIT-MS 0.1,0.3,2 μg/g for milk,egg and soy,respectively [28] α-Lactalbumin infant formulas LC-QqQ-MS 0.10 mg/g [31] Tropomyosin airborne snow crab LC-QqQ-MS 3 nmol/L [32] α-S1-Casein baked goods LC-Q-Trap-MS 3 mg/kg [33] Hazelnut allergens chocolate LC-Q-Trap-MS 1 mg/kg [35] β-Lactoglobulin,β-casein,α-S2-casein,κ-casein baby foods breakfast cereals LC-QqQ-MS 1-2 mg/kg [36] Gluten red wine LC-Q-TOF-MS 10 mg/L [37] Gluten flour LC-QqQ-MS 1-30 pg/mg [38] α,β-casein,ovalbumin wine LC-Q-Tof-MS 2.5 pmol/L [39] LOD: limit of detection; LC: liquid chromatography; CapLC: capillary liquid chromatography; Q-Trap: quadrupole trap; LIT: linear ion trap; QqQ: triple quadrupole; Q-TOF: quadrupole time-of-flight; nano-ESI: nano-electrospray ionization tandem mass spectrometry.

表 3 基于质谱的过敏原蛋白质定量方法及其灵敏度 Table 3 MS-based methods for quantification of food allergens and their sensitivities

QqQ-MS是目前食品过敏原分析领域的主流检测仪。定量一般采用MRM方法,MRM方法很容易比较和标准化,检测肽时的灵敏度可达到10^-15 mol级别,对于相同前处理和酶解的样品,LC-MS/MRM比LC-MS/Q-TOF-MS的灵敏度高10倍左右。目前的研究结果已确认使用MRM-MS系统定量过敏原的检出限(LOD)和定量限(LOQ)要比基于抗体的方法低。Simonato等^[37]比较了用免疫和质谱检测方法分别检测红酒中残留的澄清剂谷蛋白的效果,结果表明,使用质谱方法的检出限约是免疫方法检出限的1／50。Q-TOF-MS具有较宽的质量范围和较高的质量分辨率,与QqQ-MS相比,其在未知蛋白质的结构鉴定和确认上具有独特优势。但是迄今为止,Q-TOF-MS真正用于未知蛋白质过敏原确认的工作还较为少见,大部分工作仍将其作为一种定量手段。Q-LIT-MS由于可以提供动态子离子全扫描和三级质谱扫描(MS3)功能,可以提供更多的结构信息,最近在一些工作中被用于食品过敏原蛋白质的筛查和定量分析。Ansari等^[40]采用Q-LIT-MS进行了奶酪、酸奶、奶粉等乳制品及巧克力中牛奶过敏原α-酪蛋白、β-酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的检测,检出限低至1 μg/L。

方法在日内和日间以及实验室间的重复性和精密度的考察需要在样品前处理时加入合适的内标物,一般选择同位素标记的蛋白质或肽段,以证明所有样品制备步骤和前体/产物离子的产生是稳定的和可重复的^[27]。最后,应当选择尽可能多不同类型的样品基质来考察方法的适用范围,复杂的样品基质对检测结果有较大影响,优化样品前处理步骤可有效拓展方法的适用范围^{[1, 5]}。

5 结论与展望

目前,在食品过敏原检测领域主要以已知过敏原蛋白质的含量检测为主,创新点主要集中在样品前处理方法和质谱检测方法上。在样品前处理方法中,采用独特的蛋白质提取和纯化方法,提高提取和纯化效率;或者采用超声辅助酶解或多种酶同时作用的方法,加快酶解速度。在检测上,根据不同的目的选择不同的质谱检测技术,选择不同的内标物和定量方法。过敏原蛋白质的筛查和确证工作目前还报道得不多,但是在食品安全控制领域具有重要的研究意义和较大的研究空间。今后可以从以下3个方面着手进行食品过敏原蛋白质分析:(1)发展快速、自动化、高通量、集成化的样品前处理方法。目前,虽然有大量工作着眼于样品前处理步骤的优化,但是大多数工作仅仅对其中的某一个处理单元进行改进,将蛋白质的提取、纯化和酶解集成在同一平台进行自动化和并行化操作,将有利于大大提高前处理效率。(2)发展复杂加工食品中多种过敏原的筛查方法。随着人们对口味和营养要求逐步提高,一种食品中往往隐含多种含量较低的过敏原蛋白质,同时存在不同程度的蛋白质变性。因此需要对蛋白质特征肽的确定方法进行更深入的研究,提高检测的特异性和准确性。(3)发展食品过敏原质谱检测新技术。新型质谱仪的问世,如静电场轨道阱质谱(Orbitrap-MS)及其组合质谱(Q-Orbitrap-MS,LTQ-Orbitrap-MS,Orbitrap Fusion-MS等)拥有超高的分辨率和质量准确度,能有效弥补目前复杂食品中过敏原的鉴定较为困难的不足。新型电离技术的发展(如原位电离技术)为食品过敏原的质谱检测提供了新方案。此外,开发成本低廉、性能合适的内标物,改进色谱-质谱方法,提高检测的选择性和灵敏度也是值得研究的方面。

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