制备色谱法分离纯化高良姜黄酮中高良姜素和山柰素


扩展功能
	加入收藏夹

	复制引文信息

	加入引用管理器

	Email Alert

	RSS
本文作者相关文章
	侯红瑞

	黄吉东

	陈玲

	黄嫣然

	王春晓

侯红瑞¹, 黄吉东², 陈玲^2,3, 黄嫣然³, 王春晓¹

1. 茂名职业技术学院, 广东茂名 525000;
2. 广东中轻枫泰生化科技有限公司, 广东茂名 525427;
3. 华南理工大学食品科学与工程学院, 广东广州 510640

收稿日期：2016-03-06

基金项目：茂名市科技计划项目([2015]14)

通讯联系人： Tel:(020)87113252,E-mail:felchen@scut.edu.cn

摘要：建立了制备型高效液相色谱(Prep-HPLC)分离高良姜黄酮中高良姜素和山柰素的方法。高良姜黄酮经HPD-600树脂吸附洗脱纯化后,采用Prep-HPLC分离高良姜黄酮中高良姜素和山柰素。制备色谱条件:流动相为甲醇-0.6%(v/v)乙酸水溶液(58:42, v/v),柱温为常温,流速为7.0 mL/min,检测波长为360 nm,进样量为700 μ L,上样质量浓度为10.0 g/L。分离的单体由质谱和核磁共振氢谱、碳谱鉴定确证为高良姜素和山柰素,HPLC外标法定量,纯度分别为99.5%和99.7%。该方法分离效果好、高效、低毒,可用于高良姜中高良姜素和山柰素的分离制备。

关键词：制备色谱高良姜素山柰素高良姜分离纯化

Isolation and purification of galangin and kaempferide from Alpinia officinarum Hance by preparative high-performance liquid chromatography

HOU Hongrui¹, HUANG Jidong², CHEN Ling^2,3, HUANG Yanran³, WANG Chunxiao¹

1. Maoming Polytechnic, Maoming 525000, China ;
2. Guangdong Zhongqing FONTI Biochemical Science & Technology Co., Ltd., Maoming 525427, China ;
3. School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China

Received: 2016-03-06

Foundation Item: Maoming Science and Technology Project, China (No. [2015]14).

^* Corresponding author. Tel:(020)87113252,E-mail:felchen@scut.edu.cn

Abstract: A method of the preparation of galangin and kaempferide from Alpinia officinarum Hance flavonoids using preparative high-performance liquid chromatography (Prep-HPLC) was established. After the Alpinia officinarum Hance flavonoids was purified by HPD-600 resin-based column chromatography, the flavonoid components were separated by Prep-HPLC on a Venusil XBP-C18 column (250 mm×21 mm, 5.0 μ m). The mixture of methanol and 0.6% (v/v) acetic acid solution (58:42, v/v) was used as mobile phase at a flow rate of 7.0 mL/min. The sample volume was 700 μ L and the UV detection wavelength was 360 nm. With MS and NMR, the structures of component I and component II of the Alpinia officinarum Hance flavonoids were identified. The average relative molecular mass of the component I was 269, the same as galangin; and that of the component II was 299, the same as kaempferide. HPLC analysis showed that the purities of galangin and kaempferide were 99.5% and 99.7% respectively. The method is simple and of low toxicity. It can be applied to the separation and preparation of galangin and kaempferide.

Key words: preparative high-performance liquid chromatography (Prep-HPLC) galangin kaempferide Alpinia officinarum Hance isolation purification

高良姜为姜科山姜属植物高良姜(Alpinia officinarum Hance)的干燥根茎,主要分布于广东、海南、广西等,为“十大广药”之一^[1]。高良姜的化学成分复杂,黄酮类化合物是反映高良姜主要功效的活性成分,具有抗溃疡、抗腹泻、利胆、镇痛、消炎等多种生物活性,其中高良姜素和山柰素是高良姜中的主要黄酮类成分,具有抗肿瘤、抗病毒、抗细菌、抗炎等药理作用^[2-7],已成为国内医药界研究与开发的热点。因此,建立高良姜素和山柰素的高效分离纯化方法具有重要意义。

目前从高良姜中分离纯化高良姜素的方法有溶剂提取结合反复的常规柱色谱^[8-9]、逆流色谱结合硅胶柱色谱^[10]等,分离步骤繁杂,分离效率低,所得产品需反复重结晶,回收率较低。制备色谱法与上述方法相比,分离效果好,得到的产品纯度高,是一种操作简便、快速而且高效的分离纯化方法,已被广泛应用于天然产物的分离纯化^[11]。

由于高良姜中高良姜素、山柰素的结构相似,极性相近,这使从高良姜中分离高良姜素和山柰素等黄酮类成分非常困难。为了解决这一难题,本实验采用大孔吸附树脂和制备型高效液相色谱(preparative high-performance liquid chromatography,Prep-HPLC)相结合的方法,获得一种从高良姜中分离制备高纯度高良姜素和山柰素单体的工艺,为高良姜素和山柰素的生产提供了依据。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

GX-281型高效液相色谱仪(法国Gilson公司)配Gilson 322梯度HPLC泵、Gilson 156 UV/VIS检测器、GX-281自动进样/馏分收集器、TRILUTION^® LC色谱工作站。分析色谱柱为Venusil XBP-C18(250 mm×4.6 mm,5.0 μm),制备色谱柱为Venusil XBP-C18(250 mm×21 mm,5.0 μm)。AVANCE400 Digital超导核磁共振仪(德国Bruker公司),Esquire HCT PLUS质谱仪(德国Bruker公司),UV-2102 PC型紫外-可见分光光度计(上海尤尼克仪器有限公司),BS210S电子分析天平(赛多利斯仪器系统有限公司),BT00-100M恒流泵(保定兰格恒流泵有限公司),BSZ-100自动收集器(上海沪西分析仪器有限公司)。

高良姜药材购自广州清平药材市场,HPD-600树脂(河北沧州宝恩化工有限公司),95%乙醇、无水乙醇(分析纯,成都市联合化工试剂研究所),二甲基亚砜、甲醇、乙腈(色谱纯,成都市联合化工试剂研究所)。高良姜素标准品,纯度99.8%(上海友思生物技术有限公司);山柰素标准品,纯度99.1%(上海友思生物技术有限公司)。

1.2 高良姜粗提物的制备

将高良姜干燥药材粉碎至10～20目,称取1 kg,在搅拌下用80%(v/v)乙醇水溶液500 mL超声辅助提取3次,每次2 h,合并3次提取液；加水调节乙醇体积分数至30%,静置,过夜,待析出褐色沉淀后过滤；将滤渣真空干燥,得高良姜黄酮粗提物(高良姜总黄酮含量为40.1%)。

1.3 大孔吸附树脂纯化高良姜总黄酮

将预处理过的HPD-600大孔吸附树脂湿法装柱^{[12, 13]}(400 mm×26 mm,柱体积200 mL,树脂用量100 g),以2 BV/h流速上样0.8 mg/mL的高良姜黄酮粗提液(折算高良姜总黄酮质量浓度0.37g/L),洗脱剂为85%(v/v)乙醇水溶液,洗脱流速为0.5 BV/h,收集流出液,合并洗脱液,浓缩,真空烘干得高良姜总黄酮纯化品。经过上述HPD-600大孔吸附树脂分离工艺,从1 kg高良姜黄酮粗提物中分离纯化得到527 g高良姜总黄酮纯化品,纯化品中含高良姜素262.6 g,山柰素167.3 g。

1.4 分析型HPLC分离条件

将经HPD-600大孔吸附树脂纯化后的高良姜总黄酮纯化品进行分析型HPLC色谱测定。色谱柱:Venusil XBP-C18液相色谱柱(250 mm×4.6 mm,5.0 μm);流速:1.0 mL/min;检测波长:360 nm;进样量:20 μL;柱温:常温;流动相:甲醇-0.5%(v/v)磷酸水溶液(58∶42,v/v)。

1.5 制备型HPLC色谱条件

根据分析型HPLC的最佳色谱条件建立制备色谱的分离条件。制备流速和制备柱进样量按公式(1)和(2)确定。

(1)

(2)

其中F_prep和F_anal分别为制备和分析色谱的流速;r_prep和r_anal分别为制备和分析色谱柱的半径;V_prep和V_anal分别为制备和分析色谱柱的进样量;C_L为分析色谱柱柱长与制备色谱柱柱长比值。

制备型高效液相色谱分离条件：Venusil XBP-C18液相色谱柱(250 mm×21 mm,5.0 μm),流速为7.0 mL/mim,检测波长为360 nm,进样量为700 μL,柱温为常温,流动相为甲醇-0.6%(v/v)乙酸水溶液(58∶42,v/v)。

1.6 质谱分析条件

取制备型HPLC分离后组分5.0 mg,溶解于5 mL甲醇中,吸取各溶液适量进行质谱分析。质谱分析条件:电离模式ESI+,一级质谱全扫描,离子源温度100 ℃,质量扫描范围m/z 0～1000,毛细管电压3.0 kV,脱气温度350 ℃,锥孔反吹气流量45 L/h,脱溶剂气流量602 L/h。

1.7 核磁共振谱分析条件

取制备型HPLC分离后组分10.0 mg,溶解于0.5 mL二甲基亚砜中,在核磁共振仪上进行¹H-NMR和¹³C-NMR测试。¹H-NMR测试条件:共振频率400.13 MHz,累加次数32次,测定温度296.4 K。¹³C-NMR测试条件:共振频率100.63 MHz,累加次数5000次,测定温度296.3 K。

2 结果与讨论

2.1 分析型色谱条件的优化

利用分析型Venusil XBP-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5.0 μm)对高良姜总黄酮纯化品分离纯化条件进行优化。测定不同流动相种类下的色谱参数。高良姜黄酮类化合物属于极性化合物,因此选择甲醇和乙腈作为流动相。本实验选用的两种流动相分别为:①甲醇-0.5%(v/v)磷酸水溶液(60∶40,v/v); ②乙腈-0.5%(v/v)磷酸水溶液(35∶65,v/v)。

准确称取高良姜总黄酮纯化品7.6 mg,溶于甲醇后移入50 mL容量瓶,定容,过0.22 μm滤膜,滤液进行HPLC分析。结果表明,流动相为甲醇-0.5%(v/v)磷酸水溶液(60∶40,v/v)时,色谱分离度(R_s)为1.39;流动相为乙腈-0.5%(v/v)磷酸水溶液(35∶65,v/v)时,R_s大于1.5,分离效果,峰形均较好,但保留时间为63.55 min,比前一种情况下出峰晚,这将导致分析时间长,溶剂消耗量增大,且乙腈的成本较高、有毒。因此,本实验选择甲醇作有机溶剂分析高良姜黄酮类化合物组分,色谱峰出峰时间分别为43.80和48.89 min。

确定流动相中的有机溶剂后,对有机溶剂和缓冲溶液的比例进行比较,结果如表 1所示。

表 1 不同流动相条件下的分离度 Table 1 Resolutions with different mobile phases

由表 1可知,当流动相中甲醇与0.5%(v/v)磷酸缓冲液体积比为58∶42时,R_s为1.58,分离效果好。结果如图 1所示,高良姜总黄酮纯化品分离出2个色谱峰,表明大孔吸附树脂纯化后得到的高良姜黄酮纯化品中含有2个组分,组分Ⅰ和组分Ⅱ的保留时间分别为47.72和51.29 min。

图 1 高良姜总黄酮纯化品的HPLC色谱图 Fig. 1 HPLC chromatogram of purified flavonoids from Alpinia officinarum Hance

2.2 制备色谱分离高良姜黄酮条件的确定

配制10.0 g/L的高良姜总黄酮纯化品溶液,过0.22 μm滤膜,按照公式(1)、(2)计算制备流速为21.0 mL/min,进样量为400 μL。实验表明,流速为21.0 mL/min的条件下,色谱柱内径为21 mm时,色谱峰峰形窄,分离度差,切割收集也很难获得纯度较高的单体,且流动相中的磷酸在被分离组分干燥时较难除去。因此,经过优化,制备型HPLC色谱分离流速为7.0 mL/min,进样量为700 μL,流动相为甲醇-0.6%(v/v)乙酸水溶液(58∶42,v/v),连续进样4次,采用自动馏分收集器收集。如图 2所示,每1 min收集一管流出液,合并各组分收集液(弃去中间未完全分离的部分),旋转蒸发进行浓缩,将浓缩液冷冻干燥,分别得到颜色为淡黄色的组分Ⅰ和黄色的组分Ⅱ。

图 2 制备型HPLC 4次进样的色谱分离图 Fig. 2 Prep-HPLC chromatogram of flavonoids by four injections

对制备色谱分离得到的组分Ⅰ、Ⅱ分别按照1.4节方法进行分析型色谱分析。结果如图 3所示,在分析型色谱分离条件下分别出现单个色谱峰,且组分Ⅰ的保留时间与高良姜素标准品相同,组分Ⅱ的保留时间与山柰素标准品相同,说明制备型HPLC分离高良姜黄酮类化合物效果很好。初步判断组分Ⅰ为高良姜素,组分Ⅱ为山柰素。

图 3 高良姜黄酮类化合物中组分Ⅰ、Ⅱ的HPLC色谱图 Fig. 3 HPLC chromatogram of components Ⅰ and Ⅱ in the flavonoids

2.3 结构鉴定

组分Ⅰ:淡黄色针状,用ESI-MS检测得到ESI-MS谱图(见图 4),相对分子质量为269。¹H-NMR(400 MHz,DMSO-d₆)化学位移(δ)数据: 8.18 (2H,d,J=8.0 Hz,H-2′,6′),7.44~7.52 (3H,m,H-3′,4′,5′),6.45 (1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.19 (1H,d,J=2.0 Hz,H-6);¹³C-NMR(100 MHz,DMSO-d₆)δ数据: 146.1(C-2),137.6(C-3),176.8(C-4),161.2(C-5),98.8(C-6),164.7(C-7),93.1(C-8),156.9(C-9),103.7(C-10),131.4(C-1′),129.0(C-2′,6′),128.0(C-3′,5′),130.4(C-4′)。以上数据均与文献^{[14, 15]}报道的高良姜素一致,因此确认组分Ⅰ为高良姜素。

图 4 高良姜黄酮类化合物中组分Ⅰ、Ⅱ的一级质谱图 Fig. 4 ESI-MS spectrum of flavonoids component Ⅰ and Ⅱ

组分Ⅱ:黄色粉末,用ESI-MS检测得到ESI-MS谱图(见图 4),相对分子质量为299.3。¹H-NMR(400 MHz,DMSO-d₆)δ数据: 3.8(3H,s,-OCH₃),6.2(1H,d,J=2.0 Hz,H-6)6.4(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),7.1(2H,d,J=9.5 Hz,H-3′,5′),8.1(2H,dd,J=7.5,2.1 Hz,H-2′,6′)。¹³C-NMR(100 MHz,DMSO-d₆)δ数据: 146.7(C-2),136.5(C-3),176.5(C-4),156.7(C-5),98.7(C-6),164.5(C-7),94.0(C-8),161.2(C-9),103.6(C-10),123.7(C-1′),129.8(C-2′),114.5(C-3′),160.9(C-4′),114.5(C-5′),129.8(C-6′),55.8(-OCH₃)。以上光谱数据与山柰酚-4′-甲醚(山柰素)谱图数据^{[14, 16]}基本一致,因此确认组分Ⅱ为山柰素。

2.4 产品得率与纯度的测定

经2.2节制备色谱分离纯化工艺,HPD-600大孔吸附树脂分离后的1 g高良姜总黄酮纯化品中可以分离得到组分Ⅰ即高良姜素378.2 mg,组分Ⅱ即山柰素225.5 mg。用分析型HPLC采用外标法测定纯度,平行测定5次,取平均值。高良姜素标准品质量浓度在13～70 mg/L之间时,色谱峰面积(Y)与样品质量浓度(X,mg/L)呈线性关系,回归方程为Y=5743.6X+1507,R²=0.9995,测得制备色谱分离后的高良姜素的纯度为99.5%;山柰素标准品质量浓度在10～60 mg/L时,色谱峰面积(Y)与样品质量浓度(X,mg/L)呈线性关系,回归方程为Y=5575.5X-3471.7,R²=0.9994,测得制备色谱分离后山柰素的纯度为99.7%。

3 结论

由于高良姜中含有大量黄酮类物质,且黄酮类物质(高良姜素和山柰素)结构极为相似(山柰素在C-4′位多了一个甲氧基),故先采用大孔吸附树脂分离出总黄酮,在Prep-HPLC优化条件下进一步分离,得到高良姜素单体和山柰素单体,分离效果好,可连续进样制备。用分析型HPLC外标法测定纯度,结果表明均达到了99%以上。该方法适用于分离纯化高良姜中高良姜素和山柰素单体,分离效果好,操作简单,重现性好,为高良姜素和山柰素纯品制备提供了一种新的思路。

参考文献

[1]	Pharmacopoeia Commission of People's Republic of China, Pharmacopoeia of People's Republic of China, Part 1. Beijing:Chinese Medical Science and Technology Press,2015 :287. 国家药典委员会, 中华人民共和国药典, 一部. 北京:中国医药科技出版社,2015 :287.
[2]	Wang H, Liao T A, Fu L B, et al, Medical & Pharmaceutical Journal of Chinese People's Liberation Army,2015, 27 (11):68. 王鸿, 廖天安, 符良斌, 等, 解放军医药杂志,2015, 27 (11):68.
[3]	Xu Y X, Zhao X H, Chinese Pharmaceutical Journal,2013, 48 (15):1274. 许云霞, 赵新淮, 中国药学杂志,2013, 48 (15):1274.
[4]	Zhao X, Zhang J, Journal of Central South University:Medical Science,2015, 40 (5):479. 赵欣, 张健, 中南大学学报:医学版,2015, 40 (5):479.
[5]	Han M A, Lee D H, Woo S M, et al, Sci Rep-UK,2016, 6 :18642.
[6]	Zhu J X, He W, Ma J C, et al, Food and Drug,2009, 11 (9):68. 朱家校, 何伟, 马建春, 等, 食品与药品,2009, 11 (9):68.
[7]	Shang J, Xin Y, Chinese Journal of Dermatovenereology,2011, 25 (3):185. 商进, 辛燕, 中国皮肤性病学杂志,2011, 25 (3):185.
[8]	Kang A R, Yan M, Peng Y, et al, Chinese Journal of Information on Traditional Chinese Medicine,2011, 18 (5):44. 康爱荣, 闫明, 彭英, 等, 中国中医药信息杂志,2011, 18 (5):44.
[9]	Deng Y, Chen J, Tang C, et al, Journal of Chinese Medicinal Materials,2005, 28 (10):948. 邓赟, 陈谨, 唐灿, 等, 中药材,2005, 28 (10):948.
[10]	Xu J, Cao X L, Yin L, et al, Food Science,2013, 34 (4):55. 徐静, 曹学丽, 尹鹭, 等, 食品科学,2013, 34 (4):55.
[11]	Jia D, Chen X F, Ding X, et al, Pharmaceutical Care and Research,2015, 15 (3):161. 贾丹, 陈啸飞, 丁璇, 等, 药学服务与研究,2015, 15 (3):161.
[12]	Huang Y, Chen L, Hou H R, et al, Modern Food Science and Technology,2007, 23 (1):1. 黄云, 陈玲, 侯红瑞, 等, 现代食品科技,2007, 23 (1):1.
[13]	Hou H R, Chen L, Feng Y F, et al, Food Science,2007, 28 (10):258. 侯红瑞, 陈玲, 冯毅凡, 等, 食品科学,2007, 28 (10):258.
[14]	Gong Y H, Ding L S, ¹³C-NMR Analysis of Natural Products[M]. Kunming: Yunnan Science and Technology Press, 2005 龚运淮, 丁立生, 天然产物核磁共振碳谱分析[M]. 昆明: 云南科技出版社, 2005
[15]	Bu X Z, Xiao G W, Gu L Q, et al, Journal of Chinese Medicinal Materials,2000, 23 (2):84. 卜宪章, 肖桂武, 古练权, 等, 中药材,2000, 23 (2):84.
[16]	An N, Yang S L, Zou Z M, et al, Chinese Traditional and Herbal Drugs,2006, 37 (5):663. 安宁, 杨世林, 邹忠梅, 等, 中草药,2006, 37 (5):663.