随着国民经济的快速发展和人民生活水平的不断提高,人们对美化生活的需求更加迫切,化妆品日益成为日常生活不可或缺的必需品。根据国家统计局数据,2015年化妆品类商品的国内销售总额达2049.4亿元人民币,近3年平均增幅为10.7%。面对化妆品行业的高速发展和化妆品需求量的与日俱增,化妆品的质量安全越来越受到广大消费者的关注和重视。由于化妆品使用人群广泛、应用频率高、暴露时间持久,与人体健康关系密切,因此化妆品的安全性是化妆品品质的第一要素^[1]。总体而言,绝大部分化妆品生产企业能够做到诚信自律,但仍有个别厂商在化妆品中违法违规使用禁限用物质,特别是非法添加违禁抗生素^{[2, 3]}。在国家食品药品监督管理总局组织开展的化妆品监督抽检中,多次发现化妆品中违规添加抗生素的行为^{[4, 5]}。

抗生素属于处方药物,必须在医生指导下方可使用。如长期使用添加抗生素的化妆品,可能引起接触性皮炎等不良反应,表现为红斑、水肿、糜烂、脱屑、渗出、瘙痒、灼热等症状,抗生素还容易造成细菌耐药性增强,使药效减低而延误治疗,导致严重的健康问题。鉴于其健康危害和潜在风险,我国《化妆品卫生标准》^[6]、《化妆品安全技术规范》(2015年版)^[7]规定抗生素为化妆品禁用组分,欧盟^[8]、日本^[9]、韩国^[10]等其他国家和地区亦有此规定。

目前针对化妆品中抗生素类等违禁添加物的测定方法主要有毛细管电泳法^{[11, 12]}、离子色谱法^[13-19]、液相色谱法^[20-24]、液相色谱-质谱联用法^[25-27]、气相色谱法^[28-30]和气相色谱-质谱联用法^[31-35],但上述方法均为实验室检测方法,需将样品远途移送至实验室,经过操作烦琐、耗时冗长的样品前处理和仪器分析才能得到测试结果,检测周期较长,难以满足现场、快速和高通量检测的需求。

离子迁移谱(ion mobility spectrometry,IMS)是基于气相中不同的气相离子在电场中迁移速度的差异来对化学物质进行表征的一项分析技术,它具有设备体积小、可靠性高、操作简便、快速灵敏、成本低廉等优点,可实现批量样品的现场快速检测。目前该技术已应用于毒品检测^[36]、爆炸物探测^[37]、食品安全^{[38, 39]}等领域。在胺类^[40]和卤代烃化合物^[41]的检测中,国内研究人员也开发了基于离子迁移谱的快速分析方法。在离子迁移谱测定中,首先要生成气相离子，然后才能进行产物离子的分离和检测。现有的电离源包括放射源、光致放电管、激光电离、电喷雾电离、火焰电离、电晕电离等^[42]。本实验采用的萃取纳升喷雾作为一种新型常压直接离子化技术,可在敞开式环境和无需样品预处理的条件下对样品基体中的待测物直接离子化,极大地提高了样品分析的效率^[43-45]。

本研究采用离子迁移谱结合萃取纳升喷雾离子化技术,实现了化妆品中8种违禁抗生素的现场快速筛查,疑似阳性样品采用超高效液相色谱-串联质谱进一步确证,为打击化妆品生产经营中添加违禁抗生素违法行为,提高化妆品质量安全水平和保障公众健康安全提供了科学有效的技术手段。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

GA2100型便携式离子迁移谱仪(美国Excellims公司):配有离子栅门控制器、空气过滤装置(含硫酸钙和分子筛)、高分辨率离子迁移分析器、法拉第杯检测器、VisIon仪器控制与数据处理系统,使用前用色氨酸和柠檬酸分别在正、负离子模式下校正仪器;ACQUITY超高效液相色谱仪、Xevo TQ-MS三重四极杆质谱仪、MassLynx数据处理系统(美国Waters公司); P-1000型微电极拉制仪、硼硅酸盐玻璃毛细管(外径1.50 mm,内径0.86 mm,长度10 cm)(美国Sutter公司); Axio Scope A1显微镜(德国Zeiss公司); ESW-M15P型电极夹持器(美国Warner Instruments公司);移液器吸头(美国Bio-Rad公司)。本研究的实验流程见图 1。

图 1

Fig. 1

图 1 萃取纳升喷雾-离子迁移谱实验流程 Fig. 1 Work flow for extraction nano-electrospray coupled with ion mobility spectrometry HV: high voltage.

1.2 材料与试剂

8种禁用抗生素标准物质:喹诺酮类抗生素(加替沙星、依诺沙星、培氟沙星)、硝基咪唑类抗生素(甲硝唑、2-甲硝咪唑、奥硝唑)和硝基呋喃类抗生素(呋喃妥因、呋喃西林)购自德国Dr. Ehrenstorfer公司和美国Fluka公司(纯度均大于93%),以甲醇或乙腈(含0.1%(v/v)甲酸,呋喃妥因和呋喃西林除外)为溶剂配制成1 mg/mL的标准储备液,分析时用相应溶剂稀释至10 μg/mL;甲醇和乙腈(色谱纯)购自美国Fisher公司;色氨酸和柠檬酸购自美国Sigma-Aldrich公司,以甲醇配成10 μg/mL进行仪器校正。15例宣称具有祛痘或除螨功效的化妆品样品均购自当地市场或超市。

1.3 实验方法

用金属微电极蘸取化妆品样品(约1 mg),插入预先用10 μL甲醇充注的拉制好的硼硅酸盐玻璃毛细管中,将其放置于离子迁移谱仪的进样口前端^[43],施加电喷雾电压使样品离子化,进入迁移管分离后经法拉第杯检测器检测,得到相应测试图谱。本研究采用的萃取纳升喷雾离子化装置见图 2。

图 2

Fig. 2

图 2 萃取纳升喷雾离子化装置 Fig. 2 Extraction nano-electrospray assembly

1.4 离子迁移谱条件

电喷雾电压:1900 V(正离子模式)和1800 V(负离子模式);迁移管电压:8000 V;迁移管温度:180 ℃;气体预加热温度:180 ℃;迁移谱宽:26 ms; Bradbury-Nielsen离子门脉冲宽度:59 μs; Bradbury-Nielsen离子门电压:30 V;数据采集速率:2sp-34-06-596 s^-1;漂移气流速:1.50 L/min;排气泵抽速:0.66 L/min^[46]。8种禁用抗生素的分子式、相对分子质量、离子化方式、迁移时间见表 1,离子迁移谱图见图 3。

表 1 (Table 1)

表 1 8种禁用抗生素的分子式、相对分子质量(Mr)、离子化方式、迁移时间及检出限 Table 1 Formulae,relative molecular masses (Mr),ionization modes,drift times and limits of detection (LODs) of the eight prohibited antibiotics No. Antibiotic Formula Mr Ionization mode Drift time/ms LOD/(mg/kg) 1 menidazole C4H5N3O2 127.10 ESI+ 7.95 20 2 metronidazole C6H9N3O3 171.16 ESI+ 8.83 20 3 nitrofurazone C6H6N4O4 198.14 ESI- 9.28 20 4 ornidazole C7H10ClN3O3 219.63 ESI+ 9.88 20 5 nitrofurantion C8H6N4O5 238.16 ESI- 10.37 20 6 enoxacin C15H17FN4O3 320.32 ESI+ 12.36 20 7 pefloxacin C17H20FN3O3 333.36 ESI+ 13.39 20 8 gatifloxacin C19H22FN3O4 375.39 ESI+ 13.63 20

表 1 8种禁用抗生素的分子式、相对分子质量(Mr)、离子化方式、迁移时间及检出限 Table 1 Formulae,relative molecular masses (Mr),ionization modes,drift times and limits of detection (LODs) of the eight prohibited antibiotics

图 3

Fig. 3

图 3 8种禁用抗生素的离子迁移谱图 Fig. 3 Ion mobility spectra of the eight prohibited antibiotics

1.5 超高效液相色谱-串联质谱确证条件

Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流动相:A(甲醇-乙腈(2∶3,v/v)),B(5 mmol/L甲酸铵水溶液)。梯度洗脱程序:0～4 min,12%A; 4～5 min,12%A～17%A; 5～9 min,17%A～50%A; 9～10 min,50%A～12%A。流速:0.3 mL/min;柱温:40 ℃;样品室温度:20 ℃;进样量:5 μL。

电喷雾离子源;毛细管电压:3.0 kV;射频透镜电压:0.1 V;离子源温度:150 ℃;去溶剂气温度:350 ℃;去溶剂气流量:600 L/h;锥孔气流量:50 L/h;光电倍增器电压:650 V;碰撞气体:氩气;碰撞室气压:0.32 Pa;多反应监测(MRM)模式检测^[47-50]。8种禁用抗生素的质谱分析参数见表 2,其判断依据主要参照欧盟指令2002/657/EC^[51]中关于质谱分析方法定性的规定。

表 2 (Table 2)

表 2 8种禁用抗生素的串联质谱分析参数 Table 2 MS/MS parameters for the eight prohibited antibiotics No. Antibiotic Precursor ion (m/z) Product ion (m/z) Cone voltage/V Collision energy/eV Relative ion ratio/% Acceptable tolerance/% 1 menidazole 128.2 [M+H]+ 82.1* 20 15 100 ±50 111.1 20 15 9 2 metronidazole 172.2 [M+H]+ 128.2* 20 15 100 ±20 82.1 20 20 51 3 nitrofurazone 197.1 [M-H]- 179.1* 13 7 100 ±20 99.1 13 12 62 4 ornidazole 220.2 [M+H]+ 128.2* 25 15 100 ±20 82.1 25 25 65 5 nitrofurantion 237.1 [M-H]- 210.1 15 12 2 ±50 152.1* 15 13 100 6 enoxacin 321.3 [M+H]+ 303.2* 30 20 100 ±25 234.2 30 22 31 7 pefloxacin 334.3 [M+H]+ 316.3* 30 20 100 ±20 290.3 30 19 65 8 gatifloxacin 376.3 [M+H]+ 332.3* 30 18 100 ±20 358.3 30 20 86 *Ions with higher responses.

表 2 8种禁用抗生素的串联质谱分析参数 Table 2 MS/MS parameters for the eight prohibited antibiotics

2 结果与讨论

2.1 用于萃取纳升喷雾的硼硅酸盐玻璃毛细管的拉制

硼硅酸盐玻璃毛细管的拉制效果关键取决于其尖端内径的大小。如果内径太大会导致样品喷雾效果差,离子化效率低,从而影响目标化合物的检测灵敏度;如果内径太小则容易致使毛细管尖端阻塞,样品溶液难以喷出,造成仪器灵敏度下降甚至无信号。本研究对微电极拉制仪的加热温度、升温速率等关键参数进行了详细优化,通过在光学显微镜下观测硼硅酸盐玻璃毛细管尖端内径值,选取5～15 μm内径的毛细管作为纳升电喷雾源(见图 4),以达到最佳离子化效果。最终确定微电极拉制仪的参数为:加热温度450 ℃,拉力值0 N,升温速率5 ℃/s,循环周期时间1 s,气压值6×10⁴ Pa。

图 4

Fig. 4

图 4 硼硅酸盐玻璃毛细管的光学显微镜图 Fig. 4 Optical microscopic images of the pulled borosilicate glass capillaries

2.2 萃取纳升喷雾离子化条件的优化

本研究对萃取溶剂和电喷雾电压这两项最为重要的萃取纳升喷雾离子化参数进行了优化。溶剂的极性、挥发性、表面张力等性质对于电喷雾离子化过程具有显著影响,本研究考察了四氢呋喃、丙酮、乙腈、异丙醇、乙醇、甲醇、水等一系列溶剂对禁用抗生素类物质的离子化效果。结果表明,甲醇的离子化效率最高。经考察,1900 V(正离子模式)和1800 V(负离子模式)为最佳电喷雾电压。

2.3 迁移管及气体预加热温度的优化

考察了迁移管和气体预加热温度对目标化合物信号强度的影响情况。由于迁移管温度和气体预加热温度的设置需尽量保持一致,以避免由于热交换或其他因素而导致的离子迁移时间重现性差等问题,因此本实验在优化这两项参数时将其设为相同值来考察。设定了一系列温度(160、170、180、190、200 ℃),比较各目标化合物离子的信号强度。实验结果表明,在一定范围内提高迁移管和气体预加热温度,可以降低大气环境下空气湿度或温度对离子信号强度的影响,减小离子峰的半峰宽和位置漂移。但温度设置过高会造成系统不稳定,而且温度过高引发的离子扩散及碰撞损失也更严重,导致离子信号减弱,绝大多数抗生素化合物在180 ℃下的信号最强。因此,本方法将迁移管和气体预加热温度同时设置为180 ℃。

2.4 漂移气的选择

由于离子的迁移时间或迁移率反映了离子与漂移气分子之间的相互作用或碰撞截面,因此通过改变漂移气可能会影响离子峰的分辨率和响应强度。本研究分别比较了空气、氦气、氩气及氮气作为漂移气时目标分析物的分离及信号响应情况。实验结果表明,虽然氦气和氩气等惰性气体具有电离电位高和极化度低等优点,但迁移管内各组件电弧放电的可能性增大,干扰分析过程;当氮气作为漂移气时,8种抗生素的分离效果和绝大多数化合物的信号响应强度均不及空气,推测可能是由于氮气成分单一,且气体中不含氢,导致正离子模式下分析物响应强度降低;而空气作为漂移气能够较好地分离目标化合物,且信号强度高,价格低廉。因此,本实验选择空气作为漂移气。

2.5 方法检出限

在经测定不含8种禁用抗生素的化妆品样品(膏霜和乳液)中添加一定浓度的待测抗生素标准溶液,静置过夜。然后按照前文所述方法进行分析测定,以信噪比为3估算方法的检出限,实验结果见表 1。

2.6 超高效液相色谱-串联质谱确证条件的优化

对于经离子迁移谱法筛检出的疑似阳性样品,本研究开发了进一步确证的超高效液相色谱-串联质谱方法。8种抗生素组分中,呋喃妥因和呋喃西林在ESI^-电离方式下可获得丰度较高的[M-H]^-准分子离子峰,其余6种抗生素化合物均在ESI⁺电离方式下产生较强的[M+H]⁺准分子离子峰。经二级质谱分析,选择对应的两个产物离子碎片峰作为监测离子对。8种禁用抗生素的前体离子和产物离子及其质谱分析参数见表 2。如果样品中目标化合物的离子相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致,且相对丰度偏差不超过表 2的允许偏差,则可判断样品中含有相应的禁用抗生素组分。

2.7 样品测定

2.7.1 自制阳性样品的测定

选择代表性的抗生素呋喃西林,在一例祛痘类乳液中定量添加该禁用抗生素,涡旋振荡使其充分混匀,静置过夜,制得阳性样品。然后按照前文所述方法进行分析测定,在ESI^-模式下成功筛查出该禁用抗生素,其特征离子迁移谱图见图 5。

图 5

Fig. 5

图 5 自制含有抗生素呋喃西林阳性样品的离子迁移谱图 Fig. 5 Ion mobility spectrum of the cosmetic samples spiked with nitrofurazone

2.7.2 实际样品的筛查

应用本研究建立的快速筛查方法对15种宣称具有祛痘或除螨功效的国内市售化妆品样品进行了分析检测。其中1件祛痘乳液样品经离子迁移谱法筛查疑似含有违禁抗生素呋喃西林,进一步经超高效液相色谱-串联质谱确证该样品中含有呋喃西林(见图 6),含量为37.8 mg/kg。

图 6

Fig. 6

图 6 化妆品实际样品的(a)离子迁移谱图和(b)超高效液相色谱-串联质谱确证谱图 Fig. 6 (a) Ion mobility spectrum and (b) MRM chromatograms obtained by UPLC-MS/MS of a real cosmetic sample

3 结论

本研究采用无需样品前处理、可在敞开环境下实现样品中目标组分电离的萃取纳升喷雾离子化结合离子迁移谱技术,建立了化妆品中8种禁用抗生素的现场快速筛查方法。疑似阳性样品进一步以超高效液相色谱-串联质谱确证,可在确保检测结果准确性的同时,大大提升工作效率,具有较好的应用推广前景。

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