超高效液相色谱-多反应选择离子监测同步在线全扫描质谱技术测定保健品中的类安非他命和匹卡米隆


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祝伟霞¹, 张莉¹, 李睢², 张丽¹, 刘亚风¹, 杨冀州¹

1. 河南出入境检验检疫局, 河南郑州 450003;
2. 河南中医药大学, 河南郑州 450000

收稿日期：2016-03-22

基金项目：国家质检总局科技计划项目(2015IK115);河南省科技攻关项目(122102110167,122102210393).

通讯联系人： Tel:(0371)55196533,E-mail:jizhouyang@163.com

摘要：建立了超高效液相色谱-三重四极杆串联线性离子阱质谱测定保健品中类安非他命(BMPEA)和匹卡米隆的分析方法。样品采用甲醇超声提取,新型反相固相萃取柱(PRiME HLB)净化,采用甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液作为流动相,SHISEIDO CAPCELL MG Ⅱ C₁₈色谱柱分离BMPEA和匹卡米隆。在电喷雾离子源正离子电离模式下,联合采用多反应选择离子监测(MRM)、增强型子离子全扫描(EPI)和谱库检索技术,实现了两种分析物的定性分析和定量计算。在该实验条件下,BMPEA和匹卡米隆在口服液、片剂和胶囊样品中的检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别为0.2~0.5 μg/kg和0.5~2.0 μg/kg,加标回收率为79.5%~103.8%, RSD为3.6%~15.4%,在0.2~200.0 μg/kg范围内基质标准溶液的含量和峰面积呈良好线性关系(r≥0.9969)。该方法成功应用于进口和市售保健品的测定,分析结果表明该方法操作简单、结果准确,可用于保健品中BMPEA和匹卡米隆的确证分析。

关键词：超高效液相色谱-三重四极杆线性离子阱质谱增强型子离子全扫描固相萃取类安非他命匹卡米隆保健品

Determination of β-methylphenethylamine and picamilon in health products by ultra performance liquid chromatography-multiple reaction monitoring and online full scan mass spectrometry

ZHU Weixia¹, ZHANG Li¹, LI Sui², ZHANG Li¹, LIU Yafeng¹, YANG Jizhou¹

1. Henan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhengzhou 450003, China ;
2. Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China

Received: 2016-03-22

Foundation Item: General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People’s Scientific and Technological Projects (No. 2015IK115); Henan Province Key Scientific and Technological Projects (Nos. 122102110167, 122102210393)

^* Corresponding author. Tel:(0371)55196533,E-mail:jizhouyang@163.com

Abstract: A confirmative method was developed for determining β-methylphenethylamine (BMPEA) and picamilon in health products by ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole linear ion trap mass spectrometry (UPLC-Q Trap MS). The sample was ultrasonically extracted with methanol. The purification was carried out on a new reversed phase solid-phase extraction column (PRiME HLB). The detection of compounds was in the positive mode. Multiple technologies were applied to solve the identification and quantification for the two compounds, such as multiple reaction monitoring (MRM), online enhanced product ion full scan (EPI) and library search. Methanol and 0.1% (v/v) formic acid aqueous solution were used as the mobile phases with gradient elution. A SHISEIDO CAPCELL MG Ⅱ C₁₈ column was used to separate the analytes. The LODs and LOQs for BMPEA and picamilon in liquid, table and capsule samples were 0. 2-0.5 μg/kg and 0.5-2.0 μg/kg, respectively. The average spiked recoveries of the method varied from 79.5% to 103.8% and the RSDs were between 3.6% and 15.4%. In the range of 0.2-200.0 μg/kg, the peak areas and concentrations of matrix standard solution showed good linear relationship (r≥0.9969). The qualitative confirmation results were required based on the search-match MRM and EPI mass spectra simultaneously. The method is simple and accurate for the determination of BMPEA and picamilon in imported and commercial health products.

Key words: ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole linear ion trap mass spectrometry (UPLC-Q Trap MS) enhanced product ion full scan (EPI) solid-phase extraction (SPE) β-methylphenethylamine (BMPEA) picamilon health products

2015年美国第一保健品牌健安喜(GNC)因涉嫌添加违禁成分匹卡米隆和类安非他命(β-methylphenethylamine,BMPEA)遭到司法部门的起诉。匹卡米隆(picamilon)是一种可迅速穿过血脑屏障、加速脑血流量,临床上常用于治疗焦虑、头痛等心脑血管疾病的药物^[1]。中国、俄罗斯、日本等国家将匹卡米隆定义为处方药,美国则将其列入违禁药品目录^[2]。类安非他命为安非他命的甲基异构体,属苯丙胺类中枢兴奋药和抗抑郁类药物,由于与安非他命具有相同的功效,许多国家将苯丙胺类药物列为毒品^[3],世界反兴奋剂组织已将BMPEA列入禁用药物的名单中^[4]。目前有关BMPEA对人体安全健康的风险评估数据十分有限,而我国新发布的保健品标准^[5]未将任何西药列为可添加药物。保健食品中添加违禁化学物质,不仅危害消费者的身体健康^[6],也违反了《中华人民共和国食品安全法》。因此,需要建立一种简单、快速、准确的对保健品中的类安非他命和匹卡米隆进行分析的方法,为保健品的质量安全提供可靠的技术保障。

目前主要采用液相色谱-紫外检测器测定药物中匹卡米隆的含量^{[1, 2, 7]},液相色谱-质谱法分析血液中的匹卡米隆^{[8, 9]}。苯丙胺类精神药物的研究主要采用气相色谱-质谱^{[10, 11]}和液相色谱-质谱^{[3, 12]}技术进行测定。BMPEA作为一种新型化学合成药物^[13],2014年Cholbiński等^[4]报道了液相色谱-质谱法测定尿液中BMPEA残留的分析方法。目前有许多测定保健品中非法添加药物的报道^{[14, 15]},但未见有关保健品中BMPEA和匹卡米隆的研究报道。本文采用多反应选择离子监测(MRM)同步增强型子离子全扫描(EPI)确证技术,建立了同时测定保健品中类安非他命和匹卡米隆的超高效液相色谱-串联质谱的方法。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

API 5500Q液相色谱-质谱仪(配美国Waters公司ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪和美国Applied Biosystems公司Q Trap线性离子阱质谱); SA-31振荡器(日本大和公司); CF15RXII离心机(日本Hitachi公司); 24位固相萃取装置(德国CNW公司); N-EVAP112氮吹仪(美国Organomation Associates公司); Oasis HLB和PRiME HLB柱(3 mL/60 mg,美国Waters公司); C₁₈柱(3 mL/500 mg,美国Supelco公司);正己烷、甲醇和甲酸(色谱纯,美国Fisher公司); BMEPA和匹卡米隆(对照品,纯度≥99%,日本TCI公司); 0.2 μm有机相滤膜(天津津腾公司);水为Millipore纯水系统制得的高纯水(电阻率≥18 MΩ\5cm)。

1.2 溶液的配制

分别称取标准品10 mg于100 mL容量瓶中,用甲醇定容,得到质量浓度为100 mg/L的单标准储备溶液,于-18 ℃冷冻保存,有效期3个月;取上述单标准储备溶液用甲醇-水(1∶1,v/v)稀释成质量浓度为1 mg/L的混合工作溶液,于2～4 ℃下储存,有效期1个月;使用前将混合工作溶液用甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液(1∶4,v/v)稀释制成试剂混合标准溶液;按照操作方法所述制得空白样品提取液,使用前将用其稀释的混合标准工作溶液制成合适浓度的基质标准工作溶液。

1.3 仪器条件

液相色谱柱:SHISEIDO CAPCELL MGⅡC₁₈ (150 mm×2.1 mm,5 μm);柱温:35 ℃;流动相:甲醇(A)与0.1%(v/v)甲酸水溶液(B);梯度洗脱程序:0～3.5 min,5%A; 3.5～5.5 min,5%A～90%A; 5.5～7.5 min,90%A～95%A; 7.5～7.6 min,95%A～5%A; 7.6～11.0 min,5%A。六通阀位置:0～1.0 min至废液,1.0～6.0 min进质谱仪、6.0 min后至废液。流速:0.3 mL/min;进样量:10 μL。

电喷雾离子源正离子电离模式(ESI+);扫描方式:MRM;雾化气压力:413.7 kPa;气帘气压力;241.3 kPa;去溶剂气压力:379.2 kPa;碰撞气压力:69 kPa;喷雾电压:4 500 V;去溶剂温度:550 ℃;每个离子对驻留时间:100 ms;去簇电压(DP): 35 V;每种化合物的检测离子对、碰撞室出口电压(CXP)、射入电压(EP)、碰撞能量(CE)等质谱参数见表 1。线性离子阱在线全扫描条件:每次选择3个最强峰,动态背景扣除,每10 s排除一次前级扫描过的离子,扫描强度阀值为3 500 cps,EPI扫描范围为m/z 50～250,在CE为25 eV下扫描,其他质谱参数同MRM模式,采用标准溶液在上述MRM-EPI方法下获得子离子扫描质谱图,并建立质谱标准图库,供BMPEA和匹卡米隆定性检索。

表 1 类安非他命和匹卡米隆的质谱参数 Table 1 Mass parameters of BMPEA and picamilon

1.4 样品前处理

称取2.5 g试样于50 mL具塞离心管中,加入25 mL甲醇超声提取30 min(每隔10 min涡旋2 min)后,以4 000 r/min离心10 min。取5 mL样液直接上载至PRiME HLB固相萃取柱,收集全部流出液于45 ℃氮气流下浓缩至近干,加入1 mL甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液(1∶4,v/v)溶解残渣,经0.22 μm微孔滤膜过滤后测定。

2 结果与讨论

2.1 净化方法的优化

保健品中的BMPEA和匹卡米隆均属添加药物,与样品基质间的结合力弱,甲醇可完全萃取BMPEA和匹卡米隆。但保健品中存在大量的甲醇共萃取物,可干扰电喷雾离子源质谱的电离。为考察甲醇提取液的基质效应,将含量为10 μg/kg的试剂混合标准溶液与基质标准工作溶液的峰面积进行比较,发现在口服液和片剂中分析物的基质抑制效应≤20.7%,在胶囊提取液中的基质抑制效应达74.6%。因此必须采用有效的净化方法去除干扰物质。

本方法考察了用正己烷萃取提取液的净化效果。天然提取物类保健品中的BMPEA和匹卡米隆的响应强度提高了3.4%～15.4%,以油为载体的保健品提高了约27%。同时考察了正己烷联合C₁₈、HLB和PRiME HLB固相萃取填料的净化效果。分别采用C₁₈和HLB柱时的回收率均为34.8%～102.7%,采用PRiME HLB柱时的回收率为57.4%～114.6%。PRiME HLB固相萃取柱是一种新型反相固相萃取吸附剂,可去除基质中的蛋白质、盐、磷脂等干扰物,样液通过筛板和固相萃取填料时不易堵塞。将未经正己烷除脂的样液直接上载至PRiME HLB柱,获得与正己烷除脂后相同的回收率。本方法最终将样液直接用PRiME HLB固相萃取柱净化。

2.2 定量方法的优化

由于类安非他命和匹卡米隆存在基质抑制效应,采用试剂混合标准溶液外标曲线定量的准确度较差,而目前没有稳定的商品化BMPEA和匹卡米隆的同位素标准品。Cholbiński等^[4]在测定尿液中的BMPEA时,将安非他命作为内标物进行定量分析。但安非他命同样是禁止添加至保健食品的化学合成药,不适合作为保健品分析的内标物。为弥补基质抑制效应,常采用基质标准溶液进行定量分析。鉴于保健品组成成分的唯一性,不同商家的保健样品的基质效应差异很大。为保证准确定量,本方法采用基质标准曲线和标准加入两种方法联合进行定量。对于不含BMPEA和匹卡米隆的保健品,采用阴性基质匹配标准曲线进行分析;对于含有类安非他命和匹卡米隆的保健品,添加不同水平的目标物于样品中,根据线性方程计算分析物的本底值,实现分析物的准确定量。

2.3 质谱参数的优化

由于匹卡米隆和BMPEA的分子结构中含弱碱性氮原子,在电喷雾正离子监测模式下均可获得较好的[M+H]⁺峰。分别以待测物的分子离子峰为母离子进行子离子全扫描,两种化合物均具有较少的特征子离子碎片,特征子离子裂解方式见图 1。选取丰度较强、干扰较小的两个子离子作为定性与定量离子,优化质谱参数时发现,DP电压为35 V时两种化合物的响应达到最高,其他质谱参数见表 1。

图 1 类安非他命和匹卡米隆的质谱裂解方式 Fig. 1 Fragmentation patterns of BMPEA and picamilon

2.4 分析物的定性分析

在Q Trap实现MRM & EPI同时分析的过程中,质谱首先根据待测物MRM进行扫描。当MRM色谱峰强度超过设定的阀值时,自动切换至EPI二级全扫描模式,采集子离子碎片图。分析测定时将样品中的二级碎片与标准品进行谱图检索,提高单一MRM模式下的定性准确度。方法优化了非动态排除干扰进行扫描时的结果,表明该模式下质谱扫描选择性差;采用动态排除干扰后对3个最强峰进行扫描,以3 500 cps作为信号阀值,每10 s进行前级离子扫描,子离子扫描目标性强,BMPEA和匹卡米隆的含量在LOQ水平时均可获得子离子扫描质谱图。胶囊保健品中添加LOQ水平BMPEA和匹卡米隆的色谱-质谱图如图 2所示。

图 2 胶囊保健品中添加LOQ水平的类安非他命和匹卡米隆的总离子流色谱图、离子对丰度比图、MRM色谱图和EPI质谱图 Fig. 2 Total ion current chromatogram,ion abundance ratio figure,MRM chromatograms and EPI mass spectra of BMPEA and picamilon spiked in capsule health products at LOQ levels

2.5 检出限、定量限、线性范围、回收率和精密度

本方法的LOD(S/N≥3)和LOQ(S/N≥10)分别为0.2～0.5 μg/kg和0.5～2.0 μg/kg,在0.2～200.0 μg/kg范围内基质标准溶液的含量(x,μg/kg)和峰面积(y)呈良好线性关系(r≥0.9969)(见表 2)。

表 2 类安非他命和匹卡米隆的检出限、定量限、线性方程、相关系数(r)和线性范围 Table 2 LODs,LOQs,linear equations,correlation coefficients (r) and linear ranges of BMPEA and picamilon

在阴性口服液、胶囊、片剂样品中分别添加1、2、4倍LOQ 的3个水平的试剂混合标准溶液,每个水平平行测定10次,基质匹配标准溶液定量,平均回收率为79.5%～103.8%,RSD为3.6%～15.4%(见表 3)。

表 3 阴性口服液、胶囊、片剂样品中的平均加标回收率和精密度 (n=10) Table 3 Average spiked recoveries and precisions in negative liquid,tablet and capsule samples (n=10)

2.6 实际样品测定

采用本研究建立的方法对148份进口和25份市售保健品进行检测,结果经MRM同步EPI质谱法确证。结果表明所有保健品中均未检出BMPEA和匹卡米隆。

3 结论

本研究建立了超高效液相色谱-三重四极杆线性离子阱质谱测定保健品中类安非他命和匹卡米隆的方法,并联合MRM-EPI技术进行定性。该方法简单可靠,可用于分析复杂基质中的BMPEA和匹卡米隆,为保健品中违禁药物的监督提供了可靠的技术支持。

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