中华医药是祖国的瑰宝,为保证人民身体健康起到了至关重要的作用。与西药的单一组分或简单组分相比,中药原料药组分复杂,且不同产地的原料药具有明显的药效差异。开展原料药产地和归属地鉴别、区分原料药和中成药已成为规范中药的关键。中药属于复杂体系,分析鉴定难度大,对其中的某一种活性成分或有效成分进行测定不能完全反映原料药的本质以及真实的质量状况[1-6]。近年来提出了中药的指纹图谱方法用于中药的鉴别,作为一种有效的分析手段,指纹图谱通过整体的观点研究中药的复杂物质基础[7, 8],已初步实现了中药产品质量的分析和控制[9-13]。其中,色谱指纹图谱以其简便易操作获得了广泛关注。但目前中药色谱指纹图谱仍然存在一些问题:1)即使同一个样品采用相同的处理方式,也可能会有色谱出峰时间和峰强度的变化;2)样品处理方式和色谱条件严重影响色谱峰的保留时间和强度,从而更多影响样品的整体风貌;3)缺乏中药成分标准品导致对具体指标成分定量难[14]。因此,有必要建立科学、合理和规范的指纹图谱中药鉴别方法。
为此,本文提出了以内标为参考,实现对有效成分保留时间和峰强度的相对定量,避免因样品处理方式或色谱条件差异带来的不确定性。利用化学模式识别结合相对强度和保留时间对药品进行归属地确认,提高了归属地的置信度。牛舌草是紫草科多年生的草本植物,是维族医药中最常用的治疗心脑血管疾病的首选药材之一,具有生湿生热、调节异常黑胆质、生湿补脑、爽心悦志、祛寒补心、止咳平喘、润燥消炎等功效[15, 16]。本文以牛舌草为例,以其中的一种活性成分芦丁为标准,借助指纹图谱技术,测定了其他活性成分的相对含量。通过牛舌草多指标成分的相对含量代替具体含量,找到了一种廉价、快速的中药质量鉴别和归属地鉴别的新方法。
高效液相色谱仪配SPD-M20A二极管阵列检测器、DGU-20A5在线脱气机、LC-20AT高压泵、LC-solution工作站(日本岛津公司); Agilent HC-C18色谱柱(250 mm×4.6mm,5 μm,美国Agilent公司); KQ3200DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司); XA-1型多功能粉碎机(江苏姜堰市分析仪器厂)。
甲醇(色谱纯,天津康科德公司),冰乙酸(分析纯,天津赛孚瑞科技),芦丁对照品(纯度≥99%,上海源叶生物科技有限公司),其他试剂为国产分析纯。实验用水为超纯水(过0.22μm微孔滤膜)。
选择巴基斯坦、印度、阿拉伯、新疆叶城、新疆和田、意大利6个不同产地的牛舌草样品(分别标记为S1、S2、S3、S4、S6、S7)和极难获得的印度产牛舌草花样品(标记为S5),由叶尔羌绿洲生态与生物资源重点实验室司马义教授鉴定。各样品经60℃烘干,粉碎,过40目筛,储于样品瓶中备用。对这几种牛舌草样品进行分析、验证,提出方法的可行性。
色谱柱:Agilent HC-C18柱;柱温为室温;进样量为15 μL。以甲醇为流动相A,以0.2%(体积分数,下同)的乙酸水溶液为流动相B;流动相流速为1.0mL/min。梯度洗脱条件:0～33 min,26%A～41%A; 33～40 min,41%A～50%A; 40～50 min,50%A～55%A。检测波长为254 nm。
对照品溶液的配制:精密称取芦丁对照品15.0mg,加甲醇溶解并定容,制成300 mg/L的标准储备溶液。
供试品溶液的配制:准确称取1.000 g牛舌草,置于具塞锥形瓶中,精确加入50.00 mL 80%甲醇水溶液,密塞,精密称定,浸泡过夜,超声20 min,放冷。用上述甲醇溶液补足减失的质量,摇匀,过滤,得到供试样品。
良好的色谱分离是建立色谱指纹图谱的关键,考察了甲醇-水、甲醇-0.2%乙酸水溶液、甲醇-0.2%磷酸水溶液为流动相对分离效果的影响。结果发现,使用甲醇-水作为流动相时,部分组分存在峰拖尾现象,而后两种流动相的分离情况区别不大。考虑到磷酸酸性较强,长期使用会影响色谱柱的使用寿命,故选择甲醇-0.2%乙酸水溶液进行梯度洗脱。对二极管阵列检测器检测波长进行选择,发现吸收波长为254nm时提取液中各组分均有较高的响应值,而且峰形较好,干扰较少,色谱图较为理想,因此选择254 nm作为本试验的检测波长。
按照1.2节所述色谱条件分析6种不同产地的牛舌草及印度牛舌草花,得到7种样品的高效液相色谱图(见图 1)。选择全部样品图谱中主要且共有的峰作为特征峰,共得到9个特征峰,这些峰的面积占总面积的80%以上。如图 1所示,5为芦丁的色谱峰。芦丁价廉易得,因此被选作内标物,样品中其他组分以芦丁为标准进行定量,获得对芦丁的相对含量。
以60%、70%和80%的甲醇水溶液和纯甲醇进行牛舌草样本的提取,发现纯甲醇对图 1中6、9组分的提取效果欠佳,而甲醇水溶液可以提高这两个组分的提取率;但当水的比例增加时,样品溶液难以通过微孔滤膜过滤,如60%的甲醇水溶液浸取液几乎不能通过滤膜被过滤,这可能是由于牛舌草溶出的多糖所致。80%的甲醇水溶液对于6、9组分溶出效果良好,且样品易于过滤制样。因此,选择80%的甲醇水溶液用于样品提取。为了使样品中有效成分充分溶出,选择浸泡过夜后超声,超声时间为20min。
准确吸取适量芦丁标准储备溶液(300mg/L),分别置于10 mL量瓶中,配制质量浓度为6、12、18、24、30、60和90 mg/L的芦丁标准溶液,按本方法进行检测。以峰面积(Y)为纵坐标、对照品质量浓度(X,mg/L)为横坐标求得回归方程Y=33 304X-42 611,r=0.999 9。结果表明芦丁在2～90 mg/L范围内有良好的线性关系。
取产地为意大利的牛舌草供试品溶液15μL,按1.2节的色谱条件检测,重复进样6次,记录芦丁峰面积。结果显示同一样品多次进样检测后,芦丁峰面积信号较为稳定,峰面积的相对标准偏差(RSD)为1.3%,表明色谱仪精密度良好。
取产地为意大利的牛舌草供试品溶液15μL,分别于0、2、4、6、8、12和24 h进样,测定样品中芦丁的峰面积,得到峰面积的RSD为1.9%,表明样品中芦丁的峰面积信号在24 h内稳定,可以满足一个工作日的分析需要。
取产地为意大利的牛舌草样品,分为6份,按本方法进行样品制备,测定每份样品中芦丁的含量。结果显示样品中芦丁平均含量为981.4μg/g,RSD为2.1%,重复样品检测中芦丁的检测结果较为稳定,说明该方法重现性良好。
精密称取产地为意大利的牛舌草样品0.5g,共6份,分别在高、中、低水平下加入芦丁标准品,按照本方法制备样品,进样分析,考察回收率。结果见表 1,平均回收率为102.1%,RSD为1.9%,表明该方法准确度良好。
取6个不同产地的牛舌草样品及印度产牛舌草花样品,按照本方法进行样品制备,注入色谱仪,测定样品中芦丁的含量。由于样品中芦丁的检测具有良好的精密度、稳定性、重现性和加标回收率,为了节约检测成本,以内标物芦丁为标准,样品中其他组分的峰面积均与芦丁相比获得各自的相对含量。结果见表 2。
利用获得的各牛舌草样品中组分含量数据进行化学模式识别,主要进行系统聚类分析及主成分分析。以7种样品的各组分相对含量作为原始数据,获得一个矩阵,每列代表不同的样本,每行代表各组分的相对含量。为了保证结果的可靠性,利于综合测评分析,对原始指标数据进行z-score标准化处理[17, 18],将数据标准化后,运用SPSS 17.0统计分析软件进行系统聚类分析,结果见图 2。
由图 2可知,S2和S7为一类,并与S1属同类,说明印度和意大利产的牛舌草品种极为相近,同时巴基斯坦产的牛舌草与这二者较为相近;S4和S6可归为一大类,但有一定的差异,可能是由于叶城与和田气候与生长环境的差异所致;另外,S3和S5分别为一类。以上结果表明,聚类分析能够很好地把不同生长环境下的牛舌草及牛舌草花严格区分开来。同类牛舌草并不因产地不同和距离远近而受到影响;气候与生长环境的差异可能在某种程度上影响牛舌草提取液的峰特征,但并不能从根本上改变其归类。
将标准化后的数据运用SPSS 17.0统计分析软件进行主成分分析,根据特征值大于1提取主成分。主成分分析的结果为:第一主成分的特征值λ1=4.699,方差贡献率为67.13%;第二主成分的特征值λ2=1.392,方差贡献率为19.89%。这两个主成分的累计方差贡献率为87.02%,因此选取前两个主成分得分矢量作图,得到它们的散点图(见图 3)。由图 3可知,S2和S7为一类并与S1相近,这与聚类分析结果吻合;S4和S6有一定差异,这也与聚类分析结果吻合。同时,结合7种样品的色谱图(图 4),反映了7种样品的直观分类,即S3、S4、S6为一大类,S1、S2、S5、S7为一大类。
由以上结果可以看出,无需更多的标准品,以相对含量代替绝对含量进行聚类分析和主成分分析,可以实现样品的产地或种群识别,这大大节省了资源并提高了分析工作的效率。
本文提出了相对含量结合化学模式识别实现中草药产地区分和类别区分的研究思路。以牛舌草为例,以其中的芦丁作为参照,采用液相色谱指纹图谱技术,对牛舌草中多指标成分进行了相对定量与鉴定方法研究。采用各指标成分的相对含量进行不同产地牛舌草样本的化学模式识别,发现系统聚类分析和主成分分析结果基本吻合,验证了化学模式识别用于中药产地和归类的可行性。主成分分析结果能够反映7种样本的色谱图直观结果。结果表明,无需更多的标准品,相对含量即能够反映不同样本之间的差异,指标成分的相对含量代替真实含量可以节省资源,提高中药成分分析的工作效率。本文提出以内标物用于中药成分峰保留时间和含量的相对确定、利用化学模式识别对归属地进行概率分析的方法不但可以作为中药快速鉴定的新方法,而且可以用于原料药归属地及中成药的鉴别。
2016,
Vol. 34 Issue (9): 901-905
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