色谱  2017, Vol. 35 Issue (1): 80-85   PDF    
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李上富
向丽
蔡宗苇
基于非靶标筛查的超高效液相色谱-三重四极杆质谱法检测尿液样品中的酰基肉碱
李上富 , 向丽 , 蔡宗苇     
香港浸会大学化学系, 环境与生物分析国家重点实验室伙伴实验室, 香港 999077
收稿日期：2016-09-02
基金项目：国家自然科学基金（NSFC21437002）
通讯联系人： 蔡宗苇, Tel:(852)34117070, E-mail:zwcai@hkbu.edu.hk
摘要：建立了一种基于母离子扫描模式的超高效液相色谱-三重四极杆质谱检测尿液中酰基肉碱的分析方法。对酰基肉碱类化合物所共有的m/z为60、85和144的碎片离子进行选择性检测，结合化合物母离子扫描的结果及其对应的保留时间，选取一致性较好的化合物进行筛选，再利用高分辨质谱确认，最终检测到37种酰基肉碱化合物，其中有14种尚未被HMDB和LIPID MAPS数据库收录。该方法可应用于其他生物样本（如血液、组织）中酰基肉碱的定性、定量分析，可作为检测酰基肉碱化合物的新选择。
关键词： 超高效液相色谱-三重四极杆质谱     母离子扫描     质谱特征     酰基肉碱    
Untargeted screening of acylcarnitines in urine by ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry
LI Shangfu, XIANG Li, CAI Zongwei     
Partner State Key Laboratory of Environmental and Biological Analysis, Department of Chemistry, Hong Kong Baptist University, Hong Kong 999077, China
Foundation Item: National Natural Science Foundation of China (No. NSFC21437002)
Abstract: A parent ion scan driven untargeted method was developed for the determination of acylcarnitines in the urine samples by ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry (UHPLC-QqQ MS). The acylcarnitines were extracted with methanol and 1% (v/v) formic acid aqueous solution. After pretreatment, the samples were analyzed without derivatization. The data were acquired by scanning parent ions of three common fragment ions of acylcarnitines, which were m/z 60, 85 and 144. The three obtained chromatograms and their corresponding mass spectra were compared with the recognized acylcarnitine signals. Each parent ion that presented in all the three mass spectra was selected. The chromatograms of these ions were extracted. The generated peaks that had the same retention times in the three chromatograms were considered as candidate acylcarnitines. The structures of these candidates were identified by high resolution MS and MS/MS combined with searching against databases. Authentic standards were employed to confirm the results if they were available. A total of 37 acylcarnitines were identified in the urine samples by the method, including nine short-, 26 medium-and two long-chain acylcarnitines. A number of 14 acylcarnitines of them were unknown compounds which had not been included in the databases. This method could be extended to detect other biological samples, such as blood and tissues, for qualitative or quantitative analysis of acylcarnitines.
Key words: ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (UHPLC-QqQ MS)     parent ion scan     mass spectral characteristics     acylcarnitines    

酰基肉碱是一类由肉碱与酰基结合形成的、彼此结构相似的代谢物。酰基肉碱在细胞代谢过程中发挥着重要作用[1, 2]，其可将长链脂肪酸从胞浆转运至线粒体，从而进行β氧化和三羧酸循环, 为细胞活动提供能量[3]。在酰基肉碱转移酶的作用下，酰基肉碱可以消除线粒体内由酰基辅酶A的代谢中间产物积聚而引起的不良反应[4, 5]。酰基肉碱还涉及丙酮酸、支链氨基酸的氧化和利用[6, 7]。研究发现，酰基肉碱是诊断有机酸血症的重要指标[8]；血液中酰基肉碱的变化也与1型糖尿病和2型糖尿病显著相关[9, 10]; 而环境污染物如全氟辛酸的暴露也会影响酰基肉碱的代谢[11]。这些现象表明, 酰基肉碱与细胞代谢有相当密切的关系, 通过检测它们的含量, 可以间接地了解细胞代谢活动的变化。

不同的脂肪酸及氨基酸氧化产物可形成不同链长的酰基肉碱，其构成了一个成员庞大的同系物家族，广泛存在于各种组织和体液中[12]。基于串联质谱的定量方法已被广泛地应用于酰基肉碱的检测[13], 包括提取后直接检测[14, 15]和盐酸正丁醇衍生化后检测[16, 17]。但是, 由于缺乏足够的标准品, 采用现有方法检测到的酰基肉碱的数目十分有限。因此, 建立一种能够尽可能多地检测酰基肉碱的方法, 不仅有助于深入了解这类化合物的功能, 而且对临床疾病的诊断也有重要意义。本文开发了一种基于母离子扫描模式的超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UHPLC-QqQ MS)检测尿液中酰基肉碱的分析方法, 以冀能为酰基肉碱的测定提供一种新思路。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

Waters ACQUITY超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪(美国Waters公司); Q ExactiveTM Hybrid Quadrupole-Orbitrap质谱仪(美国ThermoFisher Scientific公司); FD 5508冷冻干燥仪(韩国ilShin公司); DS-2510 DT超声仪(上海生析超声仪器有限公司); 5415R离心机(德国Eppendorf公司); TurboVap Ⅱ氮吹仪(美国Zymark公司)。

甲醇(HPLC级)购自美国Merck公司; 甲酸(质谱级)、7种酰基肉碱标准品(乙酰肉碱、丙酰肉碱、丁酰肉碱、3-甲基丁酰肉碱、辛酰肉碱、豆蔻酰肉碱和棕榈酰肉碱)纯度≥97.0%, 均购自美国Sigma-Aldrich公司; 实验用水为Milli-Q水。

1.2 样品前处理

取100 μL健康成人的尿液, 于-20 ℃冷冻干燥8 h, 除去水分。加入300 μL甲醇和3 μL甲酸, 充分混匀, 超声1 min后, 于-20 ℃静置30 min, 使固体颗粒物充分沉淀, 再于4 ℃以13 000 g离心15 min, 取上清液, 用氮气吹干, 残余物用50 μL 5%(v/v)甲醇水溶液复溶, 溶液于4 ℃以13 000 g离心15 min, 取上清液, 待进样分析。

1.3 色谱条件

色谱柱:AcquityTM BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, 美国Waters公司); 柱温:30 ℃; 样品室温度:6 ℃; 流动相:A为0.1%(v/v)甲酸水溶液, B为甲醇; 流速:0.25 mL/min。梯度洗脱条件:0~10.0 min, 5%B~100%B; 10.0~11.0 min, 100%B; 11.0~11.3 min, 100%B~5%B; 11.3 min~15.0 min, 5%B。进样量:10 μL。

1.4 质谱条件

利用Waters公司的三重四极杆质谱仪进行酰基肉碱的检测。离子源:电喷雾离子(ESI)源; 正离子模式; 离子源温度:130 ℃; 锥孔电压:30 V; 毛细管电压:3 200 V; 脱溶剂气流量:10 L/min; 锥孔气流量:2.5 L/min; 脱溶剂气温度:350 ℃。数据采集选用母离子扫描模式, 扫描的母离子分别为m/z 60、85和144;扫描范围:m/z 200~500;扫描时间:0.1 s; 碰撞电压:25 eV。

利用Q Exactive质谱仪对酰基肉碱进行鉴定。电离方式:正离子模式; 鞘气流速:40 L/min; 辅助气流:10 L/min; 喷雾电压:3 000 V; S-透镜反射频率(S-lens RF): 55 Hz; 毛细管温度:350 ℃; 辅助气温度:320 ℃。一级质谱(MS)、二级质谱(MS/MS)扫描分辨率(R)分别为70 000和35 000。

1.5 数据处理

采用MarkerLynx软件对原始数据进行处理, 通过色谱图和质谱图, 获得化合物的保留时间(retention time, RT)和质荷比信息。利用Q Exactive MS采集目标化合物的精确相对分子质量(Mr)和二级质谱数据, 并依据精确Mr检索人类代谢组数据库(Human Metabolome Database, HMDB)[18]和脂质代谢物和代谢通路数据库(LIPID Metabolites and Pathways Strategy, LIPID MAPS)[19], 获得目标化合物可能的结构。再利用高分辨的MS/MS质谱图对化合物的结构进行进一步鉴定和确认。对于有标准品的物质, 利用标准品做最后的比对和确认。

2 结果与讨论
2.1 酰基肉碱的MS/MS特征

酰基肉碱是一类含有肉碱基团(见图 1a)的物质, 其二级质谱图具有相同的碎片离子。丁酰肉碱标准品的二级质谱图见图 1b。该物质的主要碎片离子的m/z为60、85、144和173。通过推断其可能的质谱断裂规律, 发现m/z为60、85和144的离子碎片均来源于肉碱基团(见图 1c)。分析7种酰基肉碱标准品及HMDB数据库中收录的其他酰基肉碱的二级质谱图，发现这类化合物均含有这3种碎片离子。说明同时包含m/z为60、85和144的离子碎片是酰基肉碱的二级质谱特征。根据此特征, 可以利用母离子扫描方式检测样品中酰基肉碱的质谱信号。

图 1 (a)肉碱、酰基肉碱、酰基的结构式，(b)丁酰肉碱标准品的二级质谱图及(c)其碎片离子可能的质谱断裂规律 Fig. 1 (a) Structures of the carnitine, acylcarnitineand acyl group, (b) MS/MS spectrum of the butyryl-carnitine standard sample and (c) the fragmentation schematic of the butyryl-carnitine
2.2 基于特征碎片的UHPLC-QqQ MS检测

利用UHPLC-QqQ MS检测尿液样品中的酰基肉碱。首先, 通过母离子扫描模式分别采集所有包含m/z为60、85和144碎片离子的信号, 得到对应的色谱图(见图 2)。比较得到的色谱图, 发现包含m/z为85的碎片离子的信号强度最高, 这是因为其在二级质谱图中的相对丰度最高; 另外, 3个色谱图中均出现保留时间相同的色谱峰, 这意味着其对应的化合物同时包含了m/z为60、85和144的碎片离子。

图 2 尿液样品中酰基肉碱的总离子流色谱图及对应的一级质谱图 Fig. 2 Total ion chromatograms (TICs) of acylcarnitines in the urine samples and their first order mass spectra

分别提取这3个色谱图对应的一级质谱图(见图 2), 选取相对丰度大于10%的质谱峰进行分析。比较发现, 同时存在于这3个质谱图中且含有相同m/z的质谱峰共有35个，每个共同出现的质谱峰都可能对应着同一个化合物或多个同分异构体。于m/z为60、85和144的3个总离子流色谱图中分别提取每个共同质谱峰对应的选择离子色谱图，并比较其保留时间。如果保留时间一致, 说明它们代表的是同一个化合物; 反之, 则说明它们来源于不同的化合物, 为假阳性信号, 需排除。

2.3 酰基肉碱信号的辨别及假阳性信号的排除

以m/z为246的碎片离子为例，说明如何辨别酰基肉碱信号及如何排除假阳性信号。如图 3所示, m/z为246的选择离子色谱图中均出现保留时间约为4.30 min的色谱峰, 说明这组峰同时包含了m/z为60、85和144的碎片离子, 代表同一个化合物。保留时间约为3.60 min的色谱峰只在图 3b和图 3c中出现, 也就是说, 其对应的化合物不包含m/z为85的碎片离子。根据酰基肉碱的二级质谱裂解特征, 可以确定它是假阳性信号, 应排除; 同样, 在图 3c中，3.80 min的色谱峰也是假阳性信号, 应排除。依据这样的策略, 通过查找保留时间一致的色谱峰, 可以识别出同时包含m/z为60、85和144的碎片离子的信号, 并将其列入可能的酰基肉碱化合物的候选名单中。

图 3 m/z为246的质谱峰对应的选择离子色谱图 Fig. 3 Selected ion chromatograms of the mass spectral peak for m/z 246
2.4 酰基肉碱化合物的鉴定

为确定候选酰基肉碱化合物的结构, 在相同的色谱条件下, 利用高分辨质谱得到精确Mr并采集二级质谱图, 并利用标准品进行比对。同样以m/z为246的化合物为例, 介绍结构确认的流程。首先, 利用高分辨质谱得到其精确Mr为246.170 0, 通过检索HMDB数据库，可知偏差在5×10-6(5 ppm)内的酰基肉碱化合物共有4种, 分别是2-甲基丁酰肉碱、戊酰肉碱、3-甲基丁酰肉碱和新戊酰肉碱。比较样品和这4种酰基肉碱标准品的二级质谱图, 发现虽然主要的碎片离子及其相对丰度分布一致, 但只有3-甲基丁酰肉碱的保留时间与样品化合物完全相同。说明m/z为246.170 0的化合物为3-甲基丁酰肉碱。利用这种方法, 还鉴定出其他4种酰基肉碱, 包括乙酰肉碱、丙酰肉碱、丁酰肉碱和辛酰肉碱。

对于没有标准品的酰基肉碱, 则根据得到的精确Mr和二级质谱图进行结构鉴定, 并利用HMDB和LIPID MAPS数据库搜索并推测其可能的结构。如表 1所示，最终共鉴定得到37种酰基肉碱, 包括9种短链(C2~C5)、26种中链(C6~C12)和2种长链(C13~C21)酰基肉碱, 其中有14种尚未被HMDB和LIPID MAPS数据库收录。实验中只检测到2种长链酰基肉碱, 可能是因为长链酰基肉碱的极性较小，在尿液中的含量较低; 也可能是因为采用甲醇作为样品提取溶剂, 而长链酰基肉碱在甲醇溶液中的溶解度较小。

表 1 尿液样品中鉴定到的37种酰基肉碱的具体信息 Table 1 Information of the 37 identified acylcarnitines in the urine samples
3 结论

本文介绍了一种利用UHPLC-QqQ MS检测尿液样品中酰基肉碱的分析方法。基于母离子的扫描模式选择性地发现了37种酰基肉碱, 包括9种短链、26种中链和2种长链酰基肉碱。该方法操作简单, 除可用于测定已知结构的酰基肉碱, 还可用于鉴定未知结构的酰基肉碱。该方法可应用于其他生物样本(如血液、组织)中酰基肉碱的定性、定量分析, 可作为检测酰基肉碱化合物的新选择。

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