色谱  2017, Vol. 35 Issue (5): 509-519   PDF    
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王成云
李成发
林君峰
谢堂堂
褚乃清
超高效液相色谱/静电场轨道阱高分辨质谱法同时测定塑料食品接触材料中光稳定剂和抗氧化剂的特定迁移量
王成云 , 李成发 , 林君峰 , 谢堂堂 , 褚乃清     
深圳出入境检验检疫局工业品检测技术中心, 广东 深圳 518067
收稿日期：2016-11-15
基金项目：国家质检总局科研项目（2014IK163）
通讯联系人：谢堂堂, E-mail:tangtangxie@139.com
摘要：建立了超高效液相色谱/静电场轨道阱高分辨质谱同时测定塑料食品接触材料中多种光稳定剂和抗氧化剂特定迁移量的方法。采用30 g/L乙酸、体积分数分别为10%、20%、50%的乙醇和油类模拟物（异辛烷）这5种食品模拟物对塑料食品接触材料进行处理，对处理液进行超高效液相色谱/静电场轨道阱高分辨质谱分析，外标法定量。该方法测定的40种目标化合物在相应的范围内均具有良好的线性关系，相关系数均大于0.998，定量限为0.01~1.00μg/L。考察了上述5种食品模拟物中光稳定剂和抗氧化剂的特定迁移量，平均加标回收率为81.46%~94.53%，相对标准偏差为3.25%~9.99%。应用该方法对市售塑料食品接触材料进行了测定，结果在部分样品中检出了不同含量的光稳定剂和抗氧化剂。该方法灵敏度高，定量限低，满足塑料食品接触材料中光稳定剂和抗氧化剂特定迁移量的检测要求。
关键词：超高效液相色谱/静电场轨道阱高分辨质谱    特定迁移量    光稳定剂    抗氧化剂    食品模拟物    塑料食品接触材料    
Simultaneous determination of the specific migration amounts of light stabilizers and antioxidants in plastic materials in contact with foodstuffs by ultra-high performance liquid chromatography/orbitrap high resolution mass spectrometry
WANG Chengyun, LI Chengfa, LIN Junfeng, XIE Tangtang, CHU Naiqing     
Testing and Technology Center for Industrial Products, Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518067, China
Foundation item: General Administration of Quality Supervion, Inspection and Quarantine (AQSIQ) Science and Technology Plan (No. 2014IK163)
Abstract: An effective method was established for the simultaneous determination of the specific migration amounts of light stabilizers and antioxidants in plastic materials in contact with foodstuffs using ultra-high performance liquid chromatography/orbitrap high resolution mass spectrometry (UPLC/Orbitrap HRMS). Plastic materials in contact with foodstuffs were treated by five food simulants:30 g/L acetic acid, 10% (v/v) ethanol, 20% (v/v) ethanol, 50% (v/v) ethanol and fatty food simulant (isooctane). The treated solution was analyzed by UPLC/Orbitrap HRMS. The concentrations of each analyte were calculated by the external standard method. The proposed method showed good linearities with the correlation coefficients above 0.998 for all the 40 target compounds. The limits of quantification (LOQs) varied from 0.01 to 1.00 μg/L for the 40 target compounds. The five food simulants mentioned above were investigated. The average spiked recoveries varied from 81.46% to 94.53% while the relative standard deviations (RSDs) varied from 3.25% to 9.99%. The proposed method was applied to determine the specific migration levels in different simulants of light stabilizers and antioxidants in plastic materials in contact with foodstuffs commercially available. Light stabilizers and antioxidants at various content levels were detected in some samples. The proposed method is sensitive and can meet the requirements of the specific migration limits (SML) of light stabilizers and antioxidants in plastic materials in contact with foodstuffs.
Key words: ultra-high performance liquid chromatography/orbitrap high resolution mass spectrometry (UPLC/Orbitrap HRMS)     specific migration amounts     light stabilizers     antioxidants     food simulants     plastic materials in contact with foodstuffs    

塑料食品接触材料是一类重要的食品接触材料, 对其安全和环保方面有严格的要求[1]。塑料是合成高分子材料, 在加工、使用和贮存过程中易发生氧化分解。为了延缓塑料的氧化分解过程, 延长塑料制品的使用寿命, 往往会在塑料中添加各种光稳定剂和抗氧化剂[2-5]。当塑料制品用于包装食品时, 这些光稳定剂和抗氧化剂以及其分解产物会从塑料制品中迁移到食品中, 造成污染[6]。部分光稳定剂和抗氧化剂对人体和环境有害[6, 7]。各国纷纷制定法律法规限制其使用, 其中UV-320、UV-327、UV-328、UV-350还被列入高关注物质清单中。我国GB 9685-2008和欧盟委员会指令 (EU) No.10/2011对塑料食品接触材料中可能发生迁移的化合物及其向食品或食品模拟物中的特定迁移量均有严格规定。

塑料制品中使用的光稳定剂和抗氧化剂种类繁多, 塑料食品接触材料中光稳定剂和抗氧化剂特定迁移量的测定已有大量文献报道[8-14]。但上述报道中, 有的检测的光稳定剂和抗氧化剂种类较少, 有的检测时间较长, 且检出限均较高。静电场轨道阱高分辨质谱 (Orbitrap HRMS) 是一种新兴的高分辨质谱, 具有高质量精度、高分辨率、高灵敏度和宽动态范围的优点, 并具有匹配超高效液相色谱的扫描速度, 可同时实现定性定量分析, 在消费品中有毒有害物质的筛查和确证方面获得了广泛的应用[15, 16]。本文采用超高效液相色谱/静电场轨道阱高分辨质谱 (UPLC/Orbitrap HRMS) 技术建立了同时测定塑料食品接触材料中多种光稳定剂和抗氧化剂特定迁移量的液相色谱-质谱联用方法, 并应用该方法对市售塑料食品接触材料中光稳定剂和抗氧化剂特定迁移量水平进行了筛查和确证。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

Dionex Ultimate 3000-Q Exactive超高效液相色谱/静电场轨道阱高分辨质谱仪, Hypersil GOLD色谱柱 (100 mm×2.1 mm, 1.9 μm)(美国Thermo Scientific公司), 配电喷雾正负离子 (ESI+、ESI-) 源; N-Evap112氮吹仪 (美国Organomation Associates公司); Buchi R-215旋转蒸发仪 (瑞士Buchi公司)。

乙醇、乙酸和异辛烷均为分析纯, 由国药集团化学试剂有限公司提供; 甲醇 (色谱纯) 由美国Tedia公司提供; 实验用水为经Milli-Q纯水系统处理的超纯水。

标准品信息见附表1(http://www.chrom-china.com/UserFiles/File/1611014-table1.pdf), 各标准储备液均用甲醇配制, 其浓度均约为1 000 mg/L。用甲醇配制质量浓度均约为10 μg/L的各标准溶液。移取适量体积的各标准储备液, 用甲醇配制混合标准储备液。用甲醇将混合标准储备液分别稀释2.5、5、10、25、50、100、250、500、1 000、2 500和5 000倍, 配制系列混合标准工作液。

1.2 特定迁移测试

根据待测样品的预期用途和使用条件, 按EN 13130-1：2004规定的迁移试验方法和试验条件, 分别用10%(体积分数, 下同) 乙醇 (模拟物A)、30 g/L乙酸 (模拟物B)、20%乙醇 (模拟物C)、50%乙醇 (模拟物D1)、异辛烷 (模拟物D2) 浸泡样品。经迁移测试的模拟液 (A、B、C、D1) 用0.22 μm亲水聚四氟乙烯 (PTFE) 滤膜过滤后进行UPLC/Orbitrap HRMS分析。准确移取1 mL模拟液D2, 旋转蒸发至近干, 再用氮气缓慢吹干, 用1 mL甲醇溶解残留物, 用0.22 μm亲水PTFE滤膜过滤后进行UPLC/Orbitrap HRMS分析。必要时, 将滤液进行适当稀释后再进样分析。

1.3 分析条件
1.3.1 色谱条件

色谱柱:Hypersil GOLD色谱柱; 柱温:40 ℃; 样品室温度:7 ℃; 进样量:1.0 μL; 流动相:甲醇和水; 流速:0.3 mL/min。梯度洗脱程序:0~15.00 min, 40%甲醇~90%甲醇; 15.00~20.00 min, 90%甲醇~100%甲醇; 20.00~25.00 min, 100%甲醇; 25.00~30.00 min, 40%甲醇。

1.3.2 质谱条件

可加热的电喷雾离子源, ESI+、ESI-模式; 喷雾电压分别为+3 500和-3 500 V; 毛细管温度为320 ℃; 辅助气加热温度为350 ℃; 鞘气流速为30 mL/min; 辅助气流速为10 mL/min; 扫描方式为全扫描质谱/数据依赖二级质谱 (Full MS/ddMS2); 一级质谱扫描范围为m/z 150~1 500; Full MS分辨率为70 000; ddMS2分辨率为17 500;化合物提取离子窗口宽度为5×10-6(5 ppm)。二级质谱采用高能碰撞诱导解离 (HCD) 方式产生子离子碎片。表 1给出了40种目标化合物的Orbitrap HRMS分析参数和二级质谱归一化碰撞能量 (NCE)。

表 1 40种目标化合物的Orbitrap HRMS分析参数 Table 1 Orbitrap high resolution mass spectrometry (HRMS) analysis parameters of the 40 target compounds
2 结果与讨论
2.1 色谱分离条件的优化

液相色谱-质谱分析常用的流动相有甲醇/水和乙腈/水, 其中水相中还可加入甲酸、乙酸铵来促进离子化, 甲酸有助于提高正离子的信号强度, 但会抑制负离子的信号强度。本试验中, 目标化合物的准分子离子中同时存在正负离子, 且正负离子同时进行测定, 因此不使用甲酸和乙酸铵。对比试验结果表明, 使用乙腈/水作为流动相时, 大部分组分间的分离较好, 但部分组分间仍然分离不佳甚至完全未分离; 使用甲醇/水作为流动相时, 各组分间的分离较差, 但各组分的信号强度明显增大。进行液相色谱-质谱分析时, 采用提取离子色谱峰面积进行定量, 只要提取离子间互不干扰, 并不需要实现各组分间的基线分离就可准确定量, 因此选择甲醇/水作为流动相。改变起始流动相的组分和洗脱梯度, 考察各组分间的分离情况和信号强度的变化, 最终确定的色谱分离条件见1.3.1节。在此条件下对40种目标化合物的标准溶液进行分析, 确定每种目标化合物的保留时间。同时对40种目标化合物的混合标准工作液进行分析, 所得UPLC/MS总离子流图见图 1, 其中BP、UV-P、UV-320、UV-324、UV-326、UV-327、UV-328、UV-329、UV-350等9种组分采用正离子模式, 其余31种组分采用负离子模式。图 1a是正离子模式下9种组分的UPLC/MS总离子流图, UV-326和UV-320、UV-328和UV-327的峰分别重合在一起。图 1b是负离子模式下31种目标化合物的UPLC/MS总离子流图, irganox 300和BHT、irganox 1035和irganox 1790、irganox 565和irganox 330、irganox 1726和UV-360的峰分别重合在一起, irganox 697与antioxidant 2246未完全分离, antioxidant CA、irganox 425、UV-531与sumilizer AG 80未完全分离。

图 1 混合标准溶液的UPLC/MS总离子流图 Fig. 1 Total ion chromatograms of mixed standard solution by UPLC/MS Peak Nos. are the same as those in Table 1.
2.2 定量分析

Orbitrap HRMS利用提取离子色谱峰面积进行定量检测, 在总离子流图中未完全分离甚至是重合的多个组分, 当其提取离子之间互不干扰时, 均可准确定量检测。根据各组分的准分子离子[M+H]+或[M-H]-的精确质量数理论值提取各离子的色谱峰, 提取离子窗口宽度均为5×10-6(5 ppm)。图 2给出了各组分的提取离子, 其中图 2a是正离子模式下的9种提取离子, 图 2b~2d是负离子模式下的31种提取离子。从图 2可以看出, 在总离子流图中未完全分离甚至完全重合的各组分, 其提取离子之间均互不干扰, 不影响其定量。根据提取离子色谱图确定各组分准分子离子的精确质量数测定值, 并计算与其理论值之间的误差。结果表明, 40种目标化合物准分子离子的精确质量数测定值与理论值之间的误差均小于2×10-6(2 ppm), 符合欧盟法规SANCO/12571/2013对高分辨质谱定性鉴定的质量准确度要求 (＜5×10-6(5 ppm))。

图 2 40种目标化合物的提取离子色谱图 Fig. 2 Extracted ion chromatograms of the 40 target compounds
2.3 二级质谱条件的优化

Orbitrap HRMS利用目标化合物的保留时间和准分子离子的精确质量数进行定性鉴定, 利用HCD产生的二级子离子进行确证。欧盟指令2002/657/EC规定, 使用高分辨质谱进行定性时, 至少需要4个识别点才能进行确证。在高分辨质谱中, 1个一级母离子和1个二级子离子分别可获得2.0和2.5个识别点。因此至少需要1个一级母离子和1个二级子离子才能进行确证。在实际操作中, 通常要求有3至4个二级子离子, 以确保确证的可靠性。一级母离子经HCD碰撞后产生二级子离子, 碰撞能量不同时, 产生的二级子离子碎片的丰度各不相同。当碰撞能量较低时, 高质量端的二级子离子碎片较多。随着碰撞能量的增加, 高质量端的二级子离子碎片不断减少甚至消失, 而低质量端的二级子离子碎片则不断增加。改变NCE, 使其分别为20%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90% HCD, 对混合标准溶液进行分析, 观察不同NCE下二级子离子碎片的丰度变化, 最终确定的NCE值见表 1。

2.4 方法评价
2.4.1 线性关系和定量限

按1.3节条件对混合标准工作液进行测试, 以目标化合物提取离子色谱峰面积 (A) 对其质量浓度 (ρ, 单位μg/L) 作图。结果表明, 在所示的质量浓度范围内, 每种目标化合物的提取离子色谱峰面积均与其质量浓度线性相关, 相关系数均大于0.998。Orbitrap HRMS基线噪声极低, 根据信噪比 (S/N) 计算检出限 (LOD)、定量限 (LOQ) 时可能会存在较大误差。本文按公式LOD=3Sb/b来计算检出限, 按公式LOQ=10Sb/b来计算定量限, 式中Sb是20次空白测定值的标准偏差, b是校正曲线的斜率。表 2给出了方法的线性关系和检出限、定量限。

表 2 40种目标化合物的线性方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限 Table 2 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients (r), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the 40 target compounds
2.4.2 基质效应

用不含目标化合物的苯乙烯-丁二烯-丙烯腈共聚物 (ABS) 作为空白样品, 按1.2节方法进行浸泡, 参照文献[17]进行基质效应 (ME) 测试, 分别用浸泡液 (A、B、C、D1) 作为基质溶液, 并用于配制系列浓度的混合标准溶液工作液。同时测定分别用基质溶液和甲醇配制的混合标准溶液工作液, 绘制各标准曲线。按公式ME=(kM/ks-1)×100%来计算基质效应, 式中kM、ks分别为基质溶液和甲醇标准溶液的标准曲线斜率, ME值越小, 则基质效应越弱[18]。当ME在±20%范围内时, 可以不考虑基质效应的影响[19]。试验结果表明, 用基质溶液配制混合标准溶液工作液时, 正离子的ME值为-14%~15%, 负离子的ME值为-8%~17%, 均在±20%范围内。可见, 正负离子模式下基质效应均不强, 可以忽略。

2.4.3 回收率和精密度

精密度随目标化合物的浓度以及基质类型的不同而异, 本文采用空白样品加标的方式进行回收率试验。按照EN 13130-1：2004规定的迁移实验原则, 分别取适量食品模拟物, 添加3个不同水平的混合标准溶液, 测定加标回收率, 每个添加水平各测定9个平行样, 计算方法的平均加标回收率和精密度, 结果见表 3。方法的平均加标回收率为81.46%~94.53%, 精密度为3.25%~9.99%。

表 3 40种目标化合物在不同食品模拟液中的加标回收率和精密度 (n=9) Table 3 Spiked recoveries and precisions of the 40 target compounds in different food simulants (n=9)
2.5 实际样品的快速筛查和确证

Dionex Ultimate 3000-Q Exactive超高效液相色谱/静电场轨道阱高分辨质谱仪提供了一款软件TraceFinder, 用于大批量样品中目标化合物的自动筛查和确证, 方法选择性好, 假阳性率低。本文利用TraceFinder软件建立了塑料食品接触材料中19种光稳定剂和21种抗氧化剂的快速筛查和确证方法。首先, 对40种目标化合物标准溶液进行分析, 建立1个包含各目标化合物的保留时间、分子式、同位素分布、准分子离子及其精确质量数、主要二级子离子碎片的丰度及精确质量数等信息的数据库。对于未知样品, 通过TraceFinder软件采集数据, 并利用建立的数据库自动识别出阳性样品。根据欧盟法规SANCO/12571/2013的规定, 应用高分辨质谱进行定性时, 至少应有1个碎片离子且其精确质量数偏差 < 5×10-6(5 ppm)。本文根据保留时间和精确质量数这两个关键因素判定是否是阳性样品。在提取离子色谱图中, 在预期的保留时间±20 s范围内, 有色谱峰出现, 且该色谱峰对应的离子精确质量数测定值与预期的准分子离子精确质量数理论值之间的偏差不超出5×10-6(5 ppm), 则可初步判断为阳性样品。对于筛选出来的阳性样品, 进行二级质谱分析, 利用二级子离子进行确证。如果主要二级子离子碎片的相对丰度基本一致, 且其精确质量数偏差不超出5×10-6(5 ppm), 即可确证。采用上述方法对1 847个市售塑料食品接触材料进行了快速筛查和确证, 结果见表 4。其中irganox 1010的检出率最高, 达5.0%；其次是BHT和DBP, 其检出率分别为4.2%和2.7%。其中13个样品中BHT的特定迁移量超出限量值, 5个样品中BP的特定迁移量超出限量值。

表 4 实际样品测试结果 Table 4 Analytical results of real samples

图 3a是检出irganox 1010的阳性样品的UPLC/MS总离子流图, 在19.56 min处有尖锐谱峰, 该时间与irganox 1010的保留时间 (19.58 min) 基本一致。

图 3 某阳性样品的 (a) UPLC/MS总离子流图、(b) 一级全扫描质谱图、(c) 二级HCD质谱图和 (d) irganox 1010标准溶液的二级HCD质谱图 Fig. 3 (a) UPLC/MS total ion chromatogram, (b) full-scan mass spectrum, high energy collision dissociation (HCD) mass spectra of (c) a positive sample and (d) irganox 1010 standard solution

图 3b是该谱峰对应的一级全扫描质谱局部图, 在m/z 1175.77832处有尖锐谱峰。irganox 1010的分子式为C73H108O12, 其准分子离子[M-H]-的精确质量数理论值为m/z 1 175.776 80, 提取离子窗口宽度为5×10-6(5 ppm), 即提取离子范围为m/z 1 175.770 92~1 175.782 68。在图 3b中irganox 1010准分子离子的提取离子窗口内只有1个谱峰m/z 1 175.778 32, 与理论值的精确度偏差为1.69×10-6(1.69 ppm), 符合欧盟法规SANCO/12571/2013对高分辨质谱定性鉴别的质量精确度要求, 可以判断该谱峰为irganox 1010的准分子离子峰。根据保留时间和准分子离子的精确质量数, 可以初步判断该样品中检出irganox 1010。为确证该样品中含有irganox 1010, 进行了二级质谱分析。图 3c和3d分别是样品和irganox 1010标准溶液的二级HCD质谱图, 二者的主要碎片离子及相对丰度基本一致, 各主要碎片离子的质量精确度偏差均小于5×10-6(5 ppm)。图 3c和3d中均有5个稳定的碎片离子, 根据欧盟指令2002/657/EC的规定, 1个母离子和1个子离子的识别点分别为2.0和2.5, 在图 3c和3d中, 总识别点均为12.0, 远远超出欧盟指令2002/657/EC要求至少需要4个识别点才能确证的规定。因此, 利用二级质谱可确证该样品中含有irganox 1010。

3 结论

采用UPLC/Orbitrap HRMS技术建立了同时测定多种光稳定剂和抗氧化剂的液相色谱-质谱联用分析方法, 对塑料食品接触材料中19种光稳定剂和21种抗氧化剂的特定迁移量进行了快速筛查和确证。该方法具有良好的线性关系、精密度和回收率, 定量限低。应用该方法对市售塑料食品接触材料在5种食品模拟物中的特定迁移量进行考察, 结果检出了不同特定迁移量水平的多种目标化合物, 且部分样品的特定迁移量水平高于法规限量, 其风险不容忽视。

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