二维系统开始运行的第一步是两个十通阀中的1位与10位相连 (1-10) 时 (见图 1a), 一定体积的样品通过进样阀被第一维的恒流泵 (P₁) 泵入GFC分析柱 (C₁) 中, 并经过第二维的SAX捕集柱 (T₁) 和SCX捕集柱 (T₂) 后流进废液池 (W), 流路为P₁-C₁-T₁-T₂-W (见表 1); 流动相分别被第二维的两个梯度泵 (P₂和P₂′) 泵入SAX捕集柱 (T₁′) 和SCX捕集柱 (T₂′) 后，再经过SAX分析柱 (C₂) 和SCX分析柱 (C₂′), 最终流进两个紫外检测器 (UV和UV′), 流路分别为P₂-T₁′-C₂-UV和P₂′-T₂′-C₂′-UV′。在第一步运行过程中, 第一维处于样品分析的死时间过程, 第二维处于系统平衡状态。当死时间结束时开始运行第二步, 此时的流路与第一步相同, 区别是第一维处于样品富集状态。在第一维完成第一次富集后, 切换两个十通阀, 使1位与2位相连 (1-2), 开始运行第三步 (见图 1b)。此时, 第一维将样品富集在另外两根捕集柱 (T₁′和T₂′) 中, 流路为P₁-C₁-T₁′-T₂′-W; 第二维的P₂和P₂′则将上一步富集在T₁和T₂中的样品反冲至C₂和C₂′中以进行分离, 流路分别为P₂-T₁-C₂-UV和P₂′-T₂-C₂′-UV′。第四步是将两个十通阀再次切换至1-10状态, 原理与第三步相同, 第一维的流路是P₁-C₁-T₁-T₂-W, 第二维的流路分别是P₂-T₁′-C₂-UV和P₂′-T₂′-C₂′-UV′。从第三步开始, 第一维一直处于样品富集状态, 第二维一直处于样品分离状态, 且每一步的运行时间相同, 重复第三步和第四步直至第一维分离结束。

表 1 (Table 1)

表 1 两个十通阀的状态及流动相在3种分离模式中的流路 Table 1 Positions of two 10-port valves and flow paths of mobile phases in the three separation modes Step Position of two valves GFC separation mode SAX separation mode SCX separation mode Time/min Pathway Status Pathway Status Pathway Status 1 1-10 P1-C1-T1-T2-W dead time P2-T1′-C2-UV equilibrium P2′-T2′-C2′-UV′ equilibrium 0-40 2 1-10 P1-C1-T1-T2-W enrichment P2-T1′-C2-UV equilibrium P2′-T2′-C2′-UV′ equilibrium 40-46 3 1-2 P1-C1-T1′-T2′-W enrichment P2-T1-C2-UV separation P2′-T2-C2′-UV′ separation 46-52 4 1-10 P1-C1-T1-T2-W enrichment P2-T1′-C2-UV separation P2′-T2′-C2′-UV′ separation 52-58 Repeated step 3 and step 4 every six minutes until the end of the first dimensional separation. P1, P2, P2′, C1, C2, C2′, T1, T1′, T2, T2′, W, UV, UV′ were the same as in Fig. 1.

表 1 两个十通阀的状态及流动相在3种分离模式中的流路 Table 1 Positions of two 10-port valves and flow paths of mobile phases in the three separation modes

本实验中, 针对蛋白质组成复杂、相对丰度差异大的特点, 第一维采用GFC常规分析柱, 将蛋白质按尺寸不同进行分离; 第二维采用IEC常规分析柱, 将第一维洗脱馏分根据离子交换能力的不同进一步分离。常规柱的柱容量较大, 相比小柱容量的色谱柱, 能够提高进样量, 从而提高检测灵敏度。同时常规色谱柱的使用还可获得更好的重复性和稳定性, 为后续实验中蛋白质在线酶解、肽段在线分离及质谱鉴定做好铺垫。在全二维液相色谱中, 第一维的流出组分需被第二维分离3次以上才能保证第一维的分辨率基本不变^[15], 因此第一维采用低流速 (0.1 mL/min, 142 min) 等度洗脱, 第二维采用高流速 (2.0 mL/min, 6 min) 梯度洗脱。基于对蛋白质等电点范围的考虑, 进一步结合中心切割平行柱的方法, 在第二维并联SAX和SCX分析柱, 实现对蛋白质全等电点范围的全二维分离。

GFC/2×IEC全二维液相色谱分离系统第一维流动相的pH为7.5(GFC常规柱), 第二维流动相的pH分别为7.5(SAX分析柱) 和5.6(SCX分析柱)。当洗脱液从区域Ⅰ流向区域Ⅱ中的T₁或T₁′时, 流动相的pH为7.5, 此时样品中蛋白质pI小于7.5的部分将带负电, 可被T₁或T₁′捕集, 蛋白质pI大于或等于7.5的部分将带正电或不带电, 不能被T₁或T₁′捕集, 继续流向区域Ⅲ中的T₂或T₂′。在区域Ⅱ和Ⅲ之间添加一个调整流动相pH的泵^[6], 以10:1(v/v) 的稀释比例对流动相的pH进行调节, 使进入T₂或T₂′的流动相替换成pH为5.6的流动相, 此时样品中pI值大于5.6的蛋白质带正电, 在区域Ⅱ中没有被T₁或T₁′捕集的蛋白质被区域Ⅲ中的T₂或T₂′捕集, 进而反冲至C₂′中继续分离。

2.2 色谱条件的优化及性能评价

在凝胶过滤色谱分离中, 当流动相一定时, 流速对生物大分子的分辨率影响较小^[16]。实验考察了不同流速下, 酵母细胞蛋白质提取液在GFC中的分离情况。结果表明, 酵母细胞蛋白质在低流速和高流速下的色谱峰形基本一致, 考虑到两维之间分析时间和分离速度的匹配性, 最终选择0.1 mL/min的洗脱流速进行等度洗脱。同时考虑到两维之间流动相的匹配性, GFC分离体系选择与SAX分离体系中初始条件相同的流动相作为洗脱溶剂, 排除流动相的不兼容问题。酵母细胞蛋白质的色谱图见图 2。

图 2

Fig. 2

图 2 采用GFC时酵母蛋白质的色谱图 Fig. 2 Chromatogram of the yeast protein by using GFC 1-17: cutting times; column: TSK-GEL G3000SWXL (300 mm×7.8 mm, 5 μm); mobile phase: 10 mmol/L phosphate buffer (pH 7.5); isocratic elution; flow rate: 0.1 mL/min; injection volume: 5 μL; UV detection wavelength: 280 nm.

第二维IEC的分离情况受流动相的pH、盐浓度和流速等因素的影响较大。为调节流动相的pH, 缓冲液选择缓冲范围较宽的NaH₂PO₄和Na₂HPO₄缓冲体系。第二维IEC使用硅胶基质型色谱柱, pH适用范围为2.0~8.0, 因此将第二维SAX分离体系流动相的pH设为7.5, 对pI值小于7.5的蛋白质进行分离; 第二维SCX作为并联色谱柱与SAX色谱柱同时使用, 用来分离pI值大于或等于7.5的蛋白质, 所以流动相的pH设为5.6。分别将流动相的pH设为5.6和7.5，不但可以实现全等电点范围的蛋白质的分离需求, 还可满足生物样品对生存环境的要求, 具有良好的生物兼容性。为使第二维能够快速完成分离, 选择在流动相中加入1 mol/L的NaCl，并以2 mL/min的流速进行梯度洗脱, 由于捕集柱与分析柱填料相同, 而且是柱长分别为10 mm和100 mm的常规色谱柱, 所以在高流速的分离过程中压力相对较低, 系统适用性良好。为使第二维的SAX和SCX分离同步, 选择相同的洗脱程序, 优化后的洗脱程序见1.4.2和1.4.3节。采用SAX和SCX色谱柱时, 酵母蛋白质的色谱图分别见图 3a和图 3b, 可以看出, 酵母细胞蛋白质在SAX色谱柱中保留较强, 因此在第二维分离中将SAX色谱柱置于SCX色谱柱前, 构成两根分析柱并联的结构。

图 3

Fig. 3

图 3 酵母蛋白质在 (a) SAX和 (b) SCX色谱柱中的色谱图 Fig. 3 Chromatograms of the yeast protein by (a) the SAX and (b) SCX columns a. column: Hypersil SAX (100 mm×4.6 mm, 10 μm); mobile phase A: 10 mmol/L phosphate buffer (pH 7.5); mobile phase B: 1 mol/L NaCl in 10 mmol/L phosphate buffer (pH 7.5); gradient elution: 0-4.50 min, 0%B-100%B, 4.50-4.51 min, 100%B-0%B, 4.51-6.00 min, 0%B; flow rate: 2.0 mL/min; injection volume: 5 μL; UV detection wavelength: 280 nm. b. column: Hypersil SCX (100 mm×4.6 mm, 10 μm); mobile phase A: 10 mmol/L phosphate buffer (pH 5.6); mobile phase B: 1 mol/L NaCl in 10 mmol/L phosphate buffer (pH 5.6); other conditions are the same as SAX separation.

二维在线分离系统良好的重复性是进行分离分析的首要基础, 根据文献^[7]对二维分离系统重复性的评价方法, 选择酵母细胞蛋白质提取液作为样品，对全二维液相系统的重复性进行评价。分别对第一维GFC分离体系和第二维SAX和SCX分离体系进行重复实验, 并对酵母细胞蛋白质的保留时间和峰面积进行分析。结果表明, 在GFC分离体系中选取4个色谱峰进行评价 (见图 4), 其保留时间和峰面积的相对标准偏差 (RSD) 分别为0.03%~0.34%和2.57%~7.62%(n=3);在SAX分离体系中选取5个色谱峰进行评价 (见图 5a), 其保留时间和峰面积的RSD分别为0.24%~1.25%和1.26%~4.81%(n=5);在SCX分离体系中选取5个色谱峰进行评价 (见图 5b), 其保留时间和峰面积的RSD分别为0.03%~0.59%和1.27%~7.51%(n=5)。结果表明, 第一维和第二维色谱分离均具有良好的重复性, 为酵母细胞蛋白质提取液的二维分离分析奠定了良好基础。

图 4

Fig. 4

图 4 采用GFC时酵母蛋白质的色谱图 (n=3) Fig. 4 Chromatograms of the yeast protein by using GFC (n=3) Analytical conditions were the same as in Fig. 2. Peaks 1-4 represent four levels of the yeast protein from large to small according to the molecular weight.

图 5

Fig. 5

图 5 酵母蛋白质采用 (a) SAX和 (b) SCX色谱柱时的色谱图 (n=5) Fig. 5 Chromatograms of the yeast protein by using (a) SAX and (b) SCX columns (n=5) Analytical conditions were the same as in Fig. 3. Peaks 1-5 represent five levels of the yeast protein from positive charge to negative charge and less to more (in Fig. 5a), or negative charge to positive charge and less to more (in Fig. 5b) according to the electric properties, respectively.

2.3 酵母细胞蛋白质的全二维分离

本文将GFC和IEC两种分离模式结合, 构建的在线二维分离系统在第二维并联两根保留机理不同的离子交换柱实现了全二维分离, 大大提高了峰容量和分离能力。此外, 在线的分离模式^[17]相比于离线分离模式^[18], 可减少样品损失、节省分析时间并实现分离系统的自动化运行。实验所用的酵母蛋白质通过BCA (bicinchonininc acid) 浓度测定法测得其浓度为13.5 mg/mL。实验所用酵母提取液中存在1 484种蛋白质^[19], 其种类繁多, 分子尺寸和等电点分布广泛^[20], 适合用来评价二维分离系统的分离能力。

在二维分离过程中, 样品先通过进样阀进入第一维GFC分析柱中, 将蛋白质按相对分子质量大小进行初筛, 当第一维分析的死时间结束时, 带有不同带电性质的蛋白质依次被SAX和SCX捕集柱捕集, 进而被两个十通阀切换到第二维SAX和SCX分析柱中进一步分离。

本实验在第一维GFC分离体系中分别尝试了12 min和6 min的捕集时间, 第二维SAX和SCX分离体系的分析时间对其应。当第一维GFC分离体系的捕集时间为12 min时, 第一维馏分切割了8次, 切割的馏分全部导入第二维SAX和SCX分离体系继续分离, 对应的酵母蛋白质的色谱图见图 6; 当第一维GFC分离体系的捕集时间为6 min时, 第一维馏分切割了17次, 对应色谱图见图 7。可以看出, 酵母蛋白质经过17次切割后, 获得了更多的色谱峰, 体现出二维分离体系在分离复杂样品时具有较强的分离能力。

图 6

Fig. 6

图 6 第一维馏分切割8次时酵母蛋白质的色谱图 (100 μL) Fig. 6 Chromatograms of the yeast protein of the first dimensional fractions by cutting 8 times (100 μL) Second dimensional ion exchange chromatography (IEC) separation conditions: a. column, Hypersil SAX (100 mm×4.6 mm, 10 μm); mobile phase A, 10 mmol/L phosphate buffer (pH 7.5); mobile phase B, 1 mol/L NaCl in 10 mmol/L phosphate buffer (pH 7.5); gradient elution, 0-8.00 min, 0%B-100%B, 8.00-8.01 min, 100%B-0%B, 8.01-12.00 min, 0%B; flow rate, 1.0 mL/min; UV detection wavelength, 280 nm; b. column, Hypersil SCX (100 mm×4.6 mm, 10 μm); mobile phase A, 10 mmol/L phosphate buffer (pH 5.6); mobile phase B, 1 mol/L NaCl in 10 mmol/L phosphate buffer (pH 5.6); other conditions are the same as in Fig. 6a.

图 7

Fig. 7

图 7 第一维馏分切割17次时酵母蛋白质的色谱图 Fig. 7 Chromatograms of the yeast protein of the first dimensional fractions by cutting 17 times First dimensional GFC separation (injection volume 100 μL) was cut for 17 times, and the other analytical conditions were the same as in Fig. 3.

峰容量可以更加直观地体现二维系统的分离能力, 同时也是描述二维系统分离能力的指标^{[21, 22]}。一维峰容量的计算方法^[2]为n_c=L/(4σ), 式中n_c、L(min) 及4σ(min) 分别表示一维峰容量、有效洗脱时间及平均峰宽; 二维系统总峰容量计算方法^[2]为n_c′=n_c×c_t, 式中n_c′及c_t分别表示二维峰容量和一维切割次数。本实验考察了第一维分别进行8次和17次切割时, 第二维IEC对应的总峰容量 (根据二维系统峰容量公式计算), 结果见表 2。可以看出, 第一维经过17次切割后, 无论是一维峰容量还是二维系统的总峰容量均高于切割8次后的峰容量。在总分离时间148 min内, 第一维GFC分离体系馏分经过17次切割, 二维系统获得的峰容量总和达到了884, 与参考文献^[2]中的峰容量890相差无几, 且单位时间内同样获得了可观的峰容量, 体现出该系统在蛋白质分离分析中具有一定的应用前景。

表 2 (Table 2)

表 2 第二维SAX和SCX分离的总峰容量及相关参数 Table 2 Total peak capacities and correlation parameters of the second dimensional SAX and SCX separations Cutting time Effective elution time/min Second dimensional SAX Second dimensional SCX Average peak width/min Peak capacity Total peak capacity Average peak width/min Peak capacity Total peak capacity 8 8.0 0.47 17 136 0.49 16 128 17 4.5 0.16 28 476 0.19 24 408

表 2 第二维SAX和SCX分离的总峰容量及相关参数 Table 2 Total peak capacities and correlation parameters of the second dimensional SAX and SCX separations

3 结论

本文基于酵母蛋白质的尺寸及带电性质, 构建了GFC/2×IEC全二维液相色谱分离系统, 实现了全等电点范围酵母蛋白质的分离。同时考虑到蛋白质在后续酶解、分离、质谱鉴定等一系列实验中对样品量的要求, 在二维系统的构建中选择了常规尺寸的分析柱, 保证了后续实验的样品量。因此构建的全二维分离系统可用于蛋白质组学研究平台中蛋白质的初分离。

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