二维超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱联用快速测定全血和尿液中鱼藤酮


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张晓艺¹ , 张秀尧¹ , 蔡欣欣¹ , 李瑞芬¹ , 林学尧² , 林洁²

1. 温州市疾病预防控制中心, 浙江温州 325001;
2. 瑞安市疾病预防控制中心, 浙江瑞安 325200

收稿日期：2016-12-12

通讯联系人：张秀尧, Tel:(0577)55597838, E-mail:xyzwz123@126.com

摘要：建立了采用二维超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱联用快速测定全血和尿液中鱼藤酮的检测方法。尿液经水等量稀释后直接进样分析；全血用乙腈沉淀除蛋白质，上清液用水稀释后进样分析。样品中的鱼藤酮被Cyclone柱保留并去除大分子杂质，然后再被流动相洗入第1维Kinetex Biphenyl色谱柱（联苯基核壳柱）进行分离，再将含有鱼藤酮的流分切割至第2维Acquity BEH C₈色谱柱上进行分离，采用多离子监测触发的增强子离子（MRM-IDA-EPI）扫描方式检测，溶剂标准外标法定量。全血和尿液中的平均加标回收率分别为84.6%~94.3%和88.4%~95.7%，相对标准偏差为2.6%~7.3%和2.8%~6.8%（n=6），方法的检出限为0.2和0.03μg/L。该方法已成功应用于鱼藤酮中毒样品的检测。

关键词：二维超高效液相色谱三重四极杆/复合线性离子阱质谱中心切割鱼藤酮全血尿液

Rapid determination of rotenone in whole blood and urine by two-dimensional ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole/linear ion trap mass spectrometry

ZHANG Xiaoyi¹, ZHANG Xiuyao¹, CAI Xinxin¹, LI Ruifen¹, LIN Xueyao², LIN Jie²

1. Wenzhou Municipal Center for Disease Control and Prevention, Wenzhou 325001, China;
2. Ruian Center for Disease Control and Prevention, Ruian 325200, China

Abstract: The two-dimensional ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole/linear ion trap mass spectrometry (2D-UPLC-QTRAP MS) method has been developed for the determination of rotenone in whole blood and urine. This method is based on the use of two columns of different stationary phases (Kinetex Biphenyl and Acquity BEH C₈) connected through two six-port two-position switching valves. Urine samples were diluted with equal quantity of water and then directly injected into the separation system. Blood samples were prepared by precipitation of proteins with acetonitrile, and then the supernatants were diluted with water and injected into the system. The samples were loaded onto the Cyclone column at high flow-rates, allowing the excluded proteinaceous material to flow through to waste. Then the retained rotenone was eluted into the Kinetex Biphenyl column, and the first dimension separation was completed. The fraction containing rotenone was switched into a trap column (XBridge C₈ Direct Connect HP). After the rotenone was retained completely by trap column, the valve switched it into the stream of the second dimension. The rotenone was separated on the Acquity BEH C₈ column with gradient elution of mobile phases of acetonitrile-H₂O containing 0.2% (v/v) formic acid, detected by positive electrospray ionization tandem mass spectrometry in the multiple reaction monitoring-information-dependent acquisition-enhanced product ion (MRM-IDA-EPI) mode, and quantified by solvent standard solutions. The average recoveries were 84.6%-94.3% and 88.4%-95.7% for rotenone in blood and urine with relative standard deviations of 2.6%-7.3% and 2.8%-6.8% (n=6). The limits of detection were 0.2 and 0.03 μg/L for blood and urine, respectively. The method is sensitive, selective, and has been successfully applied to the detection of rotenone in the samples resulting in food poisoning.

Key words: two-dimensional ultra-performance liquid chromatography (2D-UPLC) triple quadrupole/linear ion trap mass spectrometry (QTRAP MS) heart-cutting rotenone whole blood urine

鱼藤酮 (rotenone) 属双氢异黄酮衍生物 (见图 1), 存在于热带及亚热带地区豆科鱼藤属和豆薯属植物中, 如地瓜籽、苦檀子等, 曾一直被认为是安全有效的农用杀虫剂, 具有高效、低毒、广谱、杀虫快、残留期短等特点, 广泛应用于农作物病虫害的防治和鱼塘清理。但最近的研究表明鱼藤酮是线粒体复合体Ⅰ的抑制剂, 具有多巴胺神经元毒性, 可以使大鼠产生与帕金森病相似的症状, 如运动迟缓、肌肉僵直、震颤等。对于人类, 鱼藤酮属中等毒性毒物, 口服致死量约为300~500 mg/kg体重^[1-4]。中毒时先兴奋延髓中枢, 引起呼吸中枢兴奋和惊厥, 继而发生呼吸中枢及血管运动中枢麻痹, 大剂量时可直接抑制心脏, 使心跳减慢, 最终导致死亡。

图 1 鱼藤酮的化学结构 Fig. 1 Chemical structure of rotenone

鱼藤酮的检测方法主要有液相色谱-串联质谱联用 (LC-MS/MS) 法^[5-7]、液相色谱紫外检测法^{[8, 9]}和气相色谱-质谱联用法^[10]等, 但以上方法的测定对象多为食物和植物。有报道^[11]采用LC-MS/MS法测定人血清中的鱼藤酮, 检出限达2 μg/L, 但该法测定的是血清, 与全血中鱼藤酮的含量并不一定相关, 且未应用于实际样品的测定。

二维超高效液相色谱 (two-dimensional ultra performance liquid chromatography, 2D-UPLC) 技术具有峰容量大、能够显著降低复杂样品基质效应、可实现样品分析自动化等优点, 已成为复杂样品分离分析的有力工具, 在中药有效成分分析、环境科学、药物分析等领域应用广泛^[12]。本研究采用中心切割二维超高效液相色谱技术同时对样品进行净化和分离, 消除了基质效应, 使用三重四极杆/复合线性离子阱质谱技术进行检测, 建立了全血和尿液中鱼藤酮的检测方法, 方法简便、灵敏、准确。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

二维超高效液相色谱仪由Acquity UPLC QSM四元溶剂管理系统 (第1维)、Acquity UPLC BSM二元溶剂管理系统 (第2维)、Acquity UPLC FTN样品管理系统和Acquity UPLC CM-A色谱柱管理系统组成, 稀释泵为515泵, 由Empower 3工作站控制 (美国Waters公司); QTRAP 6500三重四极杆/复合线性离子阱串联质谱仪由Analyst 1.6.2软件控制 (美国AB SCIEX公司); MS3旋涡混旋器 (德国IKA-WERKE公司); 3-30K高速冷冻离心机 (德国Sigma公司); 2510超声波清洗机 (美国Branson公司); Gradient A10 Milli-Q超纯水器 (法国Millipore公司)。

乙腈为HPLC级 (德国Merck公司); 甲酸、异丙醇和丙酮为HPLC级 (美国Tedia公司); 鱼藤酮标准物质 (纯度≥99%, 德国Dr. Ehrenstorfer公司), 用乙腈配制成1 000 mg/L标准贮备溶液, 保存于-35 ℃冰箱中。

1.2 实验条件

1.2.1 色谱分离条件

中心切割二维超高效液相色谱流路图见图 2。

图 2 中心切割二维超高效液相色谱流路图 Fig. 2 Flow diagram for heart-cutting two-dimensional ultra-performance liquid chromatography (2D-UPLC) a. first dimension, separation of rotenone; b. second dimension, heart-cutting of fraction containing rotenone. P: pump; T: tee.

第1维:净化柱为Cyclone柱 (50 mm×0.5 mm, 60 μm, 柱1, 美国Thermo Fisher Scientific公司), 分离色谱柱为Kinetex Biphenyl (联苯基核壳柱)(50 mm×4.6mm, 2.6 μm, 柱2, 美国Phenomenex公司), 柱温为45 ℃, 进样体积为20 μL。流动相A为0.1%(v/v, 下同) 甲酸水溶液, 流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液, 流动相C为乙腈-异丙醇-丙酮 (45:45:10, v/v/v)。梯度洗脱程序见表 1。

第2维:捕集柱为XBridge C₈ Direct Connect HP柱 (30 mm×2.1 mm, 10 μm, 柱3, 美国Waters公司), 分离柱为Acquity BEH C₈柱 (50 mm×2.1 mm, 1.7 μm, 柱4, 美国Waters公司), 柱温为45 ℃。流动相A为乙腈, 流动相B为0.2%甲酸水溶液。梯度洗脱程序见表 1。

表 1 超高效液相色谱梯度洗脱条件及阀切换程序 Table 1 UPLC gradient elution conditions and valve switching programs

Pump 1 (quaternary solvent manager)							Pump 2 (binary solvent manager)					Column management (CM-A)			515 pump
Time/ min	Flow rate/ (mL/min)	φ/%				Curve	Time/ min	Flow rate/ (mL/min)	φ/%		Curve	Column management (CM-A)			Time/ min	Flow rate/ (mL/min)	Curve
Time/ min	Flow rate/ (mL/min)	A	B	C	D	Curve	Time/ min	Flow rate/ (mL/min)	A	B	Curve	Time/min	Valve	Position	Time/ min	Flow rate/ (mL/min)	Curve
0	2.000	80	20	0	0		0	0.400	30	70		0	left	1	0	0
2.00	2.000	80	20	0	0	6	4.00	0.400	30	70	6	0	right	1	3.90	1.000	1
2.30	1.000	80	20	0	0	1	4.50	0.400	30	70	6	2.30	left	2	4.50	1.000	1
2.40	1.000	40	60	0	0	1	7.50	0.400	90	10	6	4.00	right	2	4.60	0	1
4.50	1.000	16	84	0	0	6	9.50	0.400	95	5	1	4.50	right	1
6.50	2.000	0	0	100	0	1	10.00	0.400	30	70	1	4.50	left	1
9.00	1.000	40	60	0	0	1						5.50	left	2
10.00	2.000	80	20	0	0	1						9.00	left	1
A, B, C, D are the flow-path channels of solvent manager.

表 1 超高效液相色谱梯度洗脱条件及阀切换程序 Table 1 UPLC gradient elution conditions and valve switching programs

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子 (ESI) 源正离子扫描, 多离子监测触发的增强子离子 (MRM-IDA-EPI) 扫描方式。离子化电压 (IS): 5 500 V; 离子源温度 (TEM): 500 ℃; 气帘气压 (CUR): 277 kPa; 喷雾气压 (GS1): 345 kPa; 辅助加热气 (GS2): 345 kPa; 碰撞气 (CAD): High。定量离子对为m/z 395.1 > 213.2;定性离子对为m/z 395.1 > 192.2;去簇电压 (DP) 均为90 V; 碰撞能量 (CE) 分别为31 eV和30 eV; 增强子离子扫描范围为m/z 50~450。

运行开始时, 在0~6.00 min, 第2维色谱柱流出液经质谱仪的六通切换阀切换至废液中, 质谱开始采集数据直到7.20 min结束, 同时六通切换阀又将柱流出液切换至废液中。

1.3 样品前处理

尿液样品:吸取200 μL尿液于1.5 mL Eppendroff管中, 加入200 μL水, 混匀, 以15 000 r/min的速度离心5 min, 取上清液, 待测。

全血样品:用肝素抗凝。吸取200 μL全血于1.5 mL Eppendroff管中, 加入400 μL乙腈, 混匀, 超声提取5 min, 以15 000 r/min的速度离心5 min, 吸取200 μL上清液, 加入400 μL水, 混匀, 以15 000 r/min的速度离心5 min, 取上清液, 待测。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的选择

在电喷雾正离子检测方式下对质谱测定条件进行优化, Q1扫描时可见[M+H]⁺峰, 然后对准分子离子峰进行碰撞, 通过子离子扫描得到鱼藤酮碎片离子信息 (图 3), 然后再对去簇电压, 碰撞能量等参数进行优化, 使得分子离子对的信号达到最强, 选择两对分子离子对, 以响应相对较强的子离子作为定量离子, 另一子离子作为定性离子。同时设定合适的峰驻留时间 (dwell time) 确保色谱峰的采样点数在15~20点, 从而得到较好的定量重复性。优化后的测定条件见1.2.2节。

图 3 鱼藤酮子离子全扫描质谱图 (ESI⁺) Fig. 3 Full scan daughter ion mass spectrum (ESI⁺) of rotenone

2.2 中心切割二维色谱条件的选择与优化

鱼藤酮属双氢异黄酮衍生物, 极性较弱, 在反相液相色谱柱上易保留。选择Cyclone柱作为样品净化柱, Cyclone柱属TurboFlow在线净化柱, TurboFlow在线净化技术结合了扩散、化学和体积排除等原理, 在捕获待测分析物的同时可以快速净化样品, 在简化样品前处理的同时保证了方法的灵敏度, 是近年发展起来的一种新型联用检测技术, 与串联质谱联用已在生物样品分析中得到了较好的应用^{[13, 14]}。

试验发现样品处理液中乙腈含量在23%以下时, 鱼藤酮能被Cyclone柱保留, 而强极性的杂质 (盐分等) 不被保留, 大流速的流动相形成涡流, 可以去除大分子杂质 (蛋白质、脂肪等), 杂质去除完成后, 左切换阀将Cyclone柱切至与第1维Kinetex Biphenyl色谱柱 (联苯基核壳柱) 串联的位置, 采用具有较强洗脱能力的流动相 (60%乙腈) 将Cyclone柱中的鱼藤酮快速洗入联苯基核壳柱中, 再进行梯度分离, 鱼藤酮的保留时间为4.28 min (见图 4a)。经过试验, 在4.00~4.50 min内将第1维分离色谱柱含有鱼藤酮的流分通过右切换阀切入第2维的捕集柱 (XBridge C₈ DC HP) 中, 同时515泵启动, 以1.00 mL/min的流速泵入水, 通过三通先与一维色谱柱切割的流分混合, 再流入捕集柱, 使鱼藤酮捕集在捕集柱的柱头。切割完成后, 右切换阀回到原位, 第2维的流动相将鱼藤酮反向洗入第2维的分离色谱柱 (BEH C₈柱) 进行分离和检测, 同时515泵停泵, 左切换阀切换至1位, 并用强洗脱剂冲洗Cyclone柱, 冲洗液流入废液而不污染联苯基核壳柱, 然后左切换阀切换至2位, 强洗脱剂再冲洗Cyclone和联苯基核壳柱, 冲洗之后再用梯度初始流动相平衡Cyclone和联苯基核壳柱。第2维检测完成后, 再用强洗脱剂冲洗系统, 然后用梯度初始流动相平衡捕集柱和色谱柱。此时鱼藤酮得到聚焦, 色谱峰较窄, 灵敏度高, 保留时间稳定 (见图 4b)。优化好的二维色谱条件见1.2.1节。

图 4 鱼藤酮二维超高效液相色谱MRM色谱图 Fig. 4 MRM chromatograms of rotenone by two-dimensional UPLC a. first dimension chromatogram; b. second dimension chromatogram.

2.3 样品前处理条件的优化

鱼藤酮不溶于水, 可溶于醇、乙腈、丙酮、氯仿和乙酸乙酯等有机溶剂, 目前文献^{[7, 11]}报道的提取方法主要有乙酸乙酯萃取法和乙腈提取法, 考虑到乙腈更适合作为反相色谱进样溶剂, 因此采用乙腈作为提取剂, 提取液经离心去除蛋白质后, 再用水稀释至乙腈含量小于23%, 直接进样分析。

本法采用中心切割二维色谱法同时进行净化和分离, 鱼藤酮分子含有2个苯基, 在第1维的联苯基核壳柱上能增强保留, 联苯基核壳柱与第2维的BEH C₈分离色谱柱具有一定的正交性, 有利于鱼藤酮与样品基质成分的分离。全血和尿液样品采用本法分离后基质效应^[15]分别为95%和93%, 若采用传统的一维液相色谱-质谱联用法分离, 基质效应分别为46%和53%。本方法基本消除了基质抑制效应, 可采用溶剂标准外标法定量, 无需基质匹配, 既方便操作, 又能得到准确结果。

2.4 标准曲线、检出限和定量限

将鱼藤酮标准品溶液稀释, 制成质量浓度分别为0.020、0.10、0.50、1.0、5.0和50 μg/L的系列标准溶液进行测定, 采用MultiQuant (Ver. 3.0) 定量软件进行数据处理, 以定量离子对的峰面积 (y) 对质量浓度 (x, μg/L) 进行回归, 二者在0.020~50 μg/L范围内呈线性关系, 相关系数大于0.996, 回归方程为y=9.42×10⁵x-0.22×10⁴。

在空白样本中加入系列低质量浓度的鱼藤酮, 按本法测定, 以信噪比等于3时对应的样品质量浓度作为检出限 (LOD), 以信噪比等于10时的样品质量浓度作为定量限 (LOQ), 试验测得全血样品的检出限为0.2 μg/L, 定量限为0.5 μg/L；尿液样品的检出限为0.03 μg/L, 定量限为0.1 μg/L；测定上限分别为450和100 μg/L。预计测量的质量浓度范围包括了大部分中毒样品中鱼藤酮的含量水平。

2.5 加标回收试验和方法的精密度

选取不含鱼藤酮的全血和尿液进行加标回收和精密度试验, 样品中添加了不同浓度的标准溶液后, 放置60 min, 使待测成分与样品基体成分相互作用达到平衡, 再按本文样品前处理方法进行操作, 其回收率和精密度结果见表 2。全血和尿液样品的加标回收率分别为84.6%~94.3%和88.4%~95.7%, 相对标准偏差分别为2.6%~7.3%和2.8%~6.8%, 符合痕量分析的要求。

表 2 全血和尿液中鱼藤酮的加标回收率和相对标准偏差 (n=6) Table 2 Spiked recoveries and RSDs of rotenone in whole blood and urine (n=6)

2.6 实际样品分析

2015年5月30日, 本市发生一起因误食地瓜籽 (豆科豆薯属植物豆薯Pachyrhizus erosus的种子) 引起的食物中毒事件, 共有5人发病。中毒后出现头晕、呕吐、全身软弱无力、四肢发麻等症状, 其中1例重症患者出现神志不清、呼吸困难, 最终医治无效死亡。收到5份全血、1份尿液和1份地瓜籽样本, 采用本法测得5份全血中鱼藤酮的含量分别为1.4、2.7、2.1、9.2和17.3 μg/L, 尿液中鱼藤酮的含量为0.41 μg/L (见图 5), 地瓜籽样本中鱼藤酮的含量为443 mg/kg。尿液中鱼藤酮子离子扫描质谱图与谱库中鱼藤酮的匹配率达92%。

图 5 尿液中鱼藤酮的MRM色谱图 (0.41 μg/L) Fig. 5 MRM chromatograms of rotenone in a urine sample (0.41 μg/L)

3 结论

本文建立了中心切割二维超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用测定尿液和全血中鱼藤酮的分析方法。通过优化色谱分离和质谱检测条件, 得到了较高的检测灵敏度。通过对样品净化效果和基质效应的评估, 证明了样品在线净化方法的有效性。方法学验证结果表明, 本法灵敏度高、选择性好、定量准确、精密度好, 应用于实际样品的检测取得了满意的结果。本法适合于尿液和全血中鱼藤酮的中毒检测和临床监测。

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