络石藤为夹竹桃科植物络石(Trachelospermum jasminoides (Lindl.) Lem)的带叶藤茎, 可祛风通络, 凉血消肿, 主要用于风湿热痹、筋脉拘挛、腰膝酸痛、跌扑损伤等。络石藤主要包含木脂素类^[1]、黄酮类^{[2, 3]}、三萜类^[4]、甾醇类和生物碱类等成分^[5]。现代药理研究表明, 络石藤具有抗炎镇痛^[6-8]、抗氧化^[9]、抗疲劳^[10]、抗癌^{[11, 12]}和抗植物雌激素样^[13]等作用。络石藤中的木脂素主要是二苯丁酸内酯类, 包括络石苷、络石苷元、牛蒡子苷、牛蒡子苷元、罗汉松树脂酚、罗汉松树脂苷等, 其中以络石苷和络石苷元为主。2015版《中国药典》^[14]中以络石苷作为络石藤药材质量控制的指标成分, 规定其含量不得少于0.45%。

络石藤中化学成分的分离主要采用溶剂萃取结合柱色谱的分离方法, 袁珊琴等^[15]将络石藤的乙醇提取物经两次硅胶柱色谱分离, 最终得到4个单体化合物; 张健等^[16]将络石藤的醇提物用水溶解后, 分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取, 然后将石油醚萃取物经硅胶柱色谱分离, 最终得到11个化合物; 谭兴起等^[4]采用正相和反相硅胶柱及Sephadex LH-20凝胶柱对络石藤的乙醇提取物进行分离, 最终分离出8个三萜类化合物。随着分离分析技术的发展, 人们充分认识到络石藤化学成分的复杂性, 因此需要发展一种高效的分离方法以从络石藤中获得更多的化合物, 从而更加深入地认识其物质基础。

制备型高效液相色谱法(Pre-HPLC)是一种高效的分离纯化技术, 因具有柱效高、分离速度快、自动化程度高等优点而越来越多地应用于中药复杂样品的分离纯化中。梁晓芳等^[17]利用Pre-HPLC对大豆异黄酮粗提物进行分离纯化, 在短时间内实现了6种高纯度大豆异黄酮单体的制备; 侯红瑞等^[18]利用Pre-HPLC对高良姜中的高良姜素和山柰素进行分离, 成功得到高纯度的高良姜素和山柰素; 曾春萍等^[19]建立了Pre-HPLC分离制备蛇床子萃取物中蛇床子素的方法。但由于中药成分的复杂性和多样性, 采用一根色谱柱进行一次分离和制备, 无论是在峰容量还是选择性上都受到极大的限制, 因此二维(2D)制备液相色谱法应运而生。目前在中药的分离制备中应用较为广泛的二维液相色谱法有二维正相/反相液相色谱(2D-NPLC/RPLC)、二维反相/反相液相色谱、二维亲水/反相液相色谱(2D-HILIC/RPLC)、二维亲水/亲水液相色谱等模式^[20]。邢倩倩等^[21]利用Pre-2D-HILIC/RPLC法对桔梗中的三萜皂苷进行分离, 经过一维亲水模式的制备, 得到20个三萜皂苷的精细组分, 将其中一个组分在二维反相模式下制备, 最终得到两个单体化合物; Li等^[22]建立了Pre-2D-NPLC/RPLC法分离制备荜茇中的酰胺类生物碱成分, 方法显示具有较好的正交性, 最终得到28个高纯度的化合物; Fan等^[23]建立了正交性良好(71.9%)的2D-NPLC/RPLC法分离制备甘草中黄酮类化合物的方法, 最终得到24个高纯度化合物。

本文在对络石藤药材进行醇提后, 利用活性炭脱色和反相固相萃取的方法除去了络石藤提取物中的色素和强极性成分, 然后建立了亲水/反相二维制备液相色谱分离络石藤中化学成分的方法。样品经第一维亲水色谱分离后, 得到15个组分, 选取其中的8个组分在第二维反相色谱柱上进一步分离, 最终得到14个单体化合物, 并利用质谱和核磁共振技术对化合物的结构进行了表征。本文建立的亲水/反相二维制备液相色谱法短时高效, 可以有效解决一维制备液相色谱法峰容量不足、选择性不够的问题, 对于络石藤以及其他复杂中药材样品的分离制备具有重要意义。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Waters Alliance 2695高效液相色谱(配有自动进样器、柱温箱、2695四元梯度泵和2489紫外检测器)、Waters 2545自动纯化系统(配备2545二元梯度泵、2489紫外检测器、2767馏分收集器和自动进样器)、Empower 3数据采集操作软件均购自美国Waters公司; 90YY40-2GT真空旋转蒸发仪购自上海上自仪转速表仪表电机有限公司; Scientz-10N冷冻干燥机购自宁波新芝生物科技股份有限公司。

甲醇(色谱级)购自山东禹王实业有限公司; 乙腈(色谱级)购自百灵威(北京)有限公司; 药用活性炭购自上海活性炭厂有限公司; 固相萃取(SPE)填料为反相CP填料(60~100 μm, 华谱新创科技有限公司); 流动相用水为市售娃哈哈饮用水, 经0.45 μm微孔滤膜过滤。

实验用络石藤药材(批号:150209, 产地:江苏)购自上海虹桥中药饮片有限公司。

1.2 样品前处理

称取500 g络石藤药材, 加入4 L甲醇, 搅拌条件下于65 ℃加热回流1 h, 共2次, 收集提取液, 过滤, 然后合并滤液, 加入30 g药用活性炭, 加热回流30 min, 过滤回流液, 旋蒸浓缩至100 mL, 于-50 ℃冻干。

称取冻干后的样品52.5 g, 溶解于3 L 20% (v/v)甲醇水溶液中, 络石藤样品的质量浓度约为17.5 g/L, 用反相SPE柱(60 mL)处理。称取20 g CP填料装填SPE柱, 经63 mL(3倍柱体积, 3 BV)甲醇活化, 63 mL的水平衡后, 上样100 mL, 用84 mL(4 BV)的水淋洗后, 采用84 mL的甲醇洗脱。收集甲醇洗脱部分, 浓缩至100 mL，于-50 ℃冻干。

1.3 色谱条件

1.3.1 亲水色谱

色谱柱:Click XIon(250 mm×4.6 mm, 10 μm, 华谱新创科技有限公司); 流动相:(A)水和(B)乙腈; 梯度洗脱:0~5 min, 95%B~90%B; 5~30 min, 90%B~75%B; 检测波长:280 nm; 流速:1.0 mL/min; 进样量:5 μL。

制备色谱柱:Click XIon(250 mm×20 mm, 10 μm, 华谱新创科技有限公司); 梯度洗脱条件同上; 检测波长:280 nm; 流速:19 mL/min; 进样量:1 mL。

1.3.2 反相色谱

用于前处理过程样品监测的色谱柱:Unitary C18 (150 mm×4.6 mm, 5 μm, 华谱新创科技有限公司); 流动相:(A)水和(B)甲醇; 梯度洗脱:0~30 min, 20%B~70%B; 检测波长:230 nm; 流速:1.0 mL/min; 进样量:10 μL。

用于反相制备条件优化和正交性评价的色谱柱:Unitary C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm, 华谱新创科技有限公司); 流动相:(A)水和(B)乙腈; 梯度洗脱条件:0~30 min, 30%B~60%B; 检测波长:280 nm; 流速:1.0 mL/min; 进样量:10 μL。

二维制备色谱柱:Unitary C18(250 mm×20 mm, 5 μm, 华谱新创科技有限公司); 梯度洗脱条件和进样量根据每个一维组分性质的不同而定; 检测波长:280 nm; 流速:19 mL/min。

2 结果与讨论

2.1 活性炭脱色与固相萃取

络石藤中所含的主要成分为中等极性和弱极性的木脂素类、黄酮类和三萜类化合物, 故选择甲醇作为提取溶剂。因络石藤中含有大量的色素等物质, 采用活性炭脱色的方法去除提取液中的色素等杂质。直接浓缩冻干后的络石藤样品性状黏稠, 颜色较深, 反相色谱分析结果显示其中仍含有较多的强极性物质(见图 1a), 因而采用反相固相萃取的方法, 通过用水淋洗除去样品中的强极性物质, 再用甲醇洗脱得到中等极性和弱极性组分。对固相萃取后的样品进行反相色谱分析(见图 1b), 通过色谱图可以发现, 强极性干扰物质(前5 min)已被除去。冻干样品的性状改善很多, 为干燥的淡黄色粉末状, 保障了后续的制备工作。提取5 000 g络石藤药材, 通过上述步骤, 制备得到27 g络石藤组分。

图 1

Fig. 1

图 1 络石藤提取物固相萃取(a)前、(b)后的反相色谱图 Fig. 1 RP chromatograms of the Trachelospermum jasminoides (a) before and (b) after solid phase extraction Column: Unitary C18 (150 mm×4.6 mm, 5 μm); mobile phases: (A) water and (B) methanol; gradient elution: 0-30 min, 20%B-70%B; detection wavelength: 230 nm; injection volume: 10 μL; flow rate: 1.0 mL/min.

2.2 亲水色谱条件的优化和一维色谱制备

从反相色谱的分析结果看, 络石藤组分的组成十分复杂, 除明显的特征峰外, 仍能检测到很多微量组分, 因此尝试建立二维液相色谱法对其进行分离分析。本实验选择亲水色谱对其进行分离。分别考察了采用酰胺型色谱柱XAmide(250 mm×4.6 mm, 5 μm)和两性离子色谱柱Click XIon(250 mm×4.6 mm, 5 μm)时的分离效果。结果表明, 采用两性离子色谱柱时, 络石藤组分的保留行为和分离度均较好, 因此选择两性离子色谱柱进行亲水色谱分离。通过考察流动相组成、进样量和流速，对亲水色谱的条件进行优化, 最佳色谱条件下的色谱图见图 2a。可以看出, 络石藤组分在亲水和反相两种分离模式下的保留行为具有较大差异, 主峰在亲水色谱上保留较差, 因此可以有效地富集微量化合物, 当将进样量增至30 μL后, 发现色谱峰的峰形依然保持较好(见图 2b), 且更多的微量组分被检出。将亲水色谱作为第一维, 其流动相中含有较高比例的有机相, 即解决了样品在水中溶解度较差的问题又可以提高样品的后处理效率。

图 2

Fig. 2

图 2 不同进样量下络石藤组分的亲水色谱图 Fig. 2 Hydrophilic chromatograms of the components in Trachelospermum jasminoides with different injection volumes Injection volume: a. 5 μL, b. 30 μL; column: Click XIon (250 mm×4.6 mm, 10 μm); mobile phases: (A) water and (B) acetonitrile; gradient elution: 0-5 min, 95%B-90%B; 5-30 min, 90%B-75%B; flow rate: 1.0 mL/min.

将亲水色谱的分析级别放大至制备级别, 选择相同填料的Click XIon制备色谱柱(250 mm×20 mm, 10 μm), 络石藤组分的亲水制备色谱图见图 3。可以看出, 色谱图中各色谱峰峰形依然保持良好, 与分析谱图(图 2b)基本一致, 具有较好的分离度。多次重复进样分析, 通过对比色谱图, 说明亲水制备色谱方法的重复性较好。选择以紫外触发的模式进行馏分收集, 避免已经分离的色谱峰发生交叉, 且通过一维色谱的分离和收集还可对微量组分进行富集。

图 3

Fig. 3

图 3 络石藤组分的亲水作用制备色谱图 Fig. 3 Preparative hydrophilic interaction chromatogram of the Trachelospermum jasminoides The shaded and blank intervals illustrated that the components were collected according to the UV triggered mode, expressed by Fa, which were further purified in the second dimensional RPLC. The dotted intervals illustrated that the components were collected continuously according to time, expressed by fb, which were used for orthogonality evaluation. Column: Click XIon (250 mm×4.6 mm, 10 μm); mobile phases: (A) water and (B) acetonitrile; gradient elution: 0-5 min, 95%B-90%B; 5-30 min, 90%B-75%B; detection wavelength: 280 nm; injection volume: 1.0 mL; flow rate: 19.0 mL/min.

通过一维制备, 共处理24 g络石藤组分, 收集得到15个馏分。其中组分F₁的质量最大, 约4.94 g, 组分F₄的质量较小, 约245 mg, 其他各组分质量分布较均匀, 可基本满足二维制备对各组分质量的需求。

2.3 正交性评价

为了进一步考察亲水色谱模式和反相色谱模式的正交性, 以时间触发方式将络石藤组分在亲水色谱上按保留时间每隔2 min收集一次, 在2~28 min内共收集到13个组分(f₁~f₁₃, 见图 3)，并将这些组分采用反相色谱模式分析。如组分f₁为亲水色谱上收集的第一个组分, 保留时间为2~4 min, 该组分在反相Unitary C18色谱柱上的分析色谱图见图 4a, 其在亲水色谱上表现为一个峰, 在反相色谱上有3个明显的色谱峰和一系列响应强度较小的峰; 组分f₄是亲水色谱上收集的第四个组分, 保留时间为8~10 min, 在反相Unitary C18色谱柱上的分析色谱图见图 4b, 其在亲水色谱上表现为含量较低的多个色谱峰, 在反相色谱上表现为分离度较好的多个峰, 充分体现了该亲水/反相二维制备液相色谱方法良好的正交性。

图 4

Fig. 4

图 4 图 3中组分(a)f1和(b)f4的反相色谱图 Fig. 4 RP chromatograms of the fractions (a) f1 and (b) f4 in Fig. 3 Column: Unitary C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm); mobile phases: (A) water and (B) methanol; gradient elution: 0-30 min, 30%B-60%B; detection wavelength: 280 nm; injection volume: 10 μL; flow rate: 1.0 mL/min.

按照文献^[24]报道的正交性评价方法计算该二维体系的正交性, 结果为49.8%。13个组分(f₁~f₁₃)反相分析的三维色谱图见图 5, 直观地体现了络石藤化学组成的复杂性, 可见采用2D-HILIC/RPLC的正交分离方法可大大提高络石藤组分的分离度和峰容量。

图 5

Fig. 5

图 5 采用RPLC模式时络石藤中组分f1~f13的三维色谱图 Fig. 5 3D chromatogram of the fractions f1-f13 from Trachelospermum jasminoides components on RPLC mode Column: Unitary C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm); mobile phases: (A) water and (B) methanol; gradient elution: 0-40 min, 30%B-60%B; detection wavelength: 280 nm; injection volume: 10 μL; flow rate: 1.0 mL/min.

2.4 单体化合物的反相制备及表征

从一维制备的15个组分中选取含量较大、分离度较好的8个组分(F₁、F₄~F₇、F₉、F₁₀、F₁₄)进行二维反相色谱制备, 以紫外触发模式对各馏分进行收集, 最终得到14个单体化合物, 以质谱和核磁共振对14个化合物进行定性分析(见表 1), 其中检测出3种黄酮类化合物和11种木脂素类化合物。

表 1 (Table 1)

表 1 反相制备得到的14种化合物的信息 Table 1 Information of the 14 compounds prepared under RPLC mode No. Compound Purity/% Weight/mg 1 nortrachelogenin (去甲络石苷元) 87.2 15.80 2 trachelogenin (络石苷元) 97.0 196.82 3 arctigenin (牛蒡子苷元) 84.9 12.70 4 arctiin (牛蒡子苷) 97.6 28.25 5 nortrachelogenin-8′-O-β-glucoside(去甲络石苷元-8′-O-β-葡萄糖苷) 95.7 38.55 6 tracheloside (络石苷) 99.4 239.40 7 nortracheloside (去甲络石苷) 93.1 104.40 8 nortrachelogenin-5′-C-β-glucoside(去甲络石苷元-5′-C-β-葡萄糖苷) 91.9 32.13 9 tanegoside B 91.9 10.10 10 naringin (柚皮苷) 97.1 49.97 11 nortrachelogenin-4, 4′-di-O-β-D- 87.2 29.17 glucopyranoside (去甲络石苷元-4, 4′-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷) 12 matairesinol-4, 4′-di-O-β-D-glucoside (罗汉松脂酚-4, 4′-二-O-β-D-葡萄糖苷) 95.9 26.01 13 apigenin-5, 7-di-O-glucoside(芹菜素-5, 7-二-O-葡萄糖苷) 96.0 4.60 14 chrysoeriol-7, 4′-di-O-glucoside(柯伊利素-7, 4′-二-O-葡萄糖苷) 94.3 4.93

表 1 反相制备得到的14种化合物的信息 Table 1 Information of the 14 compounds prepared under RPLC mode

将一维色谱制备的组分在反相制备色谱上进行纯化。以组分F₁₄为例, 其保留时间约为24~25 min, 反相液相制备色谱图见图 6。该组分在亲水色谱上表现为一个峰, 在反相色谱上有4个明显的色谱峰, 通过二维色谱制备分离纯化该组分, 最终得到4个化合物, 体现了两种色谱模式良好的正交性。从组分F₅和F₆中分别制备出两个化合物, 分别是去甲络石苷元-8′-O-β-葡萄糖苷和去甲络石苷, 其色谱图见图 7, 这两个化合物在反相色谱中的保留时间非常相近, 分别为7.83 min和7.98 min, 只用一维反相分离的方法很难得到良好的分离, 但是通过本文建立的亲水/反相二维制备液相色谱法, 可得到两个纯度较高的化合物。

图 6

Fig. 6

图 6 组分F14的反相制备色谱图 Fig. 6 Pre-RP chromatogram of the fraction F14 Conditions: column, Unitary C18 (250 mm×20 mm, 5 μm); mobile phases, (A) water and (B) acetonitrile; gradient elution, 0-30 min, 15%B-25%B; detection wavelength, 280 nm; injection volume, 1.2 mL; flow rate, 19.0 mL/min. Peaks 11-14 were the same as in Table 1.

图 7

Fig. 7

图 7 组分F5和F6制备得到的化合物的反相分析色谱图 Fig. 7 RP analysis chromatograms of the compounds from fraction F5 and F6 Conditions: column, Unitary C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm); mobile phases, (A) water and (B) acetonitrile; gradient elution: 0-30 min, 20%B-50%B; detection wavelength, 280 nm; injection volume, 4 μL; flow rate, 1.0 mL/min. Peaks 5 and 7 were the same as in Table 1.

3 结论

本文以络石藤药材为研究对象, 利用活性炭脱色和反相SPE柱去除络石藤药材提取物中的色素和强极性组分, 得到了络石藤组分, 并构建了亲水/反相二维液相色谱分离纯化络石藤组分的分析方法, 同时利用质谱和核磁共振数据对化合物进行定性。该2D-HILIC/RPLC制备纯化方法具有良好的正交性, 可从络石藤中纯化更多的化合物, 以便进一步了解其物质基础。

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