三波长融合指纹图谱结合6组分定量和主成分分析评价银翘解毒片的质量


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马迪迪, 巩丹丹, 孙国祥, 杨方良

沈阳药科大学药学院, 辽宁沈阳 110016

收稿日期：2017-01-12

通讯联系人：孙国祥, Tel:(024)23986286, E-mail:gxswmwys@163.com

摘要：建立了三波长融合高效液相色谱指纹图谱，并结合6组分定量和主成分分析（PCA）评价25批银翘解毒片的质量一致性。采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分别于230、279、327 nm下检测。运用多波长融合指纹图谱技术建立银翘解毒片三波长融合指纹图谱，采用系统指纹定量法对其进行定性和整体定量评价。结果鉴别出25批银翘解毒片样品完全合格且区分良好。同时测定6组分含量，与指纹图谱结合，从整体和局部角度评价银翘解毒片质量。此外，运用PCA法对融合指纹图谱进行分析，通过主成分得分图可以明显区分来自两个厂家的25批银翘解毒片样品。方法综合性较强且有效，为科学评价与有效控制银翘解毒片的质量提供了可靠的参考。

关键词：高效液相色谱三波长融合指纹图谱系统指纹定量法定量检测主成分分析银翘解毒片

Quality evaluation of Yinqiaojiedu tablets by three wavelength fusion fingerprint combined with six components quantitative determination and principal component analysis

MA Didi, GONG Dandan, SUN Guoxiang, YANG Fangliang

School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China

Abstract: The fusion high performance liquid chromatographic fingerprint combined with quantification and principal component analysis (PCA) was successfully developed, which was applied to assess the quality consistency of 25 Yinqiaojiedu tablets (YQJDTs). The resolution index Ⅰ was employed as an objective function to evaluate chromatographic conditions. The chromatographic fingerprints were established by reversed-phase high performance liquid chromatography. The wavelengths were set at 230, 279 and 327 nm, separately. Then, the three wavelength fusion fingerprint was developed by the technique of multi-wavelength fusion fingerprint. The linearity, precision, repeatability, stability and accuracy of the method were proved to meet the fingerprint analysis criteria. Subsequently, the systematic quantified fingerprint method was applied for integrative quality discrimination of YQJDTs from both qualitative and quantitative perspectives. The results showed that the quality of 25 YQJDTs from the two manufacturers were completely qualified and well differentiated. The contents of six components were determined simultaneously and combined with fingerprint analysis. It was used to evaluate the quality of YQJDT from the overall and partial points of view. In addition, the PCA of the fusion fingerprint data was applied to get the score plot. It can be clearly distinguished the 25 YQJDT samples from the two manufacturers. The method proposed in this study was comprehensive and reliable, which could be used for a valuable reference to scientifically evaluate and effectively control the quality of YQJDT.

Key words: high performance liquid chromatography (HPLC) three wavelength fusion fingerprint systematic quantified fingerprint method quantitative determination principal component analysis (PCA) Yinqiaojiedu tablet (YQJDT)

银翘解毒片来源于传统中药方剂银翘散, 由金银花、连翘、薄荷、荆芥、淡豆豉、牛蒡子、桔梗、淡竹叶、甘草9味中药加工制成^[1]。具有辛凉解表、清热解毒功效, 临床用于治疗风热感冒, 症见发热头痛、咳嗽口干、咽喉疼痛。中国药典检测绿原酸、连翘苷含量作为其质量控制指标^[2], 也有一些文献^[3-6]建立了银翘解毒片的质量控制方法, 但多对其中的一种或几种成分进行检测分析, 不能有效控制银翘解毒片的内在质量。中药指纹图谱技术是一种综合的、可量化的识别模式, 它能够从宏观上整体反映中药材所含化学成分的种类和数量, 是目前国际公认的中药或天然药物质量控制的有效手段之一^[7-12]。文献^[13]中有对银翘解毒片单波长高效液相色谱(HPLC)特征图谱的报道, 但银翘解毒片为复方制剂, 成分复杂, 且各成分协同作用达到药理效果, 显然仅采用单一波长检测化学指纹无法实现对其成分的整体表达和全面评价。融合指纹图谱可充分挖掘全指纹在最佳波长下的信息, 从而对中药物质基础有更清晰完整的认识, 适用于银翘解毒片的质量评价。主成分分析(PCA)是一种在不损失样本特征值的信息前提下, 通过降维技术, 用少数几个贡献率大的成分代替多个原始变量, 化繁为简的多元统计分析方法^[14], 近年来已广泛应用于中药研究^[15-17]。本文通过融合HPLC指纹图谱结合定量检测和PCA全面评价了银翘解毒片的质量差异。

1 系统指纹定量法原理

中药指纹图谱评价是针对样品指纹向量与对照指纹向量的定性定量差异进行比较, x_i与y_i分别为各指纹峰面积; 计算与间夹角θ的余弦, 称为定性相似度S_F, 见公式(1)^[18]：

(1)

为了消除大峰的绝对影响, 使所有指纹峰等权, 与分别转变为与=(1, 1, …, 1)。计算与间夹角θ′的余弦, 称为比率定性相似度S_F′, 见公式(2)^[18]：

(2)

计算S_F与S_F′的均值, 构成宏定性相似度S_m, 见公式(3)^[19]。S_m能准确描述样品指纹图谱与对照指纹图谱中化学成分数量和分布比例的相似程度。

(3)

为了定量评价中药指纹图谱, 计算在上的投影, 得到投影含量相似度C, 见公式(4)^[18]:

(4)

定量相似度P是样品指纹成分相对于对照指纹成分的总峰面积比, 经S_F校正后得到, 见公式(5)^[18]:

(5)

将C与P均值, 称为宏定量相似度P_m, 见公式(6)^[19]。P_m描述样品整体化学成分含量, 可以全面、客观地评价药材或制剂的质量。

(6)

另一定性参数α称为指纹均化性变异系数, 见公式(7)^[19], 用于监测样品指纹图谱与对照指纹图谱的指纹信号均化性差异。

(7)

将S_m、P_m与α相结合来鉴定中药质量等级的方法称为系统指纹定量法^[19], 判断质量等级时必须同时满足这3个条件, 通常三者中的最差者决定质量等级, 据此将中药质量划分为8级^[20]。

2 实验部分

2.1 仪器与试药

Agilent 1100型液相色谱仪(配二极管阵列检测器(DAD)、四元低压梯度泵、在线脱气装置、自动进样器)、ChemStation工作站(安捷伦科技有限公司), BS1100分析天平(北京赛多利斯天平有限公司), KDM型控温电热套(山东鄄城华鲁仪器公司)。

甲醇、乙醇、乙腈、磷酸、磷酸二氢钠均为色谱纯(山东禹王实业有限公司禹城化工厂), 水为去离子水。绿原酸(chlorogenic acid, CGA)对照品(批号110753-201314)、咖啡酸(caffeic acid, CFA)对照品(批号111610-201005)、橙皮苷(hesperidin, HES)对照品(批号110721-200613)、连翘苷(phillyrin, PL)对照品(批号110821-200711)、牛蒡苷(arctiin, ACT)对照品(批号110819-200606) 和甘草苷(liquiritin, LQ)对照品(批号130513) 供含量测试用。LQ购自上海融禾医药科技有限公司, 其他对照品均购自中国药品生物制品检定所。25批银翘解毒片:S1~S13(北京同仁堂科技发展股份有限公司)、S14~S25(江苏康缘药业股份有限公司)。

2.2 溶液的配制

混合对照品溶液:取各对照品适量, 精密称定, 加甲醇制成360 μg/mL CGA、40.5 μg/mL CFA、60.4 μg/mL LQ、80.4 μg/mL HES、50.1 μg/mL PL和350 μg/mL ACT的混合对照品溶液。

样品供试液:取银翘解毒片10片, 精密称定质量, 除去薄膜衣, 研匀, 精密称取1.0 g, 加入甲醇20 mL回流提取1 h, 过滤, 取滤液, 用甲醇定容至25 mL, 摇匀。进样前用0.45 μm膜过滤。

2.3 HPLC指纹图谱的检测条件

CAPCELL-PAK C18柱(200 mm×4.6 mm, 5 μm); 流动相:A相为0.2%(v/v)磷酸溶液(含30 mmol/L磷酸二氢钠), B相为乙腈-乙醇-3%磷酸(82:10:8, v/v/v)。梯度洗脱程序:0~10 min, 5%B~20%B; 10~60 min, 20%B~45%B。流速为1.0 mL/min; 检测波长分别为230、279、327 nm; 柱温为(30.0±0.15) ℃; 进样量为20 μL。

3 结果与讨论

3.1 色谱条件的优化

以指纹图谱分离度指数I^[21]作为优化的目标函数考察试验条件的优劣。, P_i为色谱峰面积归一化值，A_i为峰面积。I值反映了指纹信号大小、信号均化程度和信息量多少等指标, 其值越大, 分离效果越好。试验中对不同提取方法(超声与回流)、不同提取溶剂(水、50%(v/v, 下同)乙醇、50%甲醇、75%甲醇、90%甲醇和甲醇)及提取时间所得到的供试液进行测定, 分别记录色谱图。对色谱图积分并计算I值, 结果显示当提取条件为甲醇回流提取1 h时, 提取所得到的样本的I值最大, 故选择2.2节方法制备样品供试液。

3.2 融合指纹图谱的分析

3.2.1 银翘解毒片融合指纹图谱的确定

金银花、连翘为银翘解毒片中的主要组成部分, 金银花中活性组分CGA的最大紫外吸收波长约为327 nm, 连翘中活性组分PL在230和280 nm有吸收, 活性成分LQ、HES、ACT和CFA也在230、279或327 nm有吸收。显然, 用任何单一检测波长表达银翘解毒片HPLC指纹图谱的信息量均有限, 且信号强度有很大的差异。为了尽可能多地反映组分全貌, 本文利用DAD记录银翘解毒片在190~400 nm波长范围的信号, 并依据其化学成分的紫外吸收光谱特征从中选取3个特征波长, 最终对230、279、327 nm 3个检测波长下的色谱图进行融合。将S1样品供试液在230、279、327 nm 3个检测波长下的色谱信号导入孙国祥等开发的“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0”软件, 比较不同融合时间窗下S_m、P_m、n(指纹峰总数)和m(指纹峰基线分离(分离度R≥1.5) 峰数)值的大小, 见图 1。结果表明当融合时间窗宽度设为0.2 min时, 获得较好的相似度且合适的指纹峰数。因此本文在融合时间窗0.2 min时融合3个检测波长下的色谱图。

图 1 不同融合时间窗的比较 Fig. 1 Comparision between different shift time windows S_m: macro qualitative similarity; P_m: macro quantitative similarity; n: total peak number; m: peaks separated.

3.2.2 系统适用性

精密吸取CGA、CFA、LQ、HES、PL、ACT混合对照品溶液和两厂家样品供试液分别进样, 记录230、279、327 nm 3个检测波长下的色谱图。按3.2.1节的方法建立融合指纹图谱, 通过比较保留时间和在线紫外光谱图可知, 16、17、25、30、36、37号峰分别为CGA、CFA、LQ、HES、PL、ACT, 见图 2。因CGA峰与相邻峰分离较好, 在测定时比较稳定, 峰面积较大, 因此选其作为参照物峰。2 h空针和样品供试液色谱图表明检测系统无其他峰干扰, 组分在60 min内基本出峰完全。

图 2 两厂家样品的代表性融合HPLC指纹图谱和混合对照品色谱图 Fig. 2 Representative fusion HPLC fingerprints of samples from two different manufacturers and chromatogram of the mixed standards a. Beijing Tongrentang Pharmaceutical Co., Ltd.; b. Jiangsu Kangyuan Pharmaceutical Co., Ltd.; c. mixed standards.

3.2.3 精密度试验

精密吸取S1样品供试液20 μL, 连续进样6次, 记录230、279、327 nm 3个检测波长下的色谱图。按3.2.1节的方法建立融合指纹图谱, 以CGA峰的保留时间和峰面积为参照, 各指纹峰相对保留时间的相对标准偏差(RSD)均小于1.0%, 相对峰面积的RSD均小于3.0%, 表明检测系统进样精密度良好。

3.2.4 重复性试验

取S1样品平行制备供试液6份, 分别精密吸取20 μL进样测定, 记录230、279、327 nm 3个检测波长下的色谱图。按3.2.1节的方法建立融合指纹图谱, 以CGA峰的保留时间和峰面积为参照, 各指纹峰相对保留时间的RSD均小于1.0%, 相对峰面积的RSD均小于3.0%, 表明方法重复性良好。

3.2.5 稳定性试验

分别在S1样品供试液制备后0、4、8、12和24 h精密吸取20 μL, 进样测定, 记录230、279、327 nm 3个检测波长下的色谱图。按3.2.1节的方法建立融合指纹图谱, 以CGA峰的保留时间和峰面积为参照, 各指纹峰相对保留时间的RSD均小于1.0%, 相对峰面积的RSD均小于3.0%, 表明样品在24 h内基本稳定。

3.2.6 融合指纹图谱的建立和样品质量一致性的评价

按2.2节的方法制备25批银翘解毒片样品供试液, 分别进样测定, 记录230、279、327 nm 3个检测波长下的色谱图。按3.2.1节的方法建立三波长融合指纹图谱, 以CGA峰为参照物峰, 确定45个共有指纹峰, 且指认出6个共有峰, 分别为CGA(16号峰)、CFA(17号峰)、LQ(25号峰)、HES(30号峰)、PL(36号峰)和ACT(37号峰), 见图 2。将25批样品融合指纹图谱信号导入“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0”软件, 按平均值法计算，生成对照指纹图谱。对照指纹图谱和各样品融合HPLC指纹图谱见图 3。为避免图谱直观分析主观性对分析结果的影响, 以对照指纹图谱为标准, 采用系统指纹定量法计算25批样品的S_m、P_m、α值, 并划分银翘解毒片的质量等级, 见表 1。

图 3 25批(S1~S25) 银翘解毒片融合HPLC指纹图谱和对照指纹图谱(RFP) Fig. 3 Fusion HPLC fingerprints of 25 YQJDTs (S1-S25) and reference fingerprint (RFP)

表 1 系统指纹定量法评价25批银翘解毒片的质量结果和6组分含量 Table 1 Quality results of 25 YQJDTs evaluated by the systematic quantified fingerprint method and the contents of the six components

Sample	Fusion fingerprints analysis					Quantitative analysis/(mg/g)
Sample	S_m	P_m	α	Grade	Quality	CGA	CFA	LQ	HES	PL	ACT
S1	0.973	78.0	0.049	4	fine	6.09	0.15	0.45	0.57	0.44	3.58
S2	0.971	90.7	0.045	2	better	6.89	0.16	0.51	0.68	0.59	4.01
S3	0.971	89.5	0.038	3	good	6.92	0.14	0.56	0.72	0.41	3.70
S4	0.968	83.9	0.042	3	good	6.67	0.17	0.50	0.65	0.55	3.55
S5	0.887	78.5	0.116	4	fine	6.14	0.16	0.42	0.72	0.53	3.92
S6	0.955	90.0	0.057	2	better	7.01	0.16	0.51	0.69	0.44	3.85
S7	0.907	89.1	0.100	3	good	6.56	0.16	0.46	0.62	0.55	4.00
S8	0.963	91.1	0.048	2	better	6.89	0.18	0.49	0.62	0.57	4.26
S9	0.904	87.7	0.114	3	good	6.66	0.15	0.56	0.79	0.33	3.53
S10	0.973	85.0	0.043	3	good	6.92	0.12	0.50	0.71	0.32	3.16
S11	0.972	89.6	0.045	3	good	6.85	0.17	0.50	0.61	0.68	3.78
S12	0.971	80.5	0.053	3	good	6.40	0.22	0.45	0.75	0.56	3.64
S13	0.971	95.7	0.034	1	best	6.45	0.18	0.51	0.82	0.60	5.07
S14	0.968	112.5	0.014	3	good	6.60	0.36	0.74	0.56	0.92	7.60
S15	0.969	112.4	0.013	3	good	6.45	0.38	0.74	0.68	0.89	7.58
S16	0.969	120.5	0.017	4	fine	6.68	0.40	0.78	0.54	0.97	8.03
S17	0.976	125.8	0.010	5	moderate	7.80	0.38	0.74	0.71	0.94	7.7
S18	0.969	113.5	0.016	3	good	6.60	0.38	0.74	0.69	0.96	7.64
S19	0.968	97.7	0.002	1	best	6.12	0.33	0.61	0.65	0.78	5.66
S20	0.971	115.5	0.010	3	good	6.81	0.40	0.76	0.56	0.99	7.54
S21	0.970	117.2	0.011	3	good	6.86	0.39	0.75	0.69	0.97	7.50
S22	0.955	99.7	0.014	1	best	6.26	0.35	0.68	0.51	0.43	7.32
S23	0.974	119.7	0.015	3	good	7.01	0.40	0.76	0.76	0.85	7.60
S24	0.971	117.6	0.011	3	good	6.95	0.38	0.76	0.72	0.89	7.60
S25	0.954	107.3	0.003	2	better	6.55	0.41	0.73	0.55	0.79	7.39
α: fingerprint variation coefficient.

结果显示所有样品的S_m值大于0.85, α值小于0.15, 说明样品融合指纹图谱与对照指纹图谱在化学成分数量和分布比例上差异较小。依照定性参数S_m、α值, 所有样品的质量等级应在1~3级范围内。然而, 当结合定量参数P_m时, 只有21批样品达到质量等级1~3级, 其余4批样品(S1、S5、S16、S17) 的质量等级为4级或5级。由此可见, 定性参数固然重要, 定量参数也不可忽视, 因为P_m作为定量测定工具有较强的区分能力且在质量等级评价中贡献较大。通常规定质量等级≤5级时样品质量合格^[22], 则本文中涉及的25批银翘解毒片样品均合格。系统指纹定量法可同时定性定量评价银翘解毒片的质量一致性, 为其整体质量控制提供了简便可靠的方法。

3.3 含量测定

3.3.1 线性关系的考察

分别精密吸取混合对照品溶液适量, 用甲醇稀释, 制成6个质量浓度水平的系列对照品溶液, 按2.3节的色谱条件测定。以峰面积(Y)对对照品质量浓度(X, μg/mL)进行回归, 结果见表 2。6组分在各自的线性范围内线性关系良好。

表 2 6组分的线性回归方程 Table 2 Linear regression equations of the six components

3.3.2 精密度、重复性和稳定性试验

依据融合指纹图谱分析的方法学试验, 用6组分峰面积的RSD评价定量分析的精密度、重复性和稳定性。RSD均小于3.0%, 表明精密度、重复性和稳定性均满足定量分析要求。

3.3.3 加样回收率试验

精密称定已知含量的样品6份, 分别精密加入CGA、CFA、LQ、HES、PL和ACT对照品适量, 按2.2节的方法处理, 进样, 测定各组分的含量, 计算回收率。结果6组分的平均回收率为97.1%~100.3%, RSD均小于2.7%, 表明方法的准确度良好。

3.3.4 样品含量的测定

分别进样测定25批银翘解毒片样品供试液, 记录CGA、CFA、LQ、HES、PL和ACT峰的色谱峰面积, 按线性回归方程分别计算各组分的含量, 结果见表 1。25批样品中, CGA的含量在6.09~7.80 mg/g范围内; CFA的含量在0.12~0.41 mg/g范围内; LQ的含量在0.42~0.78 mg/g范围内; HES的含量在0.51~0.82 mg/g范围内; PL的含量在0.32~0.99 mg/g范围内; ACT的含量在3.16~8.03 mg/g范围内。各组分含量的差异可能是所用原料药的成分波动和生产过程的波动所导致的。

为了探索6组分定量结果与定量参数P_m间的关系, 将25批样品的P_m值(Y)对6组分含量的平均值(X, mg/g)作图, 发现较好的线性关系(相关系数R²=0.968 3)。这表明所选6组分的含量与银翘解毒片总体化学成分的含量基本同步变化, P_m具有替代多组分定量分析的潜质, 为银翘解毒片的质量控制提供了简便、经济的方法。

3.4 主成分分析

本文采用SIMCA-P+软件, 将25批银翘解毒片三波长融合指纹图谱中共有峰的峰面积数据作为输入数据, 得到前3个主成分的累积贡献率为86.29%, 超过85%。故如图 4所示，建立基于3个主成分的PCA得分图, 从整体上直观显示样品间的差异。由PCA的得分图看出:25批样品明显地分为两部分, 来自北京同仁堂科技发展股份有限公司的13批样品(S1~S13) 较好地聚集在一起, 其余12批样品(S14~S25) 聚集在一起且全部来自江苏康缘药业股份有限公司。结果表明同一厂家生产的样品具有相对较好的质量一致性。

图 4 25批银翘解毒片样品主成分分析得分图 Fig. 4 Principal component analysis (PCA) score plot of 25 YQJDT samples

4 结论

本文建立了银翘解毒片三波长融合HPLC指纹图谱, 并采用系统指纹定量法从定性、整体定量两个方面评价了25批样品的质量。结果来自两个厂家的25批样品均合格, 北京同仁堂科技发展股份有限公司13批样品(S1~S13) 的平均质量等级小于江苏康缘药业股份有限公司12批样品(S14~S25) 的平均质量等级。同时测定了CGA、CFA、LQ、HES、PL和ACT的含量, 并与指纹图谱相结合, 结果表明定量参数P_m具有替代多组分定量分析的潜质。此外, PCA结果能够反映25批银翘解毒片样品色谱图的直观结果。以上结果表明, 基于系统指纹定量法的融合HPLC指纹图谱结合定量检测和PCA可以为银翘解毒片的质量控制提供简单、可靠的方法。

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