食物中毒是指使用了被有毒有害物质污染的食品或者食用了含有有毒有害物质的食品后出现的急性、亚急性疾病[1]。近年来, 我国由于误食或投毒引起的食物中毒事件时有发生, 由食物中毒引发的公共卫生安全事件也越来越受到百姓的关注[2]。
引起食物中毒的常见物质主要有农残、兽残、鼠药、非法添加物、重金属、生物毒素、真菌毒素等。目前, 有机类毒物的检测主要采用高效液相色谱法[3-6]、气相色谱法[7-9]、高效液相色谱-质谱法[10-15]、气相色谱-质谱法[16-18]等。由于食物中毒具有突发性以及未知性, 常用的高效液相色谱以及气相色谱法不足以有效地对非目标性物质进行定性, 虽然高效液相色谱-质谱、气相色谱-质谱联用技术具有较强的定性能力, 但都属于以四极杆作为质量分析器的低分辨质谱, 不能有效地区分一些质荷比(m/z)较为接近的干扰物, 常出现假阳性结果。一次性分析几百种物质时, 通常需要分组进行检测, 当使用全扫描模式时, 其灵敏度较低, 分辨率差, 不能准确定性, 需要依靠标准物质, 这显然无法满足处理突发性食品中毒事件的需求。而超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法(UHPLC-Q-TOF MS)具有高通量、高分辨率、高质量准确度、高灵敏度的特点[19]。用信息依赖性扫描(information dependent acquisition, IDA)模式, 一次进样分析不仅可以获得准确的一级质谱信息, 而且可以同时获得检出物质的MS/MS精确质量质谱图。根据物质的分子式与一级精确质量质谱图进行对比, MS/MS精确质量质谱图通过搜索标准质谱库进行匹配, 在不需要标准物质的情况下完成对毒物的准确定性。
因此, 本实验室根据一起江苏某地几名居民食用某煎饼铺售卖的煎饼而引起的突发性食物中毒事件, 以QuEChERS净化为手段, 采用UHPLC-Q-TOF MS建立了突发性食物中毒有机类物质的快速筛查方法。建立了581种常见食物中毒物质的精确质量数据库和谱图库, 利用数据库对质谱检测结果进行筛查分析, 无需标准品对照, 一次进样就能完成581种中毒物质的快速筛查与确证。该方法快速、灵敏、准确, 为突发性食物中毒事件的快速筛查检测提供了有力的分析平台, 从而为相关政府机构制定应急方案提供可靠的数据支撑。
X-500R超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪, 配有SCIEX OS数据处理软件(美国SCIEX公司); 冷冻离心机(2-16K, 德国Sigma公司); 涡旋振荡器(Vortex-Genie2, 美国Scientific Industries公司); 萃取包粉末(QuEChERS AOAC Pouch, 6 g硫酸镁、1.5 g乙酸钠), 陶瓷均质子(ceramic homogenizers)(美国Agilent公司); 甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯(德国Merck公司); 实验用水均为质谱级(W6-4, 美国Fisher公司)。
食物中毒样本由事发地所管辖的县疾控中心采集, 包括不同居民家中吃剩的煎饼样本4份(均购自同一煎饼铺)、煎饼铺发面用的小苏打以及和面用的水各1份, 同时采集了5份呕吐物, 共计11份样本, 通过冷链运输并于采样当日送达, 样本送达后24 h内完成检测。
固体样品:称取5 g(精确至0.01 g)均质过的试样于50 mL具塞离心管中, 加入陶瓷均质子, 加水至10 mL, 振荡混匀后准确加入10 mL乙腈, 振荡提取5 min, 加入萃取包粉末, 振荡混匀5 min后以不低于8 000 r/min的转速离心10 min。上清液直接上样。
液体或呕吐物样品:用量筒取10 mL试样于50 mL具塞离心管中, 加入陶瓷均质子, 准确加入10 mL乙腈, 振荡提取5 min, 加入萃取包粉末, 振荡混匀5 min后, 以不低于8 000 r/min的转速离心10 min。上清液直接上样。
液相色谱条件:色谱柱为Acquity UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, Waters公司); 流动相A为0.1%(v/v)甲酸水溶液, 流动相B为0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液。线性梯度洗脱程序:0~1.0 min, 98%A; 1.0~2.0 min, 98%A~90%A; 2.0~10.0 min, 90%A~40%A; 10.0~12.0 min, 40%A~10%A; 12.0~15.0 min, 10%A; 15.0~15.1 min, 10%A~98%A; 15.1~18.0 min, 98%A。流速为0.3 mL/min, 柱温为40 ℃, 进样量为10 μL。
质谱条件:双喷雾(twin spray)离子源, 电喷雾电离(ESI)模式; 离子源温度为550 ℃; 正离子模式扫描; 喷雾电压:5 500 V; 去簇电压:80 V; 雾化气(氮气)压力:447.8 kPa; 气帘气(氮气)压力:275.6 kPa; 辅助雾化气(氮气)压力:447.8 kPa。
数据采集方式:TOF MS/IDA/TOF MS/MS复合扫描模式; IDA触发10个子离子扫描；碰撞电压:35 eV; 碰撞电压差为±15 eV。TOF MS全扫描发现所有物质, TOF MS/MS对物质进行MS/MS数据采集, 用于标准质谱库的搜索。
采用SCIEX OS软件采集数据和处理数据。在SCIEX OS软件中只需输入目标化合物的分子式, SCIEX OS根据目标化合物的一级精确质量数、同位素分布比和MS/MS搜库结果, 在无标准品的情况下即可完成对目标物的筛查。
根据县疾控中心提交的相关资料显示, 中毒者均有呕吐的症状。由于中毒者食用的煎饼为面制品, 而小麦或面粉容易发生霉变产生真菌毒素, 如呕吐毒素就能致人呕吐。因此, 首先确认了真菌毒素作为筛查对象。同时, 此类中毒事件有可能是人为投毒。普通百姓最易得到的是鼠药以及农药类毒物, 并且这两类物质也都可能引起中毒者呕吐, 因此将鼠药及农药类毒物也作为筛查对象。最终确认筛查24种真菌毒素、11种鼠药以及546种农药, 各物质的分子式见附表1(www.chrom-china.com/UserFiles/File/sp1704036_SupportingInformation(1).pdf)。
通常, 突发性食物中毒的致病原因具有高度的不确定性, 虽然可以根据临床症状推测疑似目标物质的范围, 但仍可能漏掉真正的目标物质。因此急需一种简单快速且能适用于多类物质的提取方法。目前, 真菌毒素、鼠药、农残的检测均有用乙腈作为提取试剂的报道[20-22]。研究[19]证明, 乙腈极性较大, 穿透能力强, 能提取范围较宽、种类较多的目标物质。且相对其他试剂而言, 乙腈提取的色素等杂质较少[19]。因此, 本实验选用乙腈作为提取试剂。
由于中毒样本基体复杂, 如呕吐物中含有有机酸、色素、油脂等, 不仅会干扰目标物质的分析, 同时也可能对色谱柱及质谱造成致命的损害, 因此需要一种简单有效的净化方法去除杂质干扰。基于基质固相分散技术开发的QuEChERS法操作简单、效率高、目标物质回收率稳定, 已被广泛运用于多种基质中农药残留、鼠药、真菌毒素的检测[23-25]。本实验室基于多年来处理突发性食品中毒事件中长期积累的经验, 发现QuEChERS法不仅在复杂基质中具有较好的提取效率, 而且最突出的优势在于此前处理方法简单快速, 非常适合用于突发性公共安全事件的检测, 如已建立的鼠药检测方法[26]。虽然固相萃取净化法去除一些复杂基质的基质效应的能力较QuEChERS法更强, 且回收率更高, 但是固相萃取法对目标物质的适用范围并没有QuEChERS法广泛, 不同极性的物质需要用不同类别的固相萃取柱, 如真菌毒素的净化需要免疫亲和柱[27], 兽残中瘦肉精的净化提取需要用MCX柱[28], 而类胡萝卜素则需要C18固相萃取柱[29]。同时, 固相萃取法处理过程较繁琐, 通常需经历活化、上样、淋洗、氮吹、复溶等步骤, 非常耗时, 并不适合突发性公共安全事件的应急检测。因此, 本方法以食品中鼠药的快速筛查检测方法为基础, 建立了固体、液体及呕吐物类样品的QuEChERS净化方法, 详见1.2节。
对物质定性通常需要一级精确质量数、同位素分布比、MS/MS的搜库结果。SCIEX OS软件可以设置筛查标准, 首先将581种目标物质的列表导入SCIEX OS软件, 进行数据处理。以筛查出的呋喃丹为例, 图 1为呋喃丹的一级质谱提取离子流色谱图, 图 2为呋喃丹的一级质谱图及同位素匹配图, 图 3为呋喃丹的二级质谱图与Q-TOF MS数据库中碎片离子的全扫描质谱图的镜像对比图。由图 2可知, 呋喃丹的精确质量数偏差为-0.8 ppm(-0.8×10-6), 同位素峰的分布和丰度与数据库匹配度偏差为0.8%。由图 3二级质谱镜像对比结果可知, 主要特征碎片与谱库匹配良好, 匹配度为98.1%, 由此判断样品中的中毒物质为呋喃丹。为了验证筛查的准确性, 又对呋喃丹标准品进行了分析。由图 4~6可知, 呋喃丹标准品的保留时间、一级精确质量数、同位素分布比、MS/MS信息与中毒样品筛出的物质以及谱库完全吻合, 充分证明了该方法的可靠性。
根据一级质谱(见图 2)和二级质谱图(见图 3), 呋喃丹分子离子峰[M+H]+为m/z222.112 3, 其主要二级碎片离子分别为m/z123.043 7及m/z165.090 9。呋喃丹分子M首先在ESI源中电离形成[M+H]+分子离子峰(m/z222.112 3), 其取代基上的羰基发生α位键断裂, 失去CH3NHCO+碎片, 形成M1中性分子, 由于体系中存在酸, 因此形成[M1+H]+碎片离子(m/z165.090 9); [M1+H]+碎片离子的呋喃环内发生重排形成M2+离子, 羰基α位键进一步断裂, 失去CH3CO+碎片, 形成M3中性分子, 由于体系中存在酸, 因此形成[M3+H]+碎片离子(m/z123.043 7)。呋喃丹的具体裂解途径见图 7。
本研究采用外标法定量, 以呋喃丹的峰面积(y)和对应的质量浓度(x, ng/mL)进行线性回归, 得到线性方程和相关系数(r2)。线性范围为0.5 ~500 ng/mL, 线性相关系数为0.998。向阴性样品中添加呋喃丹标准品, 考察方法的检出限(S/N=3) 和定量限(S/N=10), 分别为0.3 μg/kg和1 μg/kg; 在10、50、200 μg/kg 3个添加水平下的回收率为75.6%~95.9%, 相对标准偏差为3.6%~6.9%(n=6)。呋喃丹的检出限、定量限、线性相关系数、线性方程、回收率及精密度见表 1。
送检的11份样本有9份检出呋喃丹, 其中4份煎饼中呋喃丹的含量分别为1.1、2.2、4.5、4.4 mg/kg, 5份呕吐物中呋喃丹的含量分别为0.022、1.5、1.9、0.95、1.3 mg/kg, 小苏打和水样未检出呋喃丹。煎饼中呋喃丹的含量差异较大, 可能是因为和面的时候呋喃丹分布不均匀。另外, 第一份呕吐物中呋喃丹含量较低(0.022 mg/kg), 因为只采集到了中毒者残留在衣领处的少量呕吐残渣, 但可以确定5份呕吐物中均含有呋喃丹。根据GB 2763-2016的规定, 呋喃丹在谷物中的最大残留限量为0.05~0.1 mg/kg, 而送检样的4份煎饼中呋喃丹的含量均超过最大限量值10倍以上, 因此导致了本次中毒事件。
建立了在无需标准品对照的情况下快速筛查突发性食物中毒事件中581种农残、鼠药、真菌毒素的UHPLC-Q-TOF MS方法, 运用该方法成功处理了一起由于呋喃丹引起的中毒事件。该方法简单、快速、准确, 为突发性食物中毒事件的快速筛查检测提供了有力的分析平台, 可为临床医生救治病人提供关键的数据信息, 为挽救生命争取宝贵的时间。
2017,
Vol. 35 Issue (9): 957-962
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2017,
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