肉桂醛(cinnamaldehyde)也称为桂醛, 为无色至淡黄色黏稠状液体, 具有强烈的肉桂气味, 大量存在于肉桂等植物体内[1, 2], 自然界中天然存在的肉桂醛均为反式结构。肉桂醛可作为水果防腐剂[3, 4], 并可在食品中作为香料、调料以改善口感风味。美国香料生产者协会(FEMA)对肉桂醛的安全性进行了系统评价[5], 认为其作为食品添加剂没有安全风险, 在冷饮、肉类及胶姆糖中的推荐使用量为7.7~4 900 mg/kg[6]。中国、美国和日本已将肉桂醛应用于食品和食品包装中, 利用其杀菌、消毒、防腐的功能延长食品的保质期[7-10]。我国食品安全国家标准《食品添加剂使用标准》[11]中规定肉桂醛作为防腐剂可在经表面处理的鲜水果中使用, 最大使用量按照生产需要适量添加, 残留量应≤0.3 mg/kg。
目前检测肉桂醛残留量方法的报道较少, 且现有方法均针对肉桂醛含量较高的调味品[12]、中药[13, 14]和饲料[15]等, 检测含量均大于100 mg/kg。我国药典[16]规定采用高效液相色谱法测定肉桂醛; 我国食品安全国家标准《食品添加剂肉桂醛》[17]中规定肉桂醛作为食品添加剂时, 以气相色谱法作为其有效成分的检测方法, 但并不适用于食品中该物质的检测。其他文献报道的检测方法有紫外分光光度计法[18, 19]、液相色谱法[20, 21]、气相色谱法[22, 23]、气相色谱-质谱法[24]等, 前3种方法更适用于较高含量的肉桂醛检测; 气相色谱-质谱法灵敏度更高, 并且可以借助谱库对目标化合物准确定性。粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会(JECFA)也没有肉桂醛的检测标准。
本研究选取水果和鲜肉基质, 利用改良的QuEChERS前处理技术结合气相色谱-质谱, 建立了快速、准确检测食品中肉桂醛残留的定性定量分析方法。
气相色谱-质谱系统(美国Thermo公司), 包括Trace 1310气相色谱系统、ISQ LT质谱检测器、Xcalibur工作站; 高速离心机(美国Sigma公司); ZKXT-5600高速均质机(北京中科光大公司); Milli-Q净化器(美国Millipore公司)。
N-丙基乙二胺(PSA)(40~60 μm)、石墨化炭黑(GCB)(120~400 μm)和C18吸附剂(50 μm); 乙腈、乙酸乙酯、甲苯为色谱纯(美国Fisher公司); 肉桂醛标准品(纯度≥99%, CAS No.: 104-55-2, 美国AccuStandard公司); 亚铁氰化钾、乙酸锌为分析纯。实验用水为经Milli-Q净化系统过滤的高纯水。水果及鲜肉样品均购自北京某超市。
准确称取10 mg肉桂醛标准品(精确至0.01 mg), 用乙腈溶解, 配制成质量浓度为100 mg/L的标准储备液溶液。准确吸取肉桂醛标准储备液1 mL, 置于50 mL容量瓶中, 用乙酸乙酯定容, 配制1 mg/L的肉桂醛标准中间液。
准确吸取肉桂醛标准中间液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 mL, 用乙酸乙酯定容至10 mL, 配制成质量浓度分别为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.5 mg/L的标准工作溶液, 现用现配。
新鲜水果:称取试样5 g(精确到0.01 g), 置于50 mL离心管中, 加入10 mL乙酸乙酯, 以10 000 r/min均质提取1 min, 然后以8 000 r/min离心5 min, 转移出上层乙酸乙酯提取液, 用乙酸乙酯定容至10 mL, 待净化。
鲜肉:称取试样5 g(精确到0.01 g), 置于50 mL离心管中, 加入10 mL水, 漩涡混匀, 加入2 mL铁氰化钾溶液(92 g/L)和2 mL乙酸锌溶液(183 g/L), 漩涡混匀, 然后加入20 mL乙酸乙酯, 以10 000 r/min均质提取1 min, 以8 000 r/min离心5 min, 转移出上层乙酸乙酯提取液, 用乙酸乙酯定容至20 mL, 待净化。
新鲜水果:分别称量50 mg PSA、10 mg GCB和10 μL甲苯, 置于2 mL具塞离心管中, 加入1 mL提取液, 涡旋振荡1 min, 静置5 min, 过针筒式滤膜, 待分析。
鲜肉:分别称量50 mg PSA、10 mg GCB和100 mg C18, 加入10 μL甲苯, 置于2 mL具塞离心管中, 加入1 mL提取液, 涡旋振荡1 min, 静置5 min, 过针筒式滤膜, 待分析。
色谱柱:DB-5 MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm); 进样口温度:250 ℃; 载气:氦气, 纯度≥99.999%;流速:1.2 mL/min。程序升温:初始温度40 ℃, 保持1 min; 以15 ℃/min的速率升至180 ℃, 保持1 min; 以50 ℃/min的速率升至300 ℃, 保持3 min。进样量:1 μL; 进样方式:不分流进样; 开阀时间:1.5 min。
离子源:EI源; 扫描方式:选择离子监测方式; 离子源温度:280 ℃; 传输线温度:280 ℃; 电离能量:70 eV; 溶剂延迟:5 min。
肉桂醛的保留时间为8.86 min, 定量离子为131.1, 定性离子分别为103.1、77.1和51.1。4种离子的相对丰度比为100：67：62：45。
肉桂醛的共轭苯环结构在290 nm处有最大吸收波长, 可以通过液相色谱-二极管阵列检测器进行测定, 同时肉桂醛具有挥发性, 也可通过气相色谱或气相色谱-质谱进行检测。采用以上3种方式对肉桂醛标准溶液(200 mg/L)进行分析, 结果显示, 采用气相色谱-质谱时, 肉桂醛的灵敏度最高(S/N=600), 其次是液相色谱(S/N=85)和气相色谱(S/N=20)。但肉桂醛的相对分子质量较小, 使用气相色谱-质谱联用仪进行检测时, 产生的分子离子碎片较小, 容易受到杂质干扰, 因此实验尝试采用液相色谱法, 通过加入盐酸羟胺或2, 4-硝基苯肼的方式进行衍生[25, 26], 但反应均产生2个以上衍生物, 无法定量测定。同时实验还发现肉桂醛性质活泼且易挥发, 使用真空旋转蒸发或氮气浓缩手段均有很大损失。因此最终选择最灵敏的气相色谱-质谱进行检测。肉桂醛标准溶液(10 mg/L)的色谱图和质谱图见图 1。
肉桂醛易溶于甲醇、乙醇和乙醚。考虑到乙醚挥发性较强, 因此实验分别选用甲醇和乙腈作为溶解液配制标准溶液。将甲醇和乙腈配制的标准溶液(10 mg/L)在室温下避光放置1周, 采用气相色谱-质谱进行分析, 扫描范围为m/z 0~300。结果表明, 采用甲醇时, 色谱图出现双峰, 经与谱库比对, 推测其中一个为肉桂醛的分解产物; 采用乙腈时, 没有发现分解产物的色谱峰。因此选择乙腈作为配制标准溶液的溶解液。
经查阅文献, 报道较多的3种提取试剂分别为甲醇[16]、乙醇[12, 19]和乙酸乙酯[22, 27]。常用的提取方式为超声(30 min)和均质(1 min)。实验分别采用以上3种提取试剂并结合超声和均质两种提取方式对加标苹果样品进行分析。结果表明, 采用甲醇和乙酸乙酯提取试剂并结合均质提取时肉桂醛的回收率最高, 可达90% ~105%(见图 2)。而乙酸乙酯可作为非极性石英毛细管柱的进样溶剂, 净化后无需格外的浓缩步骤, 避免了浓缩对目标化合物的损失。因此实验最终选择乙酸乙酯作为提取试剂。
新鲜水果的含水量较高, 经预处理后成浆状, 在均质过程中可以在乙酸乙酯提取液中很好地分散, 高速离心后, 乙酸乙酯层和水层明显分层, 没有乳化现象发生, 提取液可进一步净化。
由于鲜肉黏度较高, 对鲜肉进行提取前需加入10 mL水分散基质, 然后对应添加20 mL乙酸乙酯进行提取。鲜肉中蛋白质和脂肪含量较高, 均质过程中水层和乙酸乙酯层发生了乳化, 因此需要去除多余的蛋白质。实验选取乙酸锌溶液(2 mL, 183 g/L)和亚铁氰化钾溶液(2 mL, 92 g/L)作为蛋白质沉淀剂, 以防止乳化现象的发生。加入蛋白质沉淀剂后, 乙酸乙酯层与水层界线清晰, 肉桂醛的回收率在90%以上。
将1 mL 0.5 mg/L和1 mL 10 mg/L的肉桂醛标准溶液分别加入10 mL甲醇、乙醇、乙腈和乙酸乙酯等4种不同溶剂中, 在40 ℃和室温(25~30 ℃)条件下对溶剂进行真空旋转蒸发浓缩和氮气浓缩。结果表明, 在室温条件下, 无论旋转蒸发还是氮气浓缩, 均会损失60%以上的目标化合物, 且前处理过程需耗时1 h。40 ℃条件下浓缩可以缩短溶剂挥发的时间, 但损失率高达95%。因此肉桂醛含量较低的样品无法采用常规的浓缩手段, 只能通过选择高灵敏度的仪器达到检测目的。
水果的主要成分有水分、糖分、有机酸和色素, 通过外标法直接进样, 回收率超过200%, 基质增强效应较为明显, 且直接对样品进行分析会对仪器系统造成较大污染, 因此需要对样品进行净化。实验根据文献[28-31]考察了PSA和GCB的使用量, 以及添加甲苯与否对肉桂醛回收率的影响。
采用正交试验对3个影响提取效率的因素进行考察, 具体方案和结果见表 1。结果表明, 影响肉桂醛回收率因素的主次顺序是PSA＞GCB＞甲苯, 最优的净化剂组合是50 mg PSA、10 mg GCB和10 μL甲苯。以加标葡萄样品(0.3 mg/kg)为例, 其净化前后的色谱图见图 3。可以看出, 净化后目标化合物附近的杂峰变少, 且回收率为103%, 基质增强效应明显得到了抑制。
肉类的主要成分有水、蛋白质和脂肪, 同时含有无机盐和少量色素。对未经净化的猪肉提取液上机测定, 目标化合物周围没有干扰峰, 但基线水平较高, 基质增强作用明显, 因此需要净化。样品均质提取后, 可通过离心将蛋白质和水分有效去除, 但是仍有部分脂肪无法去除。因此在净化水果样品的基础上, 分别考察了不同剂量(0、50、100和200 mg)的C18固相吸附剂对净化效果的影响。结果表明, 加入100 mg和200 mg C18固相吸附剂时的净化效果基本相同。因此对鲜肉样品进行净化时, 在净化水果步骤的基础上, 添加100 mg C18固相吸附剂。
对肉桂醛标准工作液进行测定, 以肉桂醛的浓度为横坐标(x, mg/L), 相应峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线, 其线性方程为y=1.82×104x-9.66×104, 在0.01~0.5 mg/L范围内线性良好, 相关系数(R2)＞0.999。
为考察方法的定量限是否满足SN/T 0001-2014标准的要求, 分别向净化后的空白樱桃和猪肉样品中添加肉桂醛标准溶液, 使其达到预计的定量限水平0.05 mg/kg和0.1 mg/kg。在气相色谱-质谱上进行检测, 计算得到空白樱桃和猪肉样品中肉桂醛的信噪比(S/N)分别为73和23, 高于10倍信噪比, 满足定量限低于我国食品安全国家标准《食品添加剂使用标准》中规定的水果中肉桂醛限量值(0.3 mg/kg)的1/3的检测要求。
根据SN/T 0001-2014标准中方法验证的要求, 对橙子、苹果、桃、蓝莓、葡萄、荔枝、芒果、香蕉和西瓜等9种新鲜水果基质进行0.05、0.3和0.6 mg/kg 3个水平的加标回收试验, 每个水平重复6次。结果表明, 肉桂醛的回收率为80.0% ~108.8%, 精密度≤8.6%(见表 2)。
对猪肉、牛肉和羊肉3种新鲜肉类进行定量限、2倍定量限和10倍定量限的加标回收试验。结果表明, 鲜肉样品中肉桂醛的回收率为81.9% ~104.5%, 精密度≤7.1%(见表 2)。
分别配制100 mg/L和10 mg/L的肉桂醛标准溶液, 于-20 ℃、4 ℃和室温下进行避光和不避光保存, 在第1、2、4、8、12、20和24周对其进行测定, 每次测定2个平行溶液, 考察标准溶液的稳定性。
结果表明, 10 mg/L的标准溶液在所有条件下均可稳定保存2周; 在-20 ℃和4 ℃避光条件下可稳定保存8周。100 mg/L标准溶液在所有条件下均可稳定保存12周。
按1.3节描述对加标苹果样品(0.3 mg/kg)进行提取和净化, 净化液平均分成5份, 于4 ℃避光保存, 每天取样1份, 连续测定5 d。结果表明, 肉桂醛在第3 d开始出现明显衰减(剩余59.8%的目标物), 第5 d全部衰减。因此为保证结果的准确性, 试样溶液需在24 h内测定。
除对加标回收试验的9种水果和3种鲜肉样品进行实际检测外, 还对树莓、哈密瓜、菠萝、梨、李子、木瓜、火龙果、猕猴桃和鲜鸡肉等9种典型基质进行检测。结果表明, 1个芒果样品和1个树莓样品中检出肉桂醛，含量分别为0.068 mg/kg和0.063 mg/kg, 其余样品中肉桂醛含量均小于定量限。
本文采用改良的QuEChERS前处理技术结合GC-MS, 建立了食品中肉桂醛残留量的快速测定和确认方法。该法适用于水果及肉类中肉桂醛的测定, 填补了食品中低含量肉桂醛测定方法的空白。该方法灵敏度高, 重复性好, 且具有稳定的回收率, 能够满足GB 2760-2014标准规定的水果中肉桂醛限量的测定要求, 也为鲜肉中肉桂醛限量的设定建立前期风险监控检测基础。
2018,
Vol. 36 Issue (6): 541-546
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