色谱  2018, Vol. 36 Issue (7): 621-628   PDF    
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齐 鹤鸣
韩 深
吕 美玲
尹 志强
严 华
李 建辉
崔 凤云
超高效液相色谱-串联质谱法同时测定牛肉中18种食源性兴奋剂类药物残留
齐鹤鸣1, 韩深1, 吕美玲2, 尹志强1, 严华1, 李建辉1, 崔凤云1     
1. 北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 北京 100026;
2. 安捷伦科技(中国)有限公司, 北京 100102
收稿日期：2018-01-14
基金项目：国家质量监督检验检疫总局科技计划项目（2017IK143，2016IK018，2016IK021）
通讯联系人：崔凤云, Tel:010, 58619096, E-mail:cuifyciq@163.com
摘要：建立了超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）检测牛肉中18种食源性兴奋剂类药物残留的方法。牛肉组织经酸化乙腈提取，Captiva小柱脱脂净化后，用无水硫酸镁干燥，上清液氮吹浓缩，残渣用甲醇-水（7：3，v/v）溶解。采用Agilent Zorbax Phenyl-Hexyl色谱柱分离，以5 mmol/L醋酸铵水溶液（含0.01%（v/v）醋酸）和甲醇-乙腈（7：3，v/v）作为流动相进行梯度洗脱，在电喷雾正负离子切换模式下以多反应监测（MRM）方式检测，用基质匹配标准曲线外标法定量。结果表明，18种食源性兴奋剂类药物在0.10~50 μg/L范围内线性关系良好，相关系数（R2）≥ 0.9950；在0.4、1.0和2.0 μg/kg添加水平下的回收率为57.3%~117.5%，相对标准偏差为3.1~15.6%（n=5）；方法的检出限和定量限分别为0.0006~0.0900 μg/kg和0.0020~0.3000 μg/kg。该法可以实现对牛肉样本中18种兴奋剂类药物残留的定性定量分析，具有简单、快速、准确性高的特点。
关键词：超高效液相色谱-串联质谱    食源性兴奋剂类药物    残留    牛肉组织    
Simultaneous determination of 18 food-borne stimulant drug residues in beef using ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
QI Heming1, HAN Shen1, LÜ Meiling2, YIN Zhiqiang1, YAN Hua1, LI Jianhui1, CUI Fengyun1     
1. Inspection and Quarantine Technique Center, Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Beijing 100026, China;
2. Agilent Technologies(China) Limited, Beijing 100102, China
Foundation item: Science and Technology Planning Project of General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People's Republic of China (Nos. 2017IK143, 2016IK018, 2016IK021)
Abstract: A method for the simultaneous determination of 18 food-borne stimulant drug residues in beef was developed based on ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS). The beef sample was extracted with acidified acetonitrile, cleaned up by Captiva filtration cartridge. The extract was dried with anhydrous magnesium sulfate, and then concentrated by nitrogen flow. The obtained residue was re-dissolved in methanol-water (7:3, v/v). The separation was performed on an Agilent Zorbax Phenyl-Hexyl column with 5 mmol/L ammonium acetate solution (containing 0.01% (v/v) acetic acid) and methanol-acetonitrile (7:3, v/v) as mobile phases with gradient elution. The analyte was detected in positive and negative ion modes and the multiple reaction monitoring (MRM) mode. The quantification analysis was performed by external standard method using matrix-matched calibration curves. The method was linear with the correlation coefficients (R2) ≥ 0.9950 in the range of 0.10-50 μg/L. At the spiked levels of 0.4, 1.0 and 2.0 μg/kg, the recoveries of all compounds ranged from 57.3% to 117.5%, with RSDs in range of 3.1%-15.6% (n=5). The limits of detection and limits of quantification were in the range of 0.0006-0.0900 μg/kg and 0.0020-0.3000 μg/kg, respectively. The method is simple, rapid, accurate and sensitive, and can meet the requirement for the determination of the 18 food-borne stimulant drug residues in beef.
Key words: ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UHPLC-MS/MS)     food-borne stimulant drug     residues     beef tissue    

在现代畜禽养殖中, 一些不法分子长期大量使用各种饲料添加剂和人工激素类药物, 造成动物源性食品中的药物残留, 最终成为食源性兴奋剂的来源[1]。运动员误服含有某些药物残留的食物, 可导致其兴奋剂检测呈阳性。国家认监委规定的违禁兴奋剂药物主要包括β-受体激动剂、类固醇激素、糖皮质激素和玉米赤霉醇四大类[1]。长期摄入这四类激素类药物会严重影响人类健康, 因此世界各国十分重视激素类药物的使用。我国农业部235号公告中规定倍他米松、地塞米松在牛或猪肌肉组织中的最高限量均为0.75 μg/kg; 克伦特罗、沙丁胺醇、丙酸睾酮、玉米赤霉醇和群勃龙不得在动物源性食品中检出; 氢化可的松仅可外用, 但未规定其最高残留限量值[2]。欧盟规定泼尼松龙在牛肉组织中的最高残留量为4 μg/kg, 地塞米松和倍他米松在牛、猪的肌肉中最高残留限量为0.75 μg/kg[3]。

目前, 测定食品中激素残留的方法主要有酶联免疫法[4]、高效液相色谱法(HPLC)[5]、气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)[6-9]及液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[10-21]等。酶联免疫法虽简单快速, 但易出现假阳性结果; HPLC仅靠保留时间定性, 抗干扰能力差且灵敏度不能满足残留检测要求; GC-MS/MS前处理步骤需衍生, 较为繁琐; LC-MS/MS可同时检测多种目标化合物, 且样品不需衍生化处理, 弥补了上述方法的诸多不足, 使该技术在残留分析中得到广泛应用。

在前处理方面, 净化方法一般分为两种, 一种是固相萃取法, 另一种是QuEChERS法。在固相萃取法中, 大部分文献[10-13]采用反相柱(HLB柱或C18柱)与氨基柱串联, 虽然净化效果好, 但前处理过程复杂, 耗时长, 效率低; 部分文献选用MCX柱[14, 15]或C18柱净化[16-18], 前处理过程相对简单, 但分析的激素种类单一。与传统固相萃取柱相比, QuEChERS法可以同时净化多种化合物, 减少样品转移的过程, 溶剂使用量少, 操作简便, 回收率、精确度和准确度均较好。但大部分文献[19-21]只针对单种类激素或除β-受体激动剂外多种类激素的提取和净化。近年来基于体积排阻和疏水相互作用机理的商品化脱脂小柱可以选择性吸附血浆中的磷脂、蛋白质和表面活性剂, 且对目标化合物的吸附很弱, 其操作简单, 使用前无需活化, 目前主要应用于血浆中的药物分析[22], 还未见其在食源性兴奋剂类药物残留检测方面的应用报道。

本文拟开发基于脱脂小柱净化, 结合UHPLC-ESI-MS/MS, 用于同时检测四大类兴奋剂类药物。该方法前处理步骤简单, 便于动物源性食品中兴奋剂类药物残留的大批量筛查。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 1290超高效液相色谱仪、Agilent 6490三重四极杆质谱仪(配备鞘流电喷雾离子源)(美国Agilent公司); MS3涡旋振荡器(德国IKA公司); EVAP 112氮吹浓缩仪(美国Organomation公司); 3K-15冷冻离心机(德国Sigma公司)。

甲醇和乙腈均为色谱纯(德国Merck公司); 甲酸(美国Mreda公司); 醋酸铵、乙酸均为色谱纯(美国Thermo Fisher Scientific公司); Captiva脱脂小柱、QuEChERS净化包(美国Agilent公司)。实验用水(电阻率为18.2 MΩ·cm)均为超纯水器(美国Millipore公司)制备。其他试剂均为分析纯。

β-受体激动剂类:克伦特罗(clenbuterol)、喷布特罗(penbutolol)、莱克多巴胺(ractopamine)、沙丁胺醇(salbutamol)、特布他林(terbutaline); 类固醇激素类:孕酮(progesterone); 糖皮质激素类:倍氯米松(beclomethasone)、倍他米松(betamethasone)、地塞米松(dexamethasone)、氢化可的松(hydrocortisone)、醋酸氟氢可的松(fludrocortisone acetate)、17-甲基睾酮(17-methyltestosterone)、美雄酮(metandienone)、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松(prednisone)、丙酸睾酮(testosterone-17-propionate)、群勃龙(trenbolone); 玉米赤霉醇(zeranol), 以上18种标准品均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。本实验所用牛肉基质均购自北京农贸市场。

1.2 标准溶液的配制

称取18种激素标准品各10.0 mg, 用甲醇溶解并定容至10 mL, 配制1.0 g/L标准储备液; 分别移取适量标准储备溶液, 置于10 mL容量瓶中, 用甲醇稀释并定容, 配制成1.0 mg/L的混合标准溶液; 用甲醇-水(7:3, v/v)分别稀释, 配制成不同浓度的混合标准工作液。

1.3 样品前处理

准确称取均质化、已粉碎的牛肉样品5.0 g(精确至0.1 g), 置于50 mL具塞塑料离心管中, 加入10 mL含1.0%(v/v)甲酸的乙腈溶液, 涡旋2 min, 然后加入4.0 g硫酸钠和1.0 g氯化钠, 涡旋2 min, 以5000 r/min离心5 min。取上清液2.25 mL, 向其中加入0.75 mL水, 混匀后转移至Captiva脱脂小柱中，真空抽干脱脂小柱, 收集滤液至5 mL离心管中, 然后加入0.3 g硫酸镁, 涡旋振荡, 以5000 r/min离心5 min, 移取1.0 mL上清液, 置于干净的5 mL离心管中, 于40 ℃氮吹至近干。用0.35 mL甲醇溶解上述残渣, 涡旋振荡混匀, 再加入0.15 mL水, 振荡混匀, 以14000 r/min离心5 min, 移取上清液, 置于含有内衬管的2 mL进样瓶中, 供UHPLC-MS/MS测定。

1.4 色谱条件

色谱柱:Agilent Zorbax Phenyl-Hexyl柱(150 mm×2.1 mm, 1.8 μm); 柱温:40 ℃; 流动相:A为5 mmol/L醋酸铵水溶液(含0.01%(v/v)醋酸), B为甲醇-乙腈(7:3, v/v); 流速:0.4 mL/min。梯度洗脱程序:0~3.0 min, 5%B~15%B; 3.0~3.5 min, 15%B~40%B; 3.5~13.0 min, 40%B; 13.0~15.0 min, 40%B~55%B; 15.0~17.0 min, 55%B~95%B; 17.0~19.0 min, 95%B。进样体积:3.0 μL。

1.5 质谱条件

离子源:鞘流电喷雾离子源, 正、负离子切换模式; 检测方式:多反应监测(MRM); 干燥器温度:200 ℃; 鞘气温度:350 ℃; 雾化气压力:241.4 kPa。18种食源性兴奋剂类药物的其他采集参数见表 1。

表 1 18种食源性兴奋剂类药物的保留时间(t)、母离子、定量/定性离子、碰撞能量、驻留时间和离子化模式 Table 1 Retention times (t), precursor ions, quantitative/qualitative (Quant/Qual) ions, collision energies, dwell times and ionization modes of the 18 food-borne stimulant drugs
2 结果与讨论
2.1 超高效液相色谱-质谱条件的优化
2.1.1 质谱条件的优化

对18种食源性兴奋剂类药物的混合标准溶液进行分析, 通过Agilent MassHunter Optimizer软件进行优化, 获得MRM采集参数, 包括一个母离子和两个碎片离子信息及其对应的最佳碰撞能量, 选择响应值最高的子离子作为定量离子, 另一个作为定性离子。优化后的采集参数见表 1。

2.1.2 色谱条件的优化

进一步考察采用不同色谱柱时18种食源性兴奋剂类药物的分离情况。在18种食源性兴奋剂类药物中, 倍他米松和地塞米松互为同分异构体, 较难分离, 在质谱条件相同的情况下, 需要通过改变固定相或流动相组成及梯度洗脱程序进行分离。实验首先采用Poroshell C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 2.7 μm), 同时优化流动相组成和梯度洗脱程序(见图 1a), 发现选用含甲酸或乙酸铵的甲醇水溶液作为流动相时, 大部分化合物的色谱响应均较好, 但倍他米松(峰9)和地塞米松(峰10)一直处于共流出状态。在相同流动相体系和梯度洗脱条件下, 改用Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)对目标化合物进行分离, 发现倍他米松和地塞米松仍无法基线分离, 呈现肩峰形式。在此基础上进一步优化流动相组成和梯度洗脱程序, 发现采用5 mmol/L醋酸铵水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)和甲醇-乙腈(7:3, v/v)作为流动相, 有助于提高异构体的分离度, 但仍无法达到基线分离, 而且色谱峰较宽, 保留时间相对较长, 在15 min左右(见图 1b)。

图 1 在不同色谱条件下18种食源性兴奋剂类药物的MRM色谱图 Fig. 1 MRM chromatograms of the 18 food-borne stimulant drugs under different chromatographic conditions Conditions: a. column, Poroshell C18 (100 mm×2.1 mm, 2.7 μm); mobile phase A, 5 mmol/L ammonium acetate aqueous solution containing 0.1% (v/v) formic acid; mobile phase B, methanol containing 5 mmol/L ammonium acetate and 0.1% (v/v) formic acid; flow rate, 0.3 mL/min; gradient elution program, 0-3.0 min, 5%B-15%B, 3.0-3.5 min, 15%B-45%B, 3.5-5.0 min, 45%B, 5.0-5.1 min, 45%B-65%B, 5.1-9.0 min, 65%B-75%B, 9.0-12.0 min, 75%B-95%B, 12.0-18.0 min, 95%B. b. column, Zorbax Eclipse Plus C18 (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm); mobile phase A, 5 mmol/L ammonium acetate aqueous solution containing 0.1% (v/v) formic acid; mobile phase B, methanol-acetonitrile (7:3, v/v) containing 5 mmol/L ammonium acetate and 0.1% (v/v) formic acid; flow rate, 0.4 mL/min; gradient elution program, 0-3.0 min, 5%B-15%B, 3.0-3.5 min, 15%B-45%B, 3.5-15.0 min, 45%B-55%B, 15.0-23.0 min, 55%B-95%B. c. column, Zorbax Eclipse Plus Phenyl-Hexyl (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm); mobile phase A, 2 mmol/L ammonium acetate aqueous solution; mobile phase B, methanol-acetonitrile (7:3, v/v); flow rate, 0.4 mL/min; gradient elution program, 0-3.0 min, 5%B-15%B, 3.0-3.5 min, 15%B-40%B, 3.5-12.0 min, 40%B, 12.0-12.5 min, 40%B-55%B, 12.5-16.0 min, 55%B-95%B, 16.0-18.0 min, 95%B. d. Zorbax Eclipse Plus Phenyl-Hexyl (150 mm×2.1 mm, 1.8 μm); mobile phase A, 5 mmol/L ammonium acetate aqueous solution containing 0.01% (v/v) acetic acid; mobile phase B, methanol-acetonitrile (7:3, v/v); flow rate, 0.4 mL/min; gradient elution program, 0-3.0 min, 5%B-15%B, 3.0-3.5 min, 15%B-40%B, 3.5-13.0 min, 40%B, 13.0-15.0 min, 40%B-55%, 15.0-17.0 min, 55%B-95%B, 17.0-19.0 min, 95%B.
Peaks 1-18 are the same as that in Table 1.

考虑到大部分待测化合物含有芳香环, 而苯基己基固定相可能有不同于C18固定相的选择性, 因此进一步考察了相同柱长的苯基己基Zorbax Phenyl-Hexyl色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm), 并适当调整流动相改性剂和梯度洗脱程序, 发现异构体的保留时间有所提前, 在10~11 min出峰, 且分离效果优于C18色谱柱(见图 1c), 但仍然难以实现基线分离。因此在相同条件下进一步考察柱长为150 mm的苯基己基Zorbax Phenyl-Hexyl色谱柱(150 mm×2.1 mm, 1.8 μm), 此时倍他米松和地塞米松可以达到基线分离。为兼顾在负离子模式下检测的玉米赤霉醇的灵敏度, 最终确定流动相组成为5 mmol/L醋酸铵水溶液(含0.01%(v/v)醋酸)和甲醇-乙腈(7:3, v/v), 并确定了梯度洗脱程序。在选定的实验条件下, 目标化合物色谱峰较窄, 灵敏度相对较高(见图 1d)。

2.2 样品前处理条件的优化

实验考察了4种不同净化方法对加标牛肉样品中目标化合物(2.0 μg/kg)回收率的影响(见图 2)。方法1为样品提取液直接上机分析; 方法2为样品提取液经QuEChERS方法净化(所用吸附剂为50 mg N-丙基乙二胺(PSA)、150 mg C18和900 mg硫酸钠)后直接上机分析; 方法3为样品提取液经Captiva脱脂小柱净化后直接上机分析; 方法4为样品提取液采用Captiva脱脂小柱净化后经干燥浓缩复溶再上机分析(即1.3节前处理步骤)。

图 2 不同净化方法对加标牛肉样品中目标化合物(2.0 μg/kg)回收率的影响 Fig. 2 Effect of different clean-up conditions on the recoveries of the target compounds (2.0 μg/kg) spiked in beef samples Conditions: method 1, extracted solution direct analysis; method 2, analysis of the extracted solution after QuEChERS with 50 mg primary secondary amine (PSA), 150 mg C18 and 900 mg sodium sulfate; method 3, analysis of the extracted solution after using Captiva lipid removal filtration cartridge; method 4, following method 3, the obtained filtrate was further enriched before analysis.

结果表明, 采用方法1直接分析提取液时, 18种食源性兴奋剂类药物的回收率均低于60%, 其中沙丁胺醇和特布他林的回收率低于20%, 表明肉类样品中的基质对检测结果产生显著干扰, 需要进一步净化以降低基质效应(ME)的影响。在牛肉中, 主要的基质为蛋白质和脂肪, 虽然提取液乙腈有一定沉淀蛋白质的作用, 但提取液中的脂肪依然可以产生明显的基质干扰, 严重影响测量的准确度。

采用方法2净化后, 发现大部分目标化合物的回收率较好, 其中13种目标化合物的回收率介于70%~120%之间, 但喷布特罗和丙酸睾酮的回收率较低, 分别为21%和25%。

采用方法3净化后, 发现有15种目标化合物的回收率可达到70%~120%, 说明该净化方法能够有效去除脂肪的基质干扰。与方法2相比, 使用Captiva小柱时大部分目标化合物的回收率与采用方法2时相差不多。但对于喷布特罗, 采用Captiva小柱时的回收率为70.7%, 远高于采用QuEChERS方法的回收率(21%)。但沙丁胺醇、氢化可的松和丙酸睾酮的回收率仍不理想。可能是因为在提取与净化过程中目标化合物被稀释, 影响对部分化合物的准确测定。因此采用方法4在净化、浓缩、复溶后再上机分析。结果显示, 在使用0.3 g硫酸镁作为干燥剂时大部分目标物的回收率相对于方法3有了进一步提高。除了沙丁胺醇的回收率为58%外, 其他目标化合物的回收率均在70%~120%范围内。因此最终确定采用Captiva脱脂小柱净化过滤后再浓缩富集的样品制备方法。

2.3 标准曲线

采用液相色谱-串联质谱检测时常出现基质干扰现象。本研究对基质效应进行了考察。采用牛肉空白样品基质溶液与纯溶剂分别配制标准溶液, 在相同条件下进行UHPLC-MS/MS检测, 以各组分的峰面积对其质量浓度绘制标准曲线, 获得目标化合物的基质匹配标准曲线和溶剂标准曲线。利用公式ME=k1/k2×100%计算方法的基质效应(见表 2), 其中k1和k2分别为基质匹配标准曲线的斜率和溶剂标准曲线的斜率。ME越偏离100%, 说明该化合物的基质增强效应越明显, 反之基质抑制效应越显著。如表 2所示, 其中13种目标化合物的ME介于80%~120%之间, 基质效应可忽略。特布他林有较强的基质增强效应; 群勃龙、甲基睾酮、孕酮和丙酸睾酮存在较强的基质抑制效应, 尤其是孕酮和丙酸睾酮的ME小于25%。因此本研究采用基质匹配标准曲线和外标法进行定量。在0.10~50.0 μg/L范围内, 各目标化合物的线性关系良好, 线性回归相关系数(R2)均≥0.9950(见表 2)。

表 2 18种食源性兴奋剂类药物的基质效应、线性方程、相关系数、检出限和定量限 Table 2 Matrix effects (MEs), linear equations, correlation coefficients (R2), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the 18 food-borne stimulant drugs
2.4 检出限和定量限

本研究对基质加标标准曲线进行分析, 以其3倍和10倍信噪比(S/N)确定方法的检出限和定量限。如表 2所示, 18种食源性兴奋剂类药物的检出限和定量限分别为0.0006~0.0900 μg/kg和0.0020~0.3000 μg/kg, 其中定量限均低于我国相关规定中最高残留限量标准[2]。

2.5 回收率和精密度

在空白牛肉基质中分别添加3个水平(0.40、1.0和2.0 μg/kg)的混合标准溶液, 进行加标回收试验, 每个水平做5个平行样品。如表 3所示, 18种食源性兴奋剂类药物的平均加标回收率为57.3%~117.5%, 相对标准偏差为3.1%~15.6%(n=5)。表明本方法准确度高, 稳定性好, 能够满足日常检测需求。

表 3 加标牛肉样品中18种食源性兴奋剂类药物的回收率和精密度(n=5) Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the 18 food-borne stimulant drugs spiked in beef samples (n=5)
3 结论

本文研究了牛肉组织中18种食源性兴奋剂类药物残留的检测方法。该方法采用酸化乙腈提取牛肉中的目标化合物, 经脱脂净化和干燥富集后用超高效液相色谱-串联质谱法进行测定。该法样品前处理简单、快速, 准确度高, 可满足对牛肉组织中四大主要类别兴奋剂类药物残留的高通量检测要求。

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