色谱  2018, Vol. 36 Issue (6): 523-530   PDF    
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曹 文卿
吴 振兴
梁 成珠
静 平
崔 淑华
杨 桂朋
林 黎明
高效液相色谱-串联质谱法测定兔尿中溴氰菊酯及其毒性生物标志物
曹文卿1,2, 吴振兴1, 梁成珠1, 静平1, 崔淑华1, 杨桂朋2, 林黎明1     
1. 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 山东 青岛 266002;
2. 中国海洋大学化学化工学院, 山东 青岛 266100
收稿日期：2018-03-26
基金项目：国家质检总局科技支撑项目（2008IK263）；青岛市创业创新领军人才项目计划（13-CX-28）
通讯联系人：林黎明, E-mail:sdciqllm@126.cn
摘要：建立了一种应用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）测定兔尿中与溴氰菊酯毒性相关的多种生物标志物的检测方法。分析物包括溴氰菊酯及其代谢产物1R，3R-二溴菊酸、3-苯氧基苯甲酸，以及5种生物标志物5-羟色胺、5-羟基吲哚乙酸、3-硝基丙酸、8-羟基脱氧鸟苷和6-甲氧基鸟嘌呤。样品经硅藻土基质固相分散萃取、三氯乙酸沉淀蛋白质和HLB固相萃取小柱净化，使用电喷雾离子源，在多反应监测模式下正负切换采集测定，其中溴氰菊酯、5-羟色胺、5-羟基吲哚乙酸、8-羟基脱氧鸟苷和6-甲氧基鸟嘌呤采用正离子模式，1R，3R-二溴菊酸、3-苯氧基苯甲酸和3-硝基丙酸采用负离子模式。基质校准曲线外标法定量。结果表明，7种生物标志物在各自的浓度范围内线性关系良好（R2不小于0.9914），5-羟基吲哚乙酸的检出限和定量限分别为20 μg/L和50 μg/L，其余化合物的检出限和定量限分别为0.2~5.0 μg/L和0.5~10 μg/L；在兔尿中3个不同添加水平的平均回收率为74.2%~98.7%，相对标准偏差（RSD）不大于12%，方法简单、快速、准确、灵敏，可作为溴氰菊酯暴露评估的检测方法。
关键词：高效液相色谱-串联质谱    溴氰菊酯    1R, 3R-二溴菊酸    3-苯氧基苯甲酸    生物标志物    
Determination of deltamethrin and its toxicity biomarkers in rabbit urine by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
CAO Wenqing1,2, WU Zhenxing1, LIANG Chengzhu1, JING Ping1, CUI Shuhua1, YANG Guipeng2, LIN Liming1     
1. Technical Center of Inspection and Quarantine, Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao 266002, China;
2. College of Chemistry and Chemical Engineering of Ocean University of China, Qingdao 266100, China
Foundation item: Science and Technology Project of General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People's Republic of China (No. 2008IK263); Project Plan of Leading Talent for Entrepreneurship and Innovation in Qingdao (No. 13-CX-28)
Abstract: A method was developed for the determination of biomarkers related to toxicity of deltamethrin in rabbit urine by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). The target analytes in this method are as follows:deltamethrin and its two metabolites (1R-cis)-3-(2, 2-dibromoethenyl)-2, 2-dimethylcyclopropane carboxylic acid (dibromochrysanthemic acid) and 3-phenoxybenzoic acid (3-PBA), and five toxic biomarkers, viz. serotonin hydrochloride (5-HT), 5-hydroxyindole-3-acetic acid (5-HIAA), 3-nitropropionic acid (3-NPA), 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG), and 6-methoxyguanine. Urine samples were cleaned by matrix solid-phase dispersion extraction (MSPD) with diatomite; and protein was precipitated with trichloroacetic acid; and then the sample solutions were purified with hydrophilic-lipophilic balance (HLB) solid-phase extraction cartridges. The biomarkers were analyzed with electrospray ionization (ESI) in a positive and negative switching scan mode, in which the positive scan mode was used for deltamethrin, 5-HT, 5-HIAA, 8-OHdG, and 6-methoxyguanine, and the negative scan mode was used for (1R-cis)-3-(2, 2-dibromoethenyl)-2, 2-dimethylcyclopropane, 3-PBA, and 3-NPA. The target compounds were quantified with the external standard using matrix calibration curves. The linear regression curves of the eight target compounds were linear with correlation coefficients no less than 0.9914. The LOD and LOQ of 5-HIAA were 20 μg/L and 50 μg/L, respectively, and the LODs and LOQs of the other analytes were 0.2-5.0 μg/L and 0.5-10 μg/L, respectively. The average recoveries of the analytes spiked in rabbit urine ranged from 74.2% to 98.7% at three levels, with relative standard deviations (RSDs) no more than 12%. The method was simple, fast, accurate, sensitive, and suitable for the detection for the exposure evaluation of deltamethrin.
Key words: high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)     deltamethrin     (1R-cis)-3-(2, 2-dibromoethenyl)-2, 2-dimethylcyclopropane carboxylic acid (dibromochrysanthemic acid)     3-phenoxybenzoic acid     biomarkers    

溴氰菊酯(deltamethrin)属于高毒力菊酯类广谱杀虫剂, 分子式C22H19Br2NO3, 相对分子质量为505.20, 纯品为白色斜方针状晶体, 常温下难溶于水, 能溶于多种有机溶剂, 对光和氧不敏感, 能够稳定存在于酸性介质中, 但在碱性环境中不稳定。对人和动物具有神经毒性、生殖毒性等毒害作用, 因其在人和动物体内代谢十分迅速, 在含量低的情况下很难检测出尿中的原型; 1R, 3R-二溴菊酸(简称二溴菊酸, (1R-cis)-3-(2, 2-dibromoethenyl)-2, 2-dimethylcyclopropane carboxylic acid, dibromochrysanthemic acid)和3-苯氧基苯甲酸(3-phenoxybenzoic acid, 3-PBA)是溴氰菊酯分子的两个组成部分[1, 2], 3-PBA是多种菊酯杀虫剂相同的代谢物, 因而二溴菊酸与3-PBA可作为溴氰菊酯特异性的代谢标志物[3]。

近年来, 随着溴氰菊酯应用区域的不断拓展, 溴氰菊酯的毒理实验亦逐渐扩展到对哺乳动物的“三致”作用、代谢过程等多层次的研究[4-6]。为评估其生态风险, 许多学者首先从生物化学方向探究污染物对生物的初步毒害[7], 其中生物标志物法是目前病理学、毒理学的前沿研究内容[8-12], 该方法因为测定指标全面、精确、科学而获得普遍认可[13-15]。由于8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2′-deoxyguanosine, 8-OHdG)作为DNA氧化损伤标志物在氧化应激疾病诊疗评价中具有重要意义[16], 本文将其作为同时检测的相关生物标志物。

在机体对化学物质暴露的生化反应中, 比较重要的病理变化标志物, 比如能够精确指示器官、组织或者细胞器受损害程度的标志物可用作持续暴露的生物标志物。由于8-OHdG、6-甲氧基鸟嘌呤(6-methoxyguanine)、5-羟色胺(serotonin hydrochloride, 5-HT)、5-羟基吲哚乙酸(5-hydroxyindole-3-aceticacid, 5-HIAA)、三硝基丙酸(3-nitropropionic acid, 3-NPA)等均表现出与所研究的生物学现象的关联性, 并呈现剂量-效应关系, 所以也选作溴氰菊酯的毒理作用生物标志物。

本文以溴氰菊酯对家兔染毒暴露后可能形成的多种生物标志物以及溴氰菊酯的特异性代谢产物和溴氰菊酯为研究对象, 应用高效液相色谱-串联质谱仪建立了同时测定兔尿中二溴菊酸、3-PBA、8-OHdG、6-甲氧基鸟嘌呤、5-HT、5-HIAA和3-NPA等组合生物标志物的分析方法。为溴氰菊酯暴露风险以及环境毒理学评估提供简便、快速、准确的检测技术[17]。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

API4000Q型四极杆串联质谱仪配电喷雾离子源(美国AB公司); Agilent 1100液相色谱仪(美国Agilent公司); 涡旋振荡混合器(美国Thermo公司); Sigma低温离心机(美国Sigma公司); 旋转蒸发浓缩仪(德国Heidolph公司); Midea Mi-L213C微波炉(微波火力档) (美的公司); Gilson移液器(法国Gilson公司); 氮吹仪(美国Jic公司); Millipore超纯水仪(美国Merck Millipore公司)。固相萃取小柱:Waters Oasis HLB(200 mg/6 mL) (Waters公司)。

甲醇、乙腈、正己烷为色谱纯, 甲酸、乙酸为农残级试剂, 均购自迪马公司; 氢氧化钠、盐酸、甲酸铵、维生素C(VC)、乙酸锌、亚铁氰化钾、三氯乙酸、氨水、硅藻土(平均粒径150目, 平均孔径6 nm, 比表面20~70 m2/g)等均为分析纯, 购自国药集团化学试剂公司, 水由Millipore超纯水仪制备。

标准品:溴氰菊酯、二溴菊酸、3-PBA、8-OHdG、6-甲氧基鸟嘌呤、5-HT、5-HIAA、3-NPA(纯度大于98%), 均购自Witega公司。

1.2 标准溶液及试剂的配制

生物标志物的标准储备液分别由标准品采用适当溶剂配制:3-苯氧基苯甲酸和二溴菊酸用乙腈溶解定容, 8-羟基脱氧鸟苷和6-甲氧基鸟嘌呤用0.2%(v/v)甲酸水溶解定容, 3-硝基丙酸、5-羟色胺和5-羟吲哚-3-乙酸分别用甲醇水(1：1, v/v)溶解定容, 配制成质量浓度为100 mg/L储备液(-20 ℃避光保存); 储备液进一步用相应溶剂稀释配制成10 mg/L的标准中间液(-20 ℃避光保存); 5-羟色胺、5-羟吲哚-3-乙酸等光敏性物质须特别注意避光。5-羟色胺储备液有效期为6个月, 其余为12个月; 实验过程中用0.2% (v/v)的甲酸水溶液稀释标准中间液, 配制成混合标准工作液, 于4 ℃下避光保存。

抗氧剂(VC溶液):用纯水配制10 g/L的VC溶液, 4 ℃下避光保存, 有效期为7天; 甲酸铵缓冲液:用纯水配制1 mol/L的甲酸铵溶液, 用氨水和甲酸调节pH为9.15左右。蛋白质沉淀溶液:10% (v/v)的三氯乙酸溶液; 脱脂溶液:乙腈饱和正己烷; 提取液:2.5%(v/v)乙腈水溶液; 流动相:A为乙腈, B为0.1% (v/v)甲酸水溶液(含5.0 mmol/L甲酸铵)。

1.3 动物实验及实验材料的前处理
1.3.1 实验材料

实验用兔由青岛康大食品有限公司种兔养殖场提供, 用溴氰菊酯按一定剂量染毒后, 定期收集尿液, 按时间顺序编号贴标签, 储存于-20 ℃冰箱中。

1.3.2 提取

准确量取1 mL尿样至15 mL聚丙烯离心管中, 加入10 μL抗氧剂溶液和0.1 mL蛋白质沉淀溶液以及0.1 g硅藻土, 涡旋1 min, 4 ℃下10 000 r/min离心10 min, 分离上清液; 再用4 mL 2.5%(v/v)乙腈水溶液涡旋1 min后微波辅助提取残渣(30 s), 10 000 r/min离心5 min; 合并上清液, 用甲酸铵缓冲液调节pH至5.8~7.5, 待净化。

1.3.3 净化

1.3.2节所得提取液经5 mL脱脂溶液脱脂后加载至预先用2 mL甲醇和2 mL水活化好的HLB小柱上, 控制流速为1 d/s, 待上清液全部通过小柱, 再用5 mL 2.5%(v/v)乙腈水溶液淋洗小柱, 正压干燥3 min, 用3 mL甲醇分两次洗脱目标物, 用15 mL圆底聚丙烯离心管收集全部洗脱液, 于40 ℃下氮气流浓缩至近干, 1 mL乙腈-水(1：9, v/v)溶液复溶目标物, 4 ℃下12 000 r/min离心10 min, 吸取上清液至棕色进样小瓶, HPLC-MS/MS分析。

1.4 色谱-质谱条件

分析仪器为Agilent 1200高效液相色谱仪, 配AB4000Q-TRAP (美国AB公司)。色谱柱:Phenomenex Luna 5u C8 (150 mm×2.0 mm, 5.0 μm); 柱温:25 ℃; 流速:0.3 mL/min; 进样量:5 μL。梯度洗脱程序:0~3 min, 10%A; 3~5 min, 10%A~90%A; 5~9 min, 90%A; 9.1~15 min, 10%A。

电离方式:ESI+ & ESI-; 采集模式:MRM; 离子源温度:550 ℃; 雾化气压力:0.31 MPa; 气帘气压力:0.207 MPa; 辅助气压力:0.369 MPa; 电喷雾电压:+5 500 V & -4 500 V。各目标分析物的具体MRM设置条件见表 1。

表 1 8种目标化合物的保留时间及MS/MS参数 Table 1 Retention times and MS/MS parameters for the eight target compounds
2 结果与讨论
2.1 提取净化条件的选择
2.1.1 微波辅助提取对5-HT、5-HIAA等敏感化合物回收率的影响

由于5-HT、5-HIAA对光不稳定, 为提高这类化合物的提取效率, 分别量取两组兔尿样品(1.0 mL)于15 mL聚丙烯离心管中, 添加等量溴氰菊酯与7种生物标志物的标准溶液, 同时加入10 μL抗氧剂溶液和0.1 mL蛋白质沉淀溶液以及0.1 g硅藻土, 涡旋1 min, 4 ℃下10 000 r/min离心10 min, 分离上清液; 用4 mL 2.5%(v/v)乙腈水溶液涡旋1 min对残渣进行重复提取时, 一组采用微波辅助提取残渣(30 s), 另一组作对照, 其余操作同1.3.2节和1.3.3节, 对比各化合物的回收率测定结果。结果显示:应用微波辅助萃取的一组中5-HT、5-HIAA等敏感化合物的回收率明显高于对照组, 同时对其余化合物的回收率也有不同程度的提高。说明微波辅助提取效率高, 能加速目标物从硅藻土以及器壁的解吸附过程, 减少了操作过程中化合物的降解。

2.1.2 抗氧剂用量的优化

分别等量量取尿液样品24份, 分为4组, 每组包含样品空白和添加回收各3个平行样, 7种生物标志物添加水平均为100 μg/L; 1、2、3组加入抗氧剂的量分别为5、10和15 μL; 第4组为对照(不加抗氧剂); 按照1.3.2节和1.3.3节所述步骤处理, 经HPLC-MS/MS分析后, 计算各组样品中生物标志物的回收率。结果显示:对于8-OHdG、6-甲氧基鸟嘌呤、5-HT和1R, 3R-二溴菊酸而言, 对照组中回收率普遍低于加入抗氧剂的实验组, 回收率大小顺序依次为:第3组≈第2组＞第1组＞对照组; 第2、3组的回收率结果无明显差别; 而对于3-NPA、5-HIAA和3-PBA而言, 对照组和实验组的回收率没有显著差异。说明在处理过程中使用抗氧剂VC有利于多数化合物的稳定, 因而确定每个样品抗氧剂用量为10 μL。

2.1.3 蛋白质沉淀剂的选择

等量量取16份空白兔尿样品于15 mL聚丙烯离心管中, 每份1.0 mL兔尿, 分成4组, 每组包括样品空白(sb)和添加回收(rec)各两个平行样品; 前3组分别加入0.1 mL 10%(v/v)三氯乙酸水溶液、220 g/L的乙酸锌水溶液、106 g/L的亚铁氰化钾水溶液作为沉淀剂, 第4组作为对照不使用沉淀剂。其余按照1.3.2节和1.3.3节所述步骤进行操作。回收率结果为:第1组＞第2组＞第3组＞第4组, 同时第1组的谱图中杂质干扰较少; 综合评价第1组净化效果最好, 因而选择10%(v/v)三氯乙酸水溶液作为蛋白质沉淀剂。

2.1.4 固相萃取小柱的选择

分别考察了NH2、WCX、HLB、Al-N等固相萃取小柱对加标兔尿样品的净化效果。通过分别测定上样流出液、淋洗流出液和最后甲醇洗脱部分的目标物含量, 发现4种小柱中只有HLB小柱能在上样阶段完全保留全部生物标志物, 而且用有机相比例低于5% (体积分数)的溶液淋洗杂质时未导致目标物丢失, 最后洗脱部分中所有目标物的回收率都在可接受范围内。因此选择HLB固相萃取小柱用于尿液样品中生物标志物的净化。实验表明, pH值在5.8~7.5之间时净化效果较好。

2.1.5 旋蒸浓缩及容器内表面材质对极性目标物回收率的影响

分别采用圆底聚乙烯试管和玻璃试管将含有生物标志物的乙腈溶液用氮气吹干浓缩发现:对于极性化合物8-OHdG和6-甲氧基鸟嘌呤而言, 在聚乙烯试管中浓缩得到更高的回收率, 尤其是6-甲氧基鸟嘌呤, 使用聚乙烯试管得到的回收率比玻璃试管高2倍; 而对于极性弱的化合物如3-苯氧基苯甲酸和二溴菊酸等, 试管内表面极性的差异对其回收率无显著影响, 这可能是二氧化硅对极性强的物质亲和力较强所致。分别对样品提取液浓缩的程度控制为“浓缩至干”和“浓缩至近干”时所得目标物回收率进行对比, 发现提取液浓缩程度为“浓缩至近干”时得到的极性目标物回收率明显高于“蒸干”的一组。因而样品的浓缩选择在圆底塑料试管中氮吹至近干。

2.2 HPLC-MS/MS条件的优化
2.2.1 色谱条件的优化

比较了乙腈和甲醇两种有机溶剂作为流动相的色谱和质谱效果, 发现乙腈作为流动相可以获得更加尖锐的峰形。同时比较了在流动相中分别添加缓冲盐甲酸铵和乙酸铵对色谱信号产生的影响, 结果显示加入甲酸铵得到的信号强度、基线平滑度和峰形尖锐度皆好于使用乙酸铵的效果。在流动相中甲酸铵浓度为0~5.0 mmol/L时, 对分离效果的影响比较明显, 因而最终选择添加5.0 mmol/L甲酸铵。经考察, 流动相的酸度对于各种生物标志物的分离也存在一定影响, 流动相中添加0.1% (v/v)甲酸(pH约为3.2)时可明显改善分离度和色谱峰形。

2.2.2 质谱条件的优化

以10 μL/min的速率流动注射进样(FIA), 通过一级质谱全扫描获得各目标化合物的分子离子峰, 其中8-OHdG、6-甲氧基鸟嘌呤、5-HT、5HIAA和溴氰菊酯的分子离子为[M+H]+, 二溴菊酸、3-NPA、3-PBA的分子离子为[M-H]-; 进行二级质谱扫描, 分别获得各分子离子相应的特征子离子峰, 选择信号强度较高、干扰较小的两个子离子作为定性定量离子。通过MRM扫描模式对去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)和碰撞室出口电压(OP)等质谱参数进行优化, 根据得到的分子离子和特征子离子的强度峰值, 确定各目标化合物最优的MRM设置条件(见表 1)。最后, 用流动注射进样模式优化离子源温度、雾化气、气帘气等参数, 得到优化后的离子源温度、雾化气压力、气帘气压力、辅助气压力以及正负电喷雾电压参数分别为:550 ℃、0.31 MPa、0.207 MPa、0.369 MPa、+5 500 V和-4 500 V。

优化后得到溴氰菊酯及其7种生物标志物的总离子流图与选择离子流图分别见图 1和图 2。

图 1 8种目标化合物标准溶液的总离子流色谱图 Fig. 1 Total ion current chromatogram of standard solution of the eight target compounds Peaks: 1.6-methoxyguanine; 2. 5-HT; 3. 3-NPA; 4.8-OHdG; 5.5-HIAA; 6. deltamethrin; 7.3-PBA; 8. dibromochrysanthemic acid.

图 2 兔尿基质空白及空白基质标准添加(200 μg/L)的多反应监测图谱 Fig. 2 MRM chromatograms of the eight target compounds in blank rabbit urine and blank rabbit urine spiked with 200 μg/L standards
2.3 方法学验证
2.3.1 线性关系

配制溴氰菊酯及7种生物标志物质量浓度分别为0、1、2、5、10、20、50、100、500 μg/L的系列混合标准溶液。将空白兔尿样品按1.3.2节和1.3.3节所述步骤进行前处理, 采用溴氰菊酯及7种生物标志物质量浓度分别为0、1、2、5、10、20、50、100、500 μg/L的系列混合标准溶液溶解残渣, 应用1.4节HPLC-MS/MS条件进行测定, 以目标组分的峰面积(y)对质量浓度(x)作标准曲线, 结果表明, 二者在各自的浓度范围内呈现良好的线性关系, 相关系数(R2)大于0.991。

分别以信噪比(S/N≥3)和S/N≥10确定检出限(LOD)和定量限(LOQ), 结果显示, 5-HIAA的检出限和定量限分别为20 μg/L和50 μg/L, 其余化合物的检出限均不大于5.0 μg/L, 定量限均不大于10 μg/L(见表 2)。

表 2 兔尿中8种目标化合物的回归方程、相关系数、检出限和定量限 Table 2 Regression equations, correlation coefficients (R2), LODs, and LOQs of the eight target compounds in rabbit urine
2.3.2 回收率与精密度

在空白兔尿中分别添加50、100、200 μg/L 3个水平的混合标准溶液进行加标回收实验, 每个水平6个平行样, 按1.3.2节和1.3.3节所述步骤进行前处理, 按1.4节HPLC-MS/MS条件进行测定, 结果显示, 兔尿中溴氰菊酯及其生物标志物的平均回收率为74.2% ~98.7%, RSD不大于12%(见表 3)。

表 3 兔尿中8种目标化合物的平均加标回收率和精密度(n=6) Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the eight target compounds spiked in rabbit urine (n=6)
2.4 实际样品测定

应用该检测方法对阴性空白尿液与喂毒的实验兔子尿液等样品进行了对比, 检测结果见表 4。初步结果发现饲喂一定剂量溴氰菊酯的兔尿中生物标志物含量与空白尿样相比呈现明显变化。其中8-OHdG、6-甲氧基鸟嘌呤、3-NPA由零检出到升高, 呈正相关; 5-HT和5-HIAA含量呈明显下降状态, 呈明显负相关; 空白样品中检出二溴菊酸和3-苯氧基苯甲酸, 说明空白样品的兔饲料中原本含有溴氰菊酯残留, 随着饲喂溴氰菊酯剂量加大, 这两种代谢物含量也明显增加。因此推断该“生物标志物群”可用作溴氰菊酯毒性暴露评估的指标体系。有关染毒兔组织器官病变与生物标志物含量变化之间的关系以及有关毒理评价和分析将另文发表。

表 4 兔尿样品中8种目标化合物的测定结果 Table 4 Results of the eight target compounds in rabbit urine samples
3 结论

本文建立了一种高效液相色谱-串联质谱测定溴氰菊酯毒性效应的多种生物标志物的分析方法, 通过对溴氰菊酯暴露动物尿液中组合生物标志物的检测, 可以了解溴氰菊酯渗透到动物组织内部对器官、组织或细胞器造成的膜损伤、蛋白质变性、酶失活和DNA错误复制等不同层次的损害。该方法操作简单, 灵敏度高, 重现性好, 可为溴氰菊酯毒性暴露评估提供可靠的技术支持。

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