五氯酚及其钠盐属高毒有机氯农药, 具有致畸、致癌、致突变等毒副作用, 曾作为除草剂、杀菌剂、防腐剂、生物杀灭剂等在世界范围内广泛应用。五氯酚化学性质稳定, 残留期长, 可通过生物富集进入食物链; 五氯酚钠具有较高的水溶性, 易通过水载体广泛扩散, 从而影响生态安全并产生生物蓄积。农业部公告第235号[1]规定所有食品动物禁用五氯酚钠, 在动物源食品中不得检出。为进一步规范食品安全监督抽检工作, 《国家食品安全监督抽检实施细则(2018年版)》明确规定了畜禽肉及其副产品检测五氯酚钠项目[2]。
目前五氯酚及其钠盐的分析方法有气相色谱法(GC)[3, 4]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[5-7]、液相色谱法(LC)[8, 9]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[10, 11]和超高效液相色谱-高分辨质谱法(UPLC-HRMS)[12]。GC和GC-MS需柱前衍生, 操作繁琐; LC灵敏度不高, 且定性能力差; LC-MS/MS具有灵敏度高、选择性强、前处理简单的特点, 目前广泛应用于五氯酚的测定[10, 11]。
食品中五氯酚的前处理方法有液液萃取法(LLE)[3-5, 7]和固相萃取法(SPE)[11, 12], 但以上方法试剂使用量大, 操作繁琐。QuEChERS前处理方法于2003年由Anastassiades等[13]首次提出, 如今已成为果蔬中农药多残留分析的首选方法及分散固相萃取(d-SPE)的“模板”方法[14], QuEChERS可根据分析物的理化性质及基质种类选择不同的分散吸附剂。目前采用QuEChERS分析动物源食品中药物残留的检测方法也有许多报道[15-17], 但未有采用QuEChERS分析动物源食品中五氯酚的报道。
本文采用改良的QuEChERS结合UPLC-MS/MS分析技术, 建立了动物源食品中痕量五氯酚及其钠盐的快速测定方法。该法效率高, 操作简单, 满足残留分析及法规要求。
UPLC-30A超高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司); API 5500Q三重四极杆/复合线性离子阱串联质谱仪(美国AB SCIEX公司); GM 200碾磨仪(德国Retsch公司); T25高速分散机(德国IKA公司); KQ-500 DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司); 3-30K高速冷冻离心机(德国Sigma公司); Buchi R-210旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司); XW-80A涡旋混合器(上海医大仪器厂); Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司)。
五氯酚标准溶液(0.997 mg/mL, 溶于甲醇)购自中国计量科学研究院。碳十八键合锆胶(Z-Sep+)分散吸附剂(美国Supelco公司); C18吸附剂(40 μm, 美国Agilent公司); 无水硫酸镁(MgSO4)、乙酸铵均为分析纯(上海国药集团); 甲醇、乙腈均为色谱纯(德国Merck公司); 甲酸、乙酸均为色谱纯(美国Fluka公司)。实验用水均为经Milli-Q超纯水器纯化的超纯水。猪肉、猪肝、鸡肉、鱼肉、牛奶、鸡蛋样品购自当地超市。
准确移取适量五氯酚标准溶液, 用乙腈稀释并配制标准工作液; 用乙腈-水(1：1, v/v)配制0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 μg/L系列标准工作液, 现用现配。
移取0.5 mL空白样品提取液6份, 分别置于2 mL离心管中, 加入20 μg/L五氯苯酚标准溶液0、25、50、100、150、250 μL, 再加入500、475、450、400、350、250 μL水, 混匀过滤, 配制0、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 μg/L基质匹配标准溶液, 现用现配。
称取2.00 g均质样品, 置于50 mL具塞离心管中, 加入1%(v/v)乙酸乙腈溶液10 mL, 高速均质(或涡旋)1 min, 加入400 mg无水硫酸镁, 超声提取20 min, 以9 500 r/min离心5 min, 取上清液, 残渣加入1%(v/v)乙酸乙腈溶液10 mL, 重复提取1次, 合并提取液, 旋蒸浓缩至近干, 加入2.0 mL乙腈溶解, 转移至装有200 mg MgSO4、400 mg C18的离心管中, 涡旋30 s, 以9 500 r/min离心5 min, 移取0.5 mL净化液, 置于2 mL离心管中, 加入0.5 mL水, 混匀过滤, 供UPLC-MS/MS分析。
色谱柱:Waters Acquity UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm); 柱温:40 ℃; 流动相:A相为含5 mmol/L乙酸铵的0.1%(v/v)甲酸水溶液, B相为甲醇; 流速:0.4 mL/min。梯度洗脱程序:0~1 min, 25%B, 1~4 min, 25%B~95%B; 4~6 min, 95%B; 6~7 min, 95%B~25%B; 7~9 min, 25%B。进样体积:10 μL。
离子源:电喷雾电离(ESI)源, 负离子模式; 离子源温度:500 ℃; 电喷雾电压:-4 500 V; 雾化气流速:55 mL/min; 辅助气流速:55 mL/min; 气帘气流速:20 mL/min; 定量离子对:264.8/264.8;定性离子对:262.8/262.8、266.8/266.8和268.8/268.8, 去簇电压(DP): -110 V; 碰撞能量(CE): -5 eV。
五氯酚是一种氯代酚类物质, 为酸性化合物, 性质稳定, 质谱检测采用负离子模式([M-H]-)可获得较高的灵敏度。五氯酚分子离子([M-H]-)在三重四极杆碰撞室中不易被打碎, 难以获得特征子离子。五氯酚具有5个氯原子, 氯元素存在35Cl与37Cl同位素, 因此采用氯的4个同位素母离子对(262.8/262.8、264.8/264.8、266.8/266.8, 268.8/268.8)作为定性定量离子对, 以获得4个识别点, 满足确证要求[18]。
在ESI-模式下以流动注射方式对五氯酚标准溶液进行母离子全扫描, 优化去簇电压, 由于采用氯的4个同位素母离子对, 因此碰撞能量采用最低值-5 eV。
五氯酚的pKa为4.93, 当溶液的pH＞4.93时, 一部分五氯酚以离子态存在, 在流动相中加入甲酸能够降低溶液pH值, 使五氯酚以分子形式存在, 并可降低色谱柱残余硅羟基的活性, 从而降低目标化合物与硅羟基的次级相互作用, 获得较好的色谱峰形。加入乙酸铵可提高目标化合物的离子化效率, 从而提高灵敏度; 同样条件下有机相采用甲醇较乙腈响应值提高了1倍, 因此采用含5 mmol/L乙酸铵的0.1%(v/v)甲酸水溶液和甲醇作为流动相。
分别采用Waters Acquity UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)、Waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)色谱柱对五氯酚标准溶液进行分析, 比较五氯酚在T3柱及C18柱的响应值及色谱峰形。结果表明, 采用T3色谱柱时五氯酚的响应值比C18柱高38%。因此本文采用Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱。
五氯酚标准溶液(0.5 μg/L)的提取离子色谱图见图 1, 可见其4个同位素离子峰的丰度比与理论值(3：5：3：1)[12]一致。
动物组织内部分五氯酚是以结合态形式存在[12], 提取前需经水解(酸解[5, 15, 16]和碱解[7, 11, 12, 16])或酶解使结合态变为游离态, 但酶解后通常基质更复杂[16, 17]。猪肉基质分别采用1%(v/v)乙酸甲醇、1%(v/v)乙酸乙腈按1.3节进行提取及旋蒸浓缩。采用1%(v/v)乙酸甲醇提取液旋蒸至近干时，肉眼可见鸡心瓶壁上挂满油滴; 采用1%(v/v)乙酸乙腈提取液旋蒸至近干时，鸡心瓶壁未见油滴。采用1%(v/v)乙酸甲醇提取, 在1 μg/kg添加水平下五氯酚回收率低于50%, 定性定量离子色谱峰信噪比小于10;乙腈可以沉淀蛋白质, 共提取干扰物较甲醇少, 与水能分层, 便于后续净化。
五氯酚钠易溶于水, 加酸酸化至pH 6.6~6.8时全部析出为五氯酚[19], 分子态的五氯酚难溶于水, 溶于大多数有机溶剂, 结合五氯酚及其钠盐的理化性质, 采用1%(v/v)乙酸乙腈先均质或涡旋1 min, 使五氯酚钠转化为五氯酚, 然后进行酸解及超声提取。采用1%(v/v)乙酸乙腈溶剂还可降低提取液的pH值, 使五氯酚以分子形式析出, 提高其在乙腈中的分配率。
比较了均质(或涡旋)提取与超声提取的提取效率, 发现样品经均质或涡旋后再超声提取可明显提高提取率, 仅一次超声提取, 回收率低于55%, 而两次超声提取后回收率提高至65%以上。因此采用均质或涡旋后再超声提取两次的提取方式。
动物源食品相对于植物源食品、土壤而言, 具有高脂肪、高蛋白质含量等特点, 基质复杂, 在优化前处理条件时不仅需要考虑目标化合物的提取效率, 还要尽量提高对复杂基质中脂肪和蛋白质等杂质的去除率, 避免过高的基质效应。
常用的分散吸附剂有C18、PSA、石墨化炭黑(GCB)和Z-Sep+等[13-17, 20-23]。C18吸附剂在硅胶上键合了十八烷基官能团, 对非极性干扰物具有较好去除效果；PSA吸附剂在硅胶上键合了乙二胺-N-丙基官能团, 可吸附酸性化合物[13, 14, 23]; GCB能吸附具有平面结构的化合物; Z-Sep+即键合C18烷基链及二氧化锆的硅胶, 对脂肪具有较好的去除能力[20-22]。
本文选用猪肉基质, 以回收率和基质效应为指标考察了200 mg MgSO4结合其他4种分散吸附剂组合(①400 mg Z-Sep+、②200 mg C18+200 mg Z-Sep+、③300 mg C18+100 mg Z-Sep+、④400 mg C18)的净化效果。在2 μg/kg添加水平下, 按1.3节方法进行前处理, 分别采用以上4种分散吸附剂组合进行净化。测得的回收率结果分别为42.6%、46.8%、52.3%和72.4%, 可见随着Z-Sep+用量的增加, 五氯酚的回收率逐渐降低, 表明本文条件下Z-Sep+对五氯酚有吸附作用。采用C18净化, 回收率达到72.4%, 满足检测技术要求。
分别采用以上4种分散吸附剂组合净化的提取液, 按1.2节配制基质匹配标准溶液, 并配制相应的纯溶剂标准溶液, 绘制标准曲线, 按照以下公式计算基质效应(ME), ME=[(基质匹配标准曲线斜率/纯溶剂标准曲线斜率)-1]×100%。测得的基质效应结果分别为-30%、-36%、-32%和-13%, 采用Z-Sep+及Z-Sep+与C18混合物净化, 均表现为中等强度基质抑制效应[24]; 采用400 mg C18净化表现为弱基质抑制效应, 且净化效果最佳。
进一步优化C18的使用量, 发现当C18使用量为200 mg或300 mg时, ME值分别为-21%和-18%。因此确定采用400 mg C18和200 mg无水硫酸镁进行分散固相萃取净化。
在液相色谱-质谱分析中, 由共流出干扰物引起的基质效应会影响分析方法的灵敏度、精密度及准确度。降低基质效应的方法包括稀释样品溶液、增加净化步骤、优化色谱分离条件、采用同位素内标物、配制基质匹配标准溶液等[24]。本文对6种基质按1.2节描述配制基质匹配标准溶液, 测得的基质效应结果见表 1。可见除了猪肝表现为中等强度基质抑制效应(20%≤|ME|≤50%)[24]外, 其余5种样品均表现为弱基质效应(|ME|＜20%)。牛奶及鸡蛋较其他4种基质具有较高的水分含量, 因此显示较低的基质效应。本文通过优化净化方法及色谱分离条件降低基质效应, 采用基质匹配标准曲线补偿基质效应, 有效保证了定性、定量结果的准确性。
加标猪肝样品(1.0 μg/kg)的提取离子色谱图见图 2, 可见猪肝基质在定量限添加水平下, 目标化合物仍能获得较高响应值。
对猪肉、猪肝、鸡肉、鱼肉、牛奶、鸡蛋样品进行前处理, 按1.2节描述配制基质匹配校准溶液。结果表明, 在0.5~5.0 μg/L范围内6种基质中五氯酚的质量浓度(x, μg/L)与对应的峰面积(y)呈良好线性关系, 相关系数(r)为0.996 7~0.999 9(见表 1)。
在猪肉、猪肝、鸡肉、鱼肉、牛奶、鸡蛋样品中各添加1.0、2.0、10.0 μg/kg水平的五氯酚, 进行加标回收率试验, 每个添加水平重复测定6次。6种基质中五氯酚的加标回收率为73.2% ~108.4%, 相对标准偏差为4.0% ~14.8%(见表 1)。
以1.0 μg/kg加标样品定量离子对色谱信号的3倍信噪比(S/N)确定方法的检出限, 为0.1 μg/kg, 以S/N＞10确定方法的定量限, 为1.0 μg/kg, 符合相关法规要求[1, 2, 11]。
分别从超市购买猪肉、猪肝、鸡肉、鱼肉、牛奶、鸡蛋样品各2份, 按本文方法进行分析, 2份猪肝样品均检出微量五氯酚, 但含量均低于定量限, 其余样品均未检出五氯酚。
本工作建立了QuEChERS-UPLC-MS/MS测定动物源食品中痕量五氯酚及其钠盐的分析方法。该法操作简单, 环保, 快速准确, 技术指标满足残留分析及法规要求。
2018,
Vol. 36 Issue (6): 518-522
PDF
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