液相色谱-串联质谱法同时测定婴幼儿配方乳粉中全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、双酚A和壬基酚残留


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王浩, 邵明媛, 贾婧怡, 刘明艳, 裴帆

国家食品质量安全监督检验中心, 北京 100094

收稿日期：2018-07-27

基金项目：北京市科技计划项目（Z171100004417026）

通讯联系人：邵明媛, Tel:(010)82479391, E-mail:shaomingyuan163@163.com

摘要：建立了婴幼儿配方乳粉中全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、双酚A和壬基酚多残留的高效液相色谱-串联四极杆质谱联用测定方法。样品用水超声溶解，乙腈沉淀蛋白质，液相色谱-串联质谱测定，基质内标法定量。以Hypersil GOLD C₁₈色谱柱（50 mm×4.6 mm，1.9 μm）分离，流动相为30 mmol/L乙酸铵水溶液和甲醇，流速0.30 mL/min。在该优化条件下，全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、双酚A和壬基酚的定量限分别为0.5、1.0、10.0和5.0 μg/kg，方法回收率为86.1%~106.8%，相对标准偏差为2.87%~9.53%。测定了多种市售婴幼儿配方奶粉，表明该方法操作简单、测定结果准确，可用于婴幼儿配方奶粉中全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、双酚A和壬基酚多残留的同时快速测定。

关键词：液相色谱-串联质谱全氟辛酸全氟辛烷磺酸双酚A 壬基酚婴幼儿配方乳粉

Simultaneous determination of perfluoric acid, perfluorooctane sulfonic acid, bisphenol A, nonylphenol in infant milk powder by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

WANG Hao, SHAO Mingyuan, JIA Jingyi, LIU Mingyan, PEI Fan

China National Food & Safety Supervision and Inspection Center, Beijing 100094, China

Foundation item: Beijing Science and Technology Project (No. Z171100004417026)

Abstract: A rapid confirmative method was developed for determining the residues of perfluoric acid (PFOA), perfluorooctane sulfonic acid (PFOS), bisphenol A (BPA), and nonylphenol (NP) in infant milk powder by HPLC-MS/MS. The sample was dissolved in water by ultrasonication, and the protein was removed by dissolving in acetonitrile. The analytes were separated on a Hypersil GOLD C₁₈ column (150 mm×2.0 mm, 5 μm) using 30 mmol/L ammonium acetate solution and methanol as mobile phases, with gradient elution at a flow rate of 0.3 mL/min. Finally, the samples were determined by HPLC-MS/MS. Internal matrix-matched calibration was used for quantification. The limits of quantification (LOQs, S/N=10) of PFOA, PFOS, BPA, and NP were 0.5, 1.0, 10.0, and 5.0 μg/kg, respectively. The recoveries ranged from 86.1% to 106.8%, and the relative standard deviations (RSDs) were in the range from 2.87% to 9.53%. The method was also applied to real samples. The results showed that the method was simple and accurate, and can be used for determining the residues of PFOA, PFOS, BPA, and NP in infant milk powder.

Key words: high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) perfluoric acid (PFOA) perfluorooctane sulfonic acid (PFOS) bisphenol A (BPA) nonylphenol (NP) infant milk powder

婴幼儿配方乳粉是通过添加营养成分使其组成在数量上和质量上无限接近母乳的营养元素为目标的调制乳粉^[1]。婴幼儿配方乳粉消费比例逐年增加, 所以其安全问题备受关注。“大头娃娃”“三聚氰胺”等重大食品安全事件发生后, 我国大力加强了婴幼儿配方乳粉的监管力度。全氟辛酸(PFOA)、全氟辛烷磺酸(PFOS)是最常见的两种全氟化合物污染物, 具有疏油、疏水等特性, 被称为新型持久性有机污染物, 已被发现可分布在各类人体基质以及多个组织器官中, 对婴幼儿的生长、发育存在严重影响^[2]。双酚A(BPA)和壬基酚(NP)是常见的内分泌干扰物, 可通过食物链进入人体, 可导致性早熟、免疫力下降等, 对婴幼儿正常发育的影响尤为显著^{[3, 4]}。基于全氟化合物和内分泌干扰物等污染物对婴幼儿正常生长发育的危害性, 虽然目前国家还未制定相应的限量标准, 但相关监管部门已将其作为风险因子进行监测, 且规定了临时限量值。因此, 及时开发简便、快速、准确、灵敏度高的婴幼儿配方乳粉中全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、双酚A和壬基酚残留的检测方法势在必行。

目前, 测定全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、双酚A和壬基酚残留的方法主要有液相色谱-质谱法^[5-11]、液相色谱法^{[12, 13]}和气相色谱-质谱法等^{[14, 15]}。但检测乳粉中双酚A和壬基酚的前处理方法大都采用环己烷-乙酸乙酯提取或者乙腈直接提取, 这种方式往往只能提取乳粉颗粒表面的目标化合物, 乳粉内部的目标化合物不能得到释放, 同时经过阳性样品比较, 这种提取方式容易造成测定值偏低。此外, 目前尚未有检测婴配乳粉中全氟辛酸和全氟辛烷磺酸的报道。本研究采用超声辅助温水溶解样品, 乙腈沉淀蛋白质, 内标法定量, 高效液相色谱-串联质谱仪进行测定。本方法前处理简单, 灵敏度高, 适用于婴幼儿配方乳粉中全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、双酚A和壬基酚的同时快速检测。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

Agilent 6410型三重四极杆质谱仪, 配电喷雾离子源(Agilent公司); Agilent 1200型液相色谱仪(Agilent公司); GL-88B型涡旋混合器(海门市其林贝尔公司); KQ-5200型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司); Milli-Q去离子水发生器(Millipore公司)。

甲醇、乙腈、正己烷和乙酸铵均为色谱纯(德国Fisher公司); 全氟辛酸、¹³C₄-全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、1, 2, 3, 4-¹³C₄-全氟辛烷磺酸(纯度≥99%, 美国Sigma公司); 双酚A、双酚A-d⁴、壬基酚、3, 5, 3-壬基酚-¹³C₆(纯度≥98%, 德国Dr. Ehrenstorfer公司); 实验所选用样品为作者单位检验样品。

1.2 标准溶液的配制

标准储备液:分别称取适量的全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、双酚A和壬基酚标准品, 用甲醇配成0.1 g/L的标准储备液, 该溶液在-18 ℃保存, 有效期1年。

内标储备液:分别称取适量的¹³C₄-全氟辛酸、1, 2, 3, 4-¹³C₄-全氟辛烷磺酸、双酚A-d⁴和3, 5, 3-壬基酚-¹³C₆标准品, 用甲醇配成0.1 g/L的标准储备液, 该溶液在-18 ℃保存, 有效期1年。

中间浓度混合标准溶液:用甲醇将标准储备液配制成全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、双酚A和壬基酚的质量浓度分别为0.05、0.10、1.0和0.5 mg/L的中间浓度混合标准溶液, 该溶液在2~8 ℃保存, 有效期1个月。

中间浓度内标溶液:用甲醇将内标储备液配制成¹³C₄-全氟辛酸、1, 2, 3, 4-¹³C₄-全氟辛烷磺酸、双酚A-d⁴和3, 5, 3-壬基酚-¹³C₆质量浓度分别为0.10、0.10、1.0和1.0 mg/L的中间浓度标准溶液, 该溶液在2~8 ℃保存, 有效期1个月。

基质标准校准溶液:称取系列空白基质样品, 加入25 μL的中间浓度内标溶液, 再分别加入中间浓度混合标准溶液10、20、50、100、200 μL。其余处理同1.3节。

1.3 样品前处理

称取1.0 g样品(精确至0.01 g), 置于10 mL具塞比色管中, 依次加入中间质量浓度内标溶液25 μL和2 mL 60~70 ℃热水, 涡旋30 s后, 超声提取10 min, 再加入3 mL乙腈, 具塞振摇使蛋白质沉淀, 吸取1 mL上清液在4 ℃条件下15 000 r/min离心5 min，液相色谱-串联质谱仪测定。

1.4 仪器工作条件

色谱条件如下。色谱柱:Hypersil GOLD C₁₈ (50 mm×4.6 mm, 1.9 μm); 流速:0.30 mL/min; 柱温25 ℃; 进样量5 μL; 流动相:30 mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇(10:90, v/v)。

质谱条件如下。离子源:电喷雾离子(ESI)源; 扫描方式:负离子扫描; 检测方式:多反应监测; 干燥气:N₂; 雾化气压力:275.8 kPa; 干燥气温度:325 ℃; 干燥气流速:8 L/min; 汽化温度:340 ℃。

4种目标化合物及其内标的质谱参数如表 1所示。

表 1 全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、双酚A和壬基酚的质谱参数 Table 1 Mass spectrometric parameters of perfluoric acid (PFOA), perfluorooctane sulfonic acid (PFOS), bisphenol A (BPA), and nonylphenol (NP)

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的选择

乳粉基质复杂, 富含脂肪和蛋白质, 所以本方法在样品中先加入2 mL 60~70 ℃热水, 涡旋30 s, 使样品中目标化合物充分溶解, 再加入3 mL乙腈去除样品中蛋白质。因为壬基酚为环境污染物，很多溶剂(正己烷、乙酸乙酯等)、固相萃取柱、QuEChERS填料、各种滤膜都有壬基酚残留，所以不宜做除油处理，采用高速离心后直接进样。这种前处理方法简便快速, 既能充分提取样品中的全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、双酚A和壬基酚残留, 又能除去样品中的蛋白质和脂肪。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱

为了有利于色谱峰的分离及峰形的改善, 本方法分别采用资生堂MGⅢ-C₁₈色谱柱(150 mm×2.1 mm, 1.8 μm)、Hypersil GOLD C₁₈色谱柱(50 mm×4.6 mm, 1.9 μm)和Agilent Extend-C₁₈色谱柱(150 mm×2.1 mm, 5 μm)进行分离实验, 发现Hypersil GOLD C₁₈色谱柱(50 mm×4.6 mm, 1.9 μm)上的峰形及出峰时间较为合适, 所以选择Hypersil GOLD C₁₈色谱柱分离目标化合物。

2.2.2 流动相

分别比较了30 mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇、10 mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇、水-甲醇3种体系, 发现后两种体系中的全氟辛酸、全氟辛烷磺酸会出现不同程度的峰形展宽, 灵敏性降低。所以本实验选择流动相为30 mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇(10:90, v/v)。同时, 全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、双酚A和壬基酚极性相差较大, 首先考虑用梯度洗脱的方式实现目标化合物的有效分离。但是实验中发现梯度洗脱空白溶剂中出现双酚A和壬基酚假阳性情况, 然而等度洗脱时假阳性消失, 这很可能是液相系统在梯度洗脱中形成的假阳性情况, 因此采用等度洗脱方式。图 1为全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、双酚A和壬基酚混合标准溶液的MRM色谱图。

图 1 全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、双酚A和壬基酚混合标准溶液的MRM色谱图 Fig. 1 MRM chromatograms of the mixed standard solution of PFOA, PFOS, BPA, and NP

2.3 线性关系及方法检出限

最优条件下, 采用空白样品加内标法配制基质工作曲线, 消除测定中的基质效应, 同时又明显提高了定量的准确性。用基质标准校准溶液, 分别进样5 μL, 测定结果经线性回归(y为峰面积; x为质量浓度, μg/L)。同时用空白样品进行加标试验, 所得谱图信噪比大于3的空白基质添加量定为检出限, 信噪比大于10的空白基质添加量定为定量限。全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、双酚A和壬基酚的定量限分别为0.5、1.0、10.0和5.0 μg/kg，结果见表 2。

表 2 全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、双酚A和壬基酚的线性方程、线性范围、相关系数(R²)、方法定量限及检出限 Table 2 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients (R²), limits of quantification (LOQs) and limits of detection (LODs) of PFOA, PFOS, BPA and NP

2.4 方法的回收率和精密度

准确称取空白样品6份, 共3组, 分别加入目标化合物。其中第一组测试液添加水平为:全氟辛酸0.5 μg/kg, 全氟辛烷磺酸1.0 μg/kg, 双酚A 10.0 μg/kg, 壬基酚5.0 μg/kg; 第二组测试液添加水平为:全氟辛酸1.0 μg/kg, 全氟辛烷磺酸2.0 μg/kg, 双酚A 20.0 μg/kg, 壬基酚10.0 μg/kg; 第三组测试液添加水平为:全氟辛酸5.0 μg/kg, 全氟辛烷磺酸10.0 μg/kg, 双酚A 100.0 μg/kg, 壬基酚50.0 μg/kg。在最优条件下进行样品前处理, 结果见表 3。不同水平下平均加标回收率为86.1%~106.8%, 相对标准偏差为2.87%~9.53%(n=6)。

表 3 目标物在空白样品中的加标回收率与RSD(n=6) Table 3 Recoveries and RSDs of the analytes in spiked blank samples (n=6)

2.5 实际样品检测

采用所建立的方法对市场销售的50种婴幼儿营养乳粉进行检测, 其中49个样品检出壬基酚(含量范围为14.7~373 μg/kg, 检出率98.0%), 6个样品检出全氟辛酸(含量范围为0.51~1.34 μg/kg, 检出率12.0%), 4个样品检出全氟辛烷磺酸(含量范围为1.06~7.79 μg/kg, 检出率8.0%), 双酚A未检出。其中一个阳性样品色谱图如图 2所示。上述结果表明, 婴幼儿营养乳粉中壬基酚残留比较严重, 同时也存在全氟辛酸和全氟辛烷磺酸残留。

图 2 含全氟辛烷磺酸和壬基酚的阳性样品的MRM色谱图 Fig. 2 MRM chromatograms of a positive sample containing PFOA and NP

3 结论

本研究建立了同时测定婴幼儿配方乳粉中全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、双酚A和壬基酚残留的液相色谱-串联质谱方法。本方法的样品前处理简单, 灵敏度高, 定量限及精密度均能满足残留检测要求, 能为我国婴幼儿配方乳粉中全氟辛酸、全氟辛烷磺酸、双酚A和壬基酚残留的监管与监督提供技术支撑。

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