色谱  2018, Vol. 36 Issue (12): 1228-1237   PDF    
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张蓉
刘鑫
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代莹
李莎莎
高志贤
改良QuEChERS结合超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法快速检测茶叶中95种除草剂残留
张蓉1,2, 刘鑫1, 彭媛2, 刘韦华1, 张立承1, 代莹1, 李莎莎1, 高志贤2     
1. 中华人民共和国北京海关, 北京 100026;
2. 天津环境医学与作业医学研究所, 天津 300050
收稿日期：2018-08-20
基金项目：国家质量监督检验检疫总局科技计划项目（2016IK027）
通讯联系人：张蓉, Tel:(010)58619210, E-mail:15301090205@189.cn; 高志贤, Tel:(022)8465519l, E-mail:gaozhx@163.com
摘要：基于改良的QuEChERS方法，建立了超高效液相色谱-高分辨质谱同时测定茶叶中95种常见除草剂残留量的定性定量方法。实验以回收率和色素清除效率为指标，通过评估多壁碳纳米管（MWCNTs）、石墨化炭黑（GCB）、N-丙基乙二胺（PSA）和甲苯等在前处理步骤中的影响，优化了经典QuEChERS方法，最终采用含1%（v/v）乙酸的乙腈-甲苯（9：1，v/v）溶液提取，结合12.5 mg GCB、12.5 mg MWCNTs和150 mg PSA混合吸附剂净化的前处理方法。采用Hypersil Gold C18色谱柱分离，在全扫描和自动触发二级质谱（Full MS/dd-MS2）模式下，用四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱检测，基质匹配校准曲线定量。结果表明，茶叶中95种除草剂在3个加标水平下的回收率为63.3%~129.1%，相对标准偏差（RSD）为0.7%~15.2%。该法简便、灵敏、快速、假阳性率低，适用于茶叶等复杂植物基质样品中多种除草剂的定性定量分析。
关键词：超高效液相色谱    四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱    改良QuEChERS    多壁碳纳米管    除草剂    茶叶    
Rapid determination of 95 herbicide residues in tea by modified QuEChERS coupled with ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry
ZHANG Rong1,2, LIU Xin1, PENG Yuan2, LIU Weihua1, ZHANG Licheng1, DAI Ying1, LI Shasha1, GAO Zhixian2     
1. Beijing Customs District P. R. China, Beijing 100026, China;
2. Tianjin Institute of Environmental and Operational Medicine, Tianjin 300050, China
Foundation item: General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People's Republic of China (No. 2016IK027)
Abstract: A qualitative and quantitative method was established based on modified QuEChERS for the simultaneous determination of 95 herbicide residues in tea using ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry (UHPLC-Q-Orbitrap HRMS). The effects of multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs), graphitized carbon black (GCB), primary secondary amine (PSA) and toluene on the precondition step were evaluated in terms of matrix-spiked recovery and pigment clean-up effect. Finally, the modified QuEChERS method was applied, which involved sample extraction with an acetonitrile-toluene (9:1, v/v) mixture containing 1% (v/v) acetic acid, followed by cleaning with 12.5 mg GCB, 12.5 mg MWCNTs and 150 mg PSA. The sample extract was separated on a Hypersil Gold C18 column and analyzed in full scan/data-dependent MS2(Full MS/dd-MS2) mode. The target herbicides were quantified by using the matrix-matched standard calibration. The three-level spiked recoveries were between 63.3% and 129.1% with the precision of 0.7%-15.2%. This method is easy, sensitive and rapid and can be applicable to the determination of trace herbicide residues in tea and other plant-derived complex matrix samples.
Key words: ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC)     quadrupole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry (Q-Orbitrap HRMS)     modified QuEChERS     multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs)     herbicides     tea    

中国以历史悠久的茶文化闻名世界, 茶叶的种植与加工是我国农业生产的重要领域之一, 在茶园中杂草与茶树争夺养分和生存空间, 造成茶树减产和品质下降, 研究表明成年茶园秋季杂草可达94种、分属41科81属[1], 而化学除草、生物除草、人工除草、茶园铺草等是目前常用的几种除杂草措施[2], 其中化学除草剂以其成本低、防治效果好而成为防治杂草的主要方法。由于杂草的多样性, 针对茶园杂草的品种, 选择多种除草剂进行轮换施药及综合防治是较为通行的办法[3], 但也会造成除草剂在土壤、水源和农作物中的残留。研究表明, 三嗪类除草剂可能引起新生儿缺陷、患癌和内分泌干扰[4], 莠去津[5]、甲草胺[6]、乙草胺[7]更被明确报道具有毒性，可干扰人类的内分泌系统。因此, 茶叶中多种除草剂的同时检测对保障茶叶饮用安全具有重要意义。

目前, 实验室中农药多残留检测可采用气相色谱法(GC)[8]、液相色谱法(LC)[9]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[10, 11]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[12, 13]和气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)[14, 15]等, 气相色谱法和液相色谱法由于待测物必须与检测器的选择性相适应，很难完成多种不同化学结构农药的同时检测。因此色谱-质谱联用法成为农药多残留检测的主流方法。高分辨质谱通过精确的相对分子质量对目标化合物进行定性定量检测, 可降低复杂样品基质检测中的假阳性风险, 近几年被广泛用于农药多残留分析领域中。同时, 高分辨质谱的高扫描速度和灵敏度也保证了多种痕量农药残留在复杂基质中的同时检出[16, 17]。

经典QuEChERS法主要应用于蔬菜、水果等含水量多、基质干扰少的基质[18, 19], 对于茶叶等复杂基质的前处理净化效果较差, 应用石墨化炭黑(GCB)吸附色素又会降低平面结构化合物的回收率。近年来多壁碳纳米管(MWCNTs)被引入农残检测前处理中, 并展现出优异特性[20-24]。

本文以绿茶、红茶等常见茶叶为样品基质, 采用改良的QuEChERS前处理技术净化样品, 结合超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱(UHPLC-Q-Orbitrap HRMS), 建立了快速、准确检测茶叶中95种常见除草剂残留的定性定量分析方法。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

超高效液相色谱仪Ultimate 3000 RSLC、四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪Q Exactive Orbitrap和Xcalibur工作站(美国Thermo Scientific公司); 分析天平SQP(德国Sartorius公司, 感量10 mg)和XPE205DR(瑞士Mettler Toledo公司, 感量0.01 mg); 离心机Universal 320R(德国Hettich公司)和Sigma 1-14(德国Sartorius公司); 超声波清洗器Sonorex Digitec(德国Bandelin公司); 氮吹仪DTU-2BN(日本Taitec公司); 移液器(德国Eppendorf公司); Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司); 旋涡混匀器MS 3 Digital(德国IKA公司)。

乙腈、甲醇、甲苯、醋酸铵(色谱纯)购自美国Thermo Scientific公司; 甲酸(色谱纯)购自北京迈瑞达科技有限公司; 冰乙酸(色谱纯)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 无水乙酸钠(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司; 无水硫酸镁(分析纯)购自北京化学试剂公司。95种农药标准品购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。

QuEChERS吸附剂:GCB(100~400目, 德国CNW公司); N-丙基乙二胺(PSA, 40~60 μm, 天津博纳艾杰尔科技有限公司); MWCNTs(20~40 nm, 纯度＞90%, 北京博宇高科新材料技术有限公司)。

1.2 标准溶液的配制

分别称取标准品约10 mg, 用甲苯定容至10 mL, 配制成单一标准储备液, 再用乙腈配制成适量浓度的混合标准溶液(具体浓度见表 1), 于4 ℃冰箱保存。

表 1 95种除草剂的母离子、保留时间及其在混合标准溶液中的含量 Table 1 Precursor ions, retention times and contents of the 95 herbicides in mixed standard solution

准确吸取混合标准溶液0.5、2.5、5.0、10.0和25.0 μL, 用空白基质提取液定容至1 mL, 得到相应浓度的基质匹配标准工作曲线, 现用现配。

1.3 样品前处理

称取粉碎后的茶叶样品5.0 g, 置于50 mL离心管中, 加入10 mL含1%(v/v)乙酸的乙腈-甲苯(9 : 1, v/v)溶液、1.5 g无水乙酸钠和3.0 g无水硫酸镁, 混匀, 超声提取10 min, 以6 000 r/min离心10 min, 取上清液1 mL, 转移至含150 mg无水硫酸镁、150 mg PSA、12.5 mg MWCNTs和12.5 mg GCB的净化管中, 剧烈振摇1 min, 以10 000 r/min离心10 min, 用0.2 μm针筒式过滤器过滤, 待上机测定。

1.4 分析条件

色谱柱:Hypersil Gold C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm); 柱温:45 ℃; 样品室温度:5 ℃; 流动相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液(含4 mmol/L乙酸铵); 流动相B: 0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液(含4 mmol/L乙酸铵); 流速:0.3 mL/min。梯度洗脱程序:0~8.0 min, 12%B~95%B; 8.0~9.0 min, 95%B~100%B; 9.0~11.0 min, 100%B; 11.0~11.1 min, 100%B~12%B; 11.1~14.0 min, 12%B。进样量10 μL。

鞘气流速:4.55 L/min (35 arb); 辅助气流速:3 L/min (10 arb); 反吹气流速:0 L/min (0 arb); 喷雾电压:3.50 kV; 毛细管温度:320 ℃; 管状透镜电压:50.0 V; 辅助气加热温度:350 ℃; 运行时间:14 min; 极性模式:正/负; 包含模式:开。全扫描参数:分辨率, 70 000;自动增益控制目标离子数(AGC target), 1×106; 最大离子注入时间(maximum IT), 250 ms; 扫描范围, m/z 100~700。数据依赖二级质谱扫描参数(data-dependent MS2, dd-MS2):分辨率, 35 000;自动增益控制目标离子数, 2×105; 最大离子注入时间, 120 ms; 循环次数(loop count), 5;隔离宽度(isolation width), m/z 4.0;归一化碰撞能量(NCE), 20、40和60。95种除草剂质谱扫描的母离子信息见表 1。

2 结果与讨论
2.1 液相色谱条件的优化

参考Wang等[17]的方法, 优化了液相色谱条件。在1.4节色谱条件下, 95种除草剂在4~10 min内分布均匀, 以保留时间较前、居中和较后的二丙烯草胺、快敌蜱、稗草畏为例, 其一级全扫描色谱峰峰形对称, 有利于定量分析(见图 1)。

图 1 (a) 二丙烯草胺、(b)快敌蜱、(c)稗草畏(0.1 mg/L)的提取离子色谱图 Fig. 1 Extracted ion chromatograms of (a) allidochlor, (b) propyzamide and (c) pyributicarb (0.1 mg/L)
2.2 质谱条件的优化

对每种除草剂的单一标准溶液进行分析，并采用全扫描和自动触发二级质谱(Full MS/dd-MS2)模式, 得到每种化合物的母离子提取离子色谱图和二级碎裂质谱图, 选取色谱峰顶端扫描点的质量数作为母离子实际质量数, 选择至少2个具有代表性的二级离子作为定性离子。

结果发现, 扫描时一些信号较低或是母离子和保留时间都相近的化合物的二级质谱信号响应较低。分析原因可能是化合物自身母离子裂解较弱, 或是母离子质荷比相近的化合物相互影响了二级裂解的效果。

为提高质谱扫描效率, 将所有待测化合物的母离子精确质量数输入包含列表(inclusion list), 并将其保留时间±1.5 min区间作为扫描时间段, 使质谱有针对性的扫描和裂解, 从而提高化合物二级质谱信号的强度。以0.01 mg/L的非草隆为例(见图 2), 其母离子(m/z 165.102 24)提取离子色谱图的信号在“不开启包含列表(nolist)”、“开启包含列表(list)”和“开启包含列表并限定离子扫描时间范围(list+rt)”3种模式下强度相当, 但是采用了“list+rt”模式的二级质谱信号强度是“nolist”模式下的2倍, 且杂峰明显较低。

图 2 3种扫描模式下非草隆(10 μg/L)的提取离子色谱图和产物离子质谱图 Fig. 2 Extracted ion chromatograms and product ion mass spectra of fenuron (10 μg/L) in three scan mode

又如草乃敌与异恶草松, 二者母离子的m/z接近, 保留时间均为7.5 min, 采用“list+rt”扫描方式时, 二级质谱的响应信号提高了5倍(见图 3)。

图 3 3种扫描模式下草乃敌与异恶草松产物离子的质谱图 Fig. 3 Product ion mass spectra of diphenamid and clomazone in three scan modes rt: retention time.

实验发现, 当目标化合物浓度较低、信号较弱时, 保留时间和母离子质荷比相近的化合物会彼此干扰二级裂解, 因此, 通过启用包含列表, 缩小扫描范围, 可以使目标化合物在现有条件下得到尽可能多的数据点, 并产生足够触发二级裂解的母离子丰度, 从而得到更准确的定性定量结果, 避免假阴性结果的产生。

2.3 QuEChERS前处理条件的优化

MWCNTs是一种新型的纳米材料, 具有独特的理化性能和较大的比表面积, 由于MWCNTs呈管状结构, 在吸附特性上与传统的GCB吸附剂具有一定的差异, 本方法在AOAC 2007.01方法的基础上考察了MWCNTs与GCB的加入对净化效果及回收率的影响。同时，考虑到GCB对平面化合物回收率的影响, 在酸化乙腈中加入了少量甲苯。为提高方法的验证效率, 设计了三因素三水平正交试验(见表 2), 根据碳吸附剂的不同进行3组三水平正交实验, 在3组试验中碳吸附剂分别为GCB、MWCNTs和GCB-MWCNTs(1 : 1, 质量比)。以95个农药加标回收率在80% ~120%之间的农药个数来衡量实验结果, 3组实验的结果基本相同, 采用组合2、3、4、5、7进行前处理时, 有60多种农药具有较好的回收率; 净化后组合6、8、9的净化液完全无色, 而组合4、5、7的净化液呈淡黄色。综合考虑回收率、色素清除效果等因素, 最终选定组合5(12.5 mg GCB、12.5 mg MWCNTs、150 mg PSA、乙腈-甲苯(9 : 1, v/v))作为最终的前处理条件。由表 2对比极差(R)发现, 对回收率影响的顺序为甲苯比例＞碳吸附剂使用量＞PSA使用量, 甲苯的加入降低了含有苯环等平面结构的化合物在碳吸附剂上的吸附, 从而显著提高了回收率。

表 2 三水平正交实验 Table 2 Three level orthogonal experiment

实验还对比了添加10 mL水浸润后提取和直接提取两种模式对净化效果的影响。结果发现, 前者净化后, 提取液颜色明显较后者深, 但是二者的回收率没有明显差异。因此直接用提取液进行提取后净化上机。

2.4 线性范围、回收率和精密度

为消除基质效应, 本实验采用阴性样品基质(绿茶)提取液配制基质匹配标准溶液, 并对其进行分析, 以各除草剂的质量浓度(X, μg/L)和对应的峰面积(Y)绘制基质匹配标准曲线, 得到的线性方程和相关系数(r)见表 3。结果表明, 在5~250 μg/L线性范围内, 95种除草剂线性关系良好, 相关系数均大于0.99, 能够满足分析要求。

表 3 95种除草剂的线性方程、相关系数、加标回收率和相对标准偏差(n=6) Table 3 Linear equations, correlation coefficients (r), spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the 95 herbicides (n=6)

对绿茶样品进行3个水平添加标回收试验, 结果表明, 95种除草剂平均回收率为63.3% ~129.1%, 相对标准偏差(RSD)为0.7% ~15.2%, 能够满足分析要求。

2.5 实际样品检测

在市场上采购绿茶10份、茉莉花茶10份、乌龙茶10份、铁观音10份, 经本方法进行筛查, 检出11个样品含有地乐酚, 含量为26.2~44.0 μg/kg。将实际样品中地乐酚的二级质谱图与标准品中地乐酚的二级质谱图进行对比(见图 4), 可以看出, 实际样品中地乐酚母离子的m/z为239.066 62, 两个主要子离子的m/z为194.045 09和207.040 37, 均与标准品相应离子吻合, 且质量偏差在5×10-6内。经与《茶叶中448种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-质谱法》标准方法(GB 23200.13-2016)对比, 本方法定量结果的精密度小于10%, 说明该方法准确性满足定量检测要求。

图 4 (a) 茶叶样品和(b)标准品中地乐酚的产物离子质谱图 Fig. 4 Product ion mass spectra of dinoseb in (a) a tea sample and(b) a standard sample
3 结论

本方法根据茶叶基质的特点, 结合多壁碳纳米管，对QuEChERS前处理方法进行了改良, 并依托高分辨质谱建立了常见95种除草剂的定性定量检测方法。该方法操作简便, 节省溶剂, 定性定量准确, 适用于茶叶等复杂样品基质中多种除草剂的高通量同时检测。

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