高效液相色谱-串联质谱法分析毛发中甲基苯丙胺和苯丙胺手性对映异构体


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	张颖怡

	李良

	邢旭琴

	周政政

	马安德

张颖怡¹, 李良², 邢旭琴¹, 周政政¹, 马安德¹

1. 南方医科大学公共卫生学院卫生检验检疫系, 广东广州 510515;
2. 中山大学中山医学院法医学系, 广东广州 510080

收稿日期：2018-08-27

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81501629）；广东省自然科学基金资助项目（2017A030310051）

通讯联系人：马安德, Tel:(020)61648562, E-mail:mandmy@smu.edu.cn

摘要：建立了高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）分析毛发中甲基苯丙胺与苯丙胺对映异构体的手性分离方法。采用SUPELCO Astec CHIROBIOTIC^® V2手性液相色谱柱，以甲醇-含0.1%（v/v）甲酸的20 mmol/L乙酸铵水溶液（99：1，v/v）为流动相进行手性分离。结果表明，甲醇高温水浴超声法能较好地提取苯丙胺类化合物，且峰形较好（拖尾因子>0.95）。S-（+）-甲基苯丙胺、R-（-）-甲基苯丙胺、S-（+）-苯丙胺和R-（-）-苯丙胺在15~300 ng/mg范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99；甲基苯丙胺和苯丙胺的检出限分别为0.1 ng/mg和0.15 ng/mg，定量限分别为0.4 ng/mg和0.5 ng/mg；日内精密度均≤6.8%，日间精密度均≤11.4%。采用所建方法对50余嫌疑人毛发进行手性分析，检出单一S-（+）-甲基苯丙胺和S-（+）-苯丙胺的占70%，同时检出S-（+）-甲基苯丙胺、R-（-）-甲基苯丙胺、S-（+）-苯丙胺和R-（-）-苯丙胺的占18%。该法简单快速，精密度好，可为实际法医毒物鉴定案例中的毛发手性分析提供技术支持与科学依据。

关键词：高效液相色谱-串联质谱对映异构体甲基苯丙胺苯丙胺毛发

Analysis of methamphetamine and amphetamine chiral enantiomers in hair by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

ZHANG Yingyi¹, LI Liang², XING Xuqin¹, ZHOU Zhengzheng¹, MA Ande¹

1. Department of Hygiene Inspection & Quarantine Science, School of Public Health, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China;
2. Faculty of Forensic Medicine, Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 81501629); National Natural Science Foundation of Guangdong, China (No. 2017A030310051)

Abstract: A chiral separation method was developed for the analysis of methamphetamine (METH) and amphetamine (AM) in hair by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). The samples were extracted using methanol by ultrasonication in a high-temperature water bath. The chromatographic separation was performed on a SUPELCO Astec CHIROIOTIC^® V2 column with the mobile phase of methanol-20 mmol/L ammonium acetate aqueous solution containing 0.1% (v/v) formic acid (99:1, v/v). All the compounds showed linear relationship in the range of 15-300 ng/mg (r>0.99). The limits of detection (LODs) of METH and AM were 0.1 ng/mg and 0.15 ng/mg, respectively. The limits of quantification (LOQs) of METH and AM were 0.4 ng/mg and 0.5 ng/mg, respectively. The inter-day precisions were all ≤ 6.8%, and the intra-day precisions were all ≤ 11.4%. Fifty drug abuse samples were determined by this method. Up to 70% of the cases were determined as S-(+)-METH and S-(+)-AM, while 18% of the cases were S-(+)-METH, S-(+)-AM, R-(-)-METH and R-(-)-AM. The proposed method is rapid, simple, and provides technical support and a scientific basis for the chiral analysis in actual hair samples for forensic toxicant identification.

Key words: high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) enantiomers methamphetamine (METH) amphetamine (AM) hair

甲基苯丙胺(methamphetamine, METH)属于苯丙胺(amphetamine, AM)类兴奋剂, 其盐酸盐又名“冰毒”, 有着强烈的致幻作用及成瘾性, 是我国管制类精神物质。从化学结构看(见图 1), METH等苯丙胺类物质的结构中含有一个不对称的手性中心^[1], 具有两个对映异构体, 分别为S-(+)-METH和R-(-)-METH, 其对中枢神经系统的作用、毒性及代谢机制均有较大差异^[2], S-(+)-METH是“冰毒”的主要成分, 而R-(-)-METH多用于医疗^[3]。(±)-METH即为等物质的量的S-(+)-METH和R-(-)-METH混合而成。同时, AM作为METH的代谢产物, 常与METH同时出现, 因此对于METH和AM手性对映异构体的区分显得尤为重要。

图 1 甲基苯丙胺的化学结构式 Fig. 1 Chemical structure of methamphetamine (METH) * Chiral carbon atom.

随着新型毒品的合成方式及原料获取趋于简单, METH的滥用现象仍不断出现。METH可以在多种生物检材中被检出, 如尿液及血液, 但这两种生物检材的检测窗口期较短, 并存在易污染、难以采集与保存的弊端^{[4, 5]}。毛发作为一个稳定、易采集与保存的生物样本, 其检测窗口期可以显著延长, 同时可以长时间稳定保存毒品信息。因此, 毛发中毒品的检测也可以作为认定吸毒成瘾的依据^{[6, 7]}, 但毛发作为固体介质, 提取方法不同于血液、尿液等生物检材^[8-13]。目前已有对METH对映异构体的研究报道^[14-17]。早期, METH对映异构体的分离主要依靠衍生化^{[16, 17]}, 但该法耗时较长且较为复杂, 而采用直接法, 利用手性固定相则可以简化前处理过程^{[18, 19]}。Wang等^[15]利用手性固定相与液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)对毛发中METH和AM进行了分析, 但未对毛发前处理方法进行深入探讨。

本实验考察了不同前处理方法对毛发中甲基苯丙胺与苯丙胺对映异构体回收率的影响, 并在此基础上优化了HPLC-MS/MS方法, 最终用于实际司法鉴定案例的分析。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

LC-20AD XR高效液相色谱仪(日本岛津公司); API 4000三重四极杆质谱仪(美国AB公司)。

S-(+)-AM、R-(-)-AM、(±)-AM、S-(+)-METH、R-(-)-METH、(±)-METH(1 mg/mL, 溶于甲醇溶液, 美国Cerilliant公司); 盐酸普罗地芬(proadifen hydrochloride, 纯度＞95%)、乙酸铵(色谱纯)(美国Aladdin公司); 4-苯基丁胺(纯度98%, 日本TCI公司); 甲醇(色谱纯, 美国Merck公司); 甲酸(色谱纯, 天津市科密欧化学试剂有限公司); 盐酸、乙醚、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠(广州化学试剂厂)。实验用水为Milli-Q纯水仪(美国Millipore公司)制备。所有流动相均用0.22 μm微孔滤膜过滤。

1.2 溶液的配制

各取1 mg/mL标准品, 用甲醇稀释, 配制1 μg/mL的标准储备液, 于-20 ℃冰箱保存; 临用时用甲醇稀释, 配制合适浓度的混合标准工作液; 用甲醇将(±)-METH和(±)-AM标准储备液稀释为500 ng/mL的混合标准溶液, 在制作空白毛发加标样本时作为加标溶液使用。

1.3 毛发的清洗及研磨

采用二氯甲烷、水、丙酮各约50 mL对毛发样品依次振荡清洗一次, 于室温下晾干, 然后采用2.5 mm钢珠与毛发高速涡旋研磨, 最后将毛发分成每份约20 mg, 待检。

1.4 样品前处理

1.4.1 酸水解法

取约20 mg经1.3节处理过的毛发, 加入1 mL 0.1 mol/L盐酸溶液(pH 1.0)或磷酸缓冲液(pH 5.0), 于55 ℃水浴水解12 h, 加入盐酸水解12 h后, 需用10%(v/v)氢氧化钠溶液调节pH值, 使其大于11。水解液用3 mL乙醚提取, 涡旋1 min, 以13 000 r/min离心10 min, 取有机层, 于60 ℃水浴挥干, 残余物中加入200 μL甲醇复溶, 取5 μL进样分析。

1.4.2 碱水解法

取约20 mg经1.3节处理过的毛发, 加入1 mL 100 g/kg氢氧化钠溶液, 于80 ℃水浴水解5 min(或60 ℃水浴水解10 min); 或加入1 mL 50 g/kg氢氧化钠溶液, 于70 ℃水浴水解20 min。水解液用3 mL乙醚提取, 其他操作同1.4.1节。

1.4.3 甲醇高温水浴超声法

取约20 mg经1.3节处理过的毛发, 加入1 mL甲醇, 于70 ℃水浴超声30 min, 以13 000 r/min离心10 min, 用0.22 μm微孔滤膜过滤, 氮气吹干, 残余物中加入200 μL甲醇复溶, 取5 μL进样分析。

1.5 空白毛发的加标方式

实验采用未吸毒人员的毛发作为空白毛发。将配制好的500 ng/mL (±)-METH和(±)-AM混合标准溶液直接加入研磨后的毛发样品中, 混匀平衡48 h后, 氮气吹干, 再进行前处理。最终加标毛发样品的加标量为100 ng/mg。

1.6 分析条件

色谱柱为SUPELCO Astec CHIROBIOTIC^® V2手性液相色谱柱(250 mm×2.1 mm, 5 μm); 柱温为25 ℃; 流动相为甲醇-含0.1%(v/v)甲酸的20 mmol/L乙酸铵水溶液(99:1, v/v); 流速为0.4 mL/min; 进样量为5 μL。

离子源为电喷雾电离(ESI)源, 正离子模式; 检测模式为多反应监测模式; 离子源温度为600 ℃; 电喷雾电压为5 500 V; 辅助气1(gas 1)和辅助气2(gas 2)压力为379 kPa和448 kPa。目标化合物的具体质谱参数见表 1。

表 1 S-(+)-AM、R-(-)-AM、S-(+)-METH、R-(-)-METH的保留时间和质谱参数 Table 1 Retention times and MS parameters of S-(+)-amphetamine (S-(+)-AM), R-(-)-AM, S-(+)-METH and R-(-)-METH

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

实验初始使用DAICEL CHIRALPAK^® IA-3手性色谱柱, 发现该色谱柱对苯丙胺类对映异构体选择性较差, 无法实现分离。然后采用SUPELCO Astec CHIROBIOTIC^® V2手性色谱柱, 该色谱柱的填料含有万古霉素, 对胺类化合物立体选择性较好, 故选为实验所用。

本实验考察采用不同有机相和水相时目标化合物的分离效果(见图 2)。使用乙腈作为有机相、含0.2%(v/v)冰醋酸的0.05%(v/v)氨水作为水相时, METH和AM的手性对映异构体始终无法分离(显示为单峰), 而将有机相更换为甲醇时, METH与AM的手性对映异构体可实现初步分离, 且甲醇对目标化合物具有更好的分离选择性, 因此将甲醇确定为有机相。开始使用一元流动相, 向甲醇内添加不同的酸、碱溶液, 并尝试改变甲醇内添加剂的类型和比例, 但均未能获得较好分离。然后改用二元流动相进行分离, 并比较了0.05%(v/v)氨水(含0.2%(v/v)冰醋酸)与20 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)作为水相时的分离效果, 发现使用后者时METH与AM的手性对映异构体分离效果较为稳定(分离度分别为1.52和1.61), 峰形较好, 响应高, 而在前面两种流动相下, METH和AM的手性对映异构体分离不稳定且峰形较差(分离度分别为0.98和1.12)。

图 2 采用不同流动相时目标化合物的总离子色谱图 Fig. 2 Total ion chromatograms of the target compounds using different mobile phases a. acetonitrile-0.05% (v/v) ammonium hydroxide containing 0.2% (v/v) acetic acid; b. methanol containing 0.2% (v/v) acetic acid and 0.05% (v/v) ammonium hydroxide; c. methanol-0.05% (v/v) ammonium hydroxide containing 0.2% (v/v) acetic acid; d. methanol-20 mmol/L ammonium acetate solution containing 0.1% (v/v) formic acid (95:5, v/v); e. methanol-20 mmol/L ammonium acetate solution containing 0.1% (v/v) formic acid (99:1, v/v).
Peak identifications: 1. S-(+)-AM (m/z 136.1/91.2); 2. R-(-)-AM (m/z 136.1/91.2); 3. S-(+)-METH (m/z 150.1/91.1); 4. R-(-)-METH (m/z 150.1/91.1).

确定了有机相与水相后, 对两相的比例进行了考察。研究发现, 随着水相比例的提高, 出峰时间逐渐缩短, 但分离效果变差, 因此实验最终确定有机相和水相的体积比为99:1。该方法在12 min内实现METH和AM对映异构体的手性分离。

2.2 内标的选择

本实验考察了4-苯基丁胺和盐酸普罗地芬两种物质作为内标时的效果(见图 3)。4-苯基丁胺常作为研究苯丙胺类物质时的内标, 但在本实验条件下4-苯基丁胺的峰形不佳, 且因其离子对(m/z 150.1/91.0)与甲基苯丙胺的离子对(m/z 150.1/91.1)互相影响, 在该条件下色谱图出现了多重峰, 为4-苯基丁胺与(±)-甲基苯丙胺合并的峰(见图 3a), 且经多次调整仍无法分离, 并不适合本方法。

图 3 不同内标与(±)-METH(100 μg/L)的总离子色谱图 Fig. 3 Total ion chromatograms of (±)-METH (100 μg/L) and different internal standards a. 4-phenylbutylamine (100 μg/L); b. proadifen hydrochloride (100 μg/L).
Peak identifications: 1. 4-phenylbutylamine (m/z 150.1/91.0); 2. S-(+)-METH (m/z 150.1/91.1); 3. R-(-)-METH (m/z 150.1/91.1); 4. proadifen hydrochloride (m/z 354.7/209.3).

实验考察的盐酸普罗地芬常作为毒药物研究时的内标, 由图 3b可知, 盐酸普罗地芬在该条件下峰形良好, 始终能够保持尖锐的峰, 保留时间稳定, 且与甲基苯丙胺一同考察时可实现分离, 因此本实验选用盐酸普罗地芬作为内标物质。

2.3 提取方法的考察

苯丙胺类物质可通过多种途径进入毛发。因此, 为能够最大限度地提取毛发中的毒物, 同时减少损耗并不破坏对映异构体的结构, 提取方法显得尤为重要。本实验采用酸水解、碱水解及甲醇高温水浴超声法对加标样品中不同构型的化合物进行定量, 并通过计算加标回收率和考察对映异构体的峰形衡量不同前处理方法的优劣。

由图 4可知, 盐酸普罗地芬和AM在各提取方法中峰形相对稳定, 但是METH受提取方法的影响较大。其中, 采用酸水解法和甲醇高温水浴超声法时(±)-甲基苯丙胺的峰形较好, 拖尾因子＞0.95。然而, 在进行碱水解后, (±)-甲基苯丙胺的峰形较差, 与其他方法差异较大, 可能原因是在该条件下METH手性结构被破坏; 部分已与水解液发生反应或在水解过程中被消解。

图 4 不同提取方法下(±)-METH、(±)-AM和内标的总离子流色谱图 Fig. 4 Total ion chromatograms of (±)-METH, (±)-AM and IS by different extraction methods a. 0.1 mol/L hydrochloric acid (pH 1.0); b. 0.1 mol/L phosphate buffer (pH 5.0); c. 100 g/kg sodium hydroxide, 80 ℃, 5 min; d. 100 g/kg sodium hydroxide, 60 ℃, 10 min; e: 50 g/kg sodium hydroxide, 70 ℃, 20 min; f. methanol, 70 ℃, 30 min, ultrasound.
Peak identifications: 1. proadifen hydrochloride (m/z 354.7/209.3); 2. S-(+)-AM (m/z 136.1/91.2); 3. R-(-)-AM (m/z 136.1/91.2); 4. S-(+)-METH (m/z 150.1/91.1); 5. R-(-)-METH (m/z 150.1/91.1).

实验采用的空白毛发为未吸毒人员的毛发, 无背景值(低于检出限)。由图 5可知, 采用甲醇高温水浴超声法时(±)-甲基苯丙胺和(±)-苯丙胺的加标回收率最好, 该法也是耗时最短、操作最为便捷的提取方法。实验还对比了常温超声与高温超声提取的提取效果。结果表明, 如要达到相同的提取率, 常温提取至少需要超声1 h, 耗时较长, 效率较低。随着超声温度的升高, 提取效率也得到提高, 但当水浴温度超过70 ℃或者温度大于50 ℃、超声时间超过30 min, 甲醇会较快发生沸腾, 且较为剧烈, 并发生溢出现象, 因此水浴温度设为70 ℃。

图 5 不同提取方法下目标化合物的加标回收率 Fig. 5 Spiked recoveries of the target compounds by different extraction methods a-f were the same as that in Fig. 4.

2.4 方法学评价

2.4.1 标准曲线、检出限(LOD)及定量限(LOQ)

对加标的空白毛发进行分析, 以苯丙胺类化合物的峰面积(y)对其含量(x, ng/mg)进行线性回归, 结果表明, 4种物质在15~300 ng/mg线性范围内线性关系良好(见表 2)。

表 2 目标化合物的线性方程、相关系数(r)、检出限和定量限 Table 2 Linear equations, correlation coefficients (r), LODs and LOQs of the target compounds

本方法对信噪比(S/N)进行计算得出检出限(S/N≥3)和定量限(S/N≥10)。结果表明, R-(-)-甲基苯丙胺、S-(+)-甲基苯丙胺的LOD为0.1 ng/mg, R-(-)-苯丙胺和S-(+)-苯丙胺的LOD为0.15 ng/mg; R-(-)-甲基苯丙胺、S-(+)-甲基苯丙胺的LOQ为0.4 ng/mg, R-(-)-苯丙胺和S-(+)-苯丙胺的LOQ为0.5 ng/mg, 满足检测需要。

2.4.2 精密度

为保证数据的可靠性, 配制低、中、高3个水平(20、100、250 ng/mg)的质量控制(QC)样品, 每个水平进行6次平行样本分析, 根据当批的标准曲线, 计算QC样品的含量。结果表明, 各化合物含量的日内精密度≤6.8%, 日间精密度≤11.4%(见表 3)。

表 3 4种目标化合物的日内和日间精密度(n=6) Table 3 Inter-day and intra-day precisions of the four target compounds (n=6)

2.5 实际样品检测

对50余例甲基苯丙胺滥用者的毛发进行了编号及检测, 其中有35例(70%)同时检出单一的S-(+)-甲基苯丙胺和S-(+)-苯丙胺, 其中1号(No.1)样品的检测结果见图 6a。剩余15例同时检出了S-(+)-甲基苯丙胺、S-(+)-苯丙胺和R-(-)-甲基苯丙胺, 其中9例(18%)同时检出了S-(+)-苯丙胺和R-(-)-苯丙胺, 但均以S构型为主(见表 4), 其中26号(No.26)样品的总离子色谱图见图 6b。

图 6 (a) 1号和(b)26号阳性样本的总离子色谱图 Fig. 6 Total ion chromatograms of (a) No. 1 and (b) No. 26 positive samples 1. S-(+)-AM (m/z 136.1/91.2); 2. R-(-)-AM (m/z 136.1/91.2); 3. S-(+)-METH (m/z 150.1/91.1); 4. R-(-)-METH (m/z 150.1/91.1).

表 4 15例检出S-(+)-METH和R-(-)-METH的阳性样本中各构型的比例 Table 4 Percentages of S-(+)-METH and R-(-)-METH in the 15 positive samples%

收集的50例阳性样本均确诊为甲基苯丙胺滥用者, 且毛发作为能够长时间稳定保存其内在毒物的生物检材, 所提供的生物信息反映的时间跨度更长。其中, AM作为METH的代谢产物, 与METH同时检出, 构型一致, 说明该法检测灵敏准确。而其中同时检出两个构型METH的样本, 检出相应构型AM的占18%, 这也与代谢规律一致。而15例中未检出R-(-)-苯丙胺的样本, 考虑其R构型在代谢和检测时可能存在损失或含量低于检出限。由此可见, 滥用者吸食“冰毒”的主要构型仍为S-(+)-甲基苯丙胺, 这一点也与相关报道^{[3, 15]}一致。同时, 这个结果也为打击制毒犯罪提供更明确的方向。

3 结论

本次实验对比了不同提取方法对毛发中METH及AM手性对映异构体的影响, 同时对HPLC-MS/MS条件进行优化, 建立了METH和AM对映异构体的手性分离方法。该法具有简便经济、效率高与灵敏度高等优点。通过应用于司法鉴定实际案例, 说明该法在实际应用中具备可行性, 并确定了滥用者吸食METH的主体构型, 为法医毒物鉴定提供技术支持, 同时也为毒物对映异构体手性分离、毒物管制等方面给予一定参考。

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