蜜蜂在生长过程中可能会被各种幼虫病困扰, 因此养蜂者常使用一些抗生素来控制幼虫病[1], 国外允许使用的抗生素有红霉素[2]、磺胺类药物[3]、林可霉素[4]、泰乐菌素[4]和四环素类药物[5]等, 我国除了上述药物, 还会使用喹诺酮类药物[6]。由于近几年极端气候的影响以及养蜂者缺乏科学的用药知识, 再加上对蜂药监管的相对薄弱, 蜂产品中抗生素超标现象时有发生[7]。蜂产品中抗生素的残留引发人类急性中毒的可能性很小, 但长期低剂量摄入, 可能会产生慢性和积蓄性的毒性, 如“三致毒性”(致癌、致畸、致突变)和免疫毒性等, 其对健康和环境的危害具有隐蔽性, 易造成实质性和难以逆转的危害[8]。
雄蜂蛹粉作为蜂蜜、蜂王浆之后的第三代蜂产品, 具有高蛋白、低脂肪的特点。我国蜂蛹资源丰富, 在湖北、四川、安徽等多地已开发出雄蜂蛹粉产品[9-11], 国内外市场对其需求量也逐渐增加。但我国蜂产品仍然存在抗生素残留的问题, 欧盟、日本、美国等都提高了从我国进口蜂产品时药物残留的质检标准。目前我国还没有适用于雄蜂蛹粉中抗生素检测的方法, 限制了雄蜂蛹粉出口市场的发展。因此建立简便有效的检测方法迫在眉睫。
检测抗生素的方法有微生物法[12]、酶联免疫法[13]、气相色谱-质谱法[14]、液相色谱-串联质谱法[15-19]等。微生物法简单快速, 成本低, 但特异性差, 易受其他抗生素影响, 且灵敏度不高。酶联免疫法虽具有灵敏度高、前处理简单、测定速度快等特点, 但检测结果存在假阳性现象, 且不适用于多类药物残留的同时检测。多种抗生素的高通量检测也是目前检测方法的发展方向之一[20, 21], 目前常用的测定方法为液相色谱-质谱法和气相色谱-质谱法, 由于气相色谱-质谱法存在前处理步骤繁琐, 有机试剂消耗量大, 测定周期长等缺点[22], 因此本文采用液相色谱-串联质谱法, 选择蜂产品中常见的抗生素种类, 并针对雄蜂蛹粉蛋白质含量高的特点, 采用混合蛋白沉淀剂净化提取液, 最终建立了雄蜂蛹粉中大环内酯类、喹诺酮类、磺胺类、四环素类、硝基咪唑类、林可霉素和氯霉素等50种抗生素残留的检测方法, 具有操作简便、灵敏度高、回收率稳定、测定周期短等优点。
TSQ Vantage三重四极杆质谱联用仪, 配Surveyor液相色谱系统(美国Thermo公司); XW-80A涡旋混匀器(上海医科大学仪器厂); 2-16K离心机(美国Sigma公司); AutoVAP S60氮吹仪(美国ATR公司); Smart-N15VF超纯水器(上海力康公司); SPE-432全自动固相萃取仪(北京普立泰科公司); OASIS HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL, 美国Waters公司)
甲醇、甲酸(以上为色谱纯)、醋酸、三水合磷酸氢二钾、三水合乙酸铅(以上为分析纯)、高氯酸(优级纯)和50种抗生素标准品(纯度98%~99%)均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。
混合标准储备液:准确称取适量的标准品, 分别用甲醇配制成1.0 g/L的50种抗生素混合标准储备液(喹诺酮类抗生素, 加入100 μL 0.5 mol/L NaOH溶液助溶)。
混合标准工作液:准确吸取一定量的1.0 g/L混合标准储备液, 分别用甲醇-水(3:7, v/v)溶液稀释成适当浓度的50种抗生素混合标准工作液, 现用现配。
准确称取雄蜂蛹粉样品(1.00±0.05) g, 置于50 mL塑料离心管中, 加入2 mL水, 涡旋, 加入10 mL 1%(体积分数)高氯酸溶液和5 mL 4% (质量分数)醋酸铅溶液, 涡旋混匀; 以8 000 r/min离心3 min, 上层清液转移至50 mL塑料离心管中, 再加入1 mol/L磷酸氢二钾溶液调节溶液pH值至8, 以8 000 r/min离心3 min, 过滤, 滤液转移至50 mL试管中, 在全自动固相萃取仪上净化(方法见表 1), 收集洗脱液, 置于10 mL试管中, 于45 ℃用氮气吹干仪吹干, 加入1.0 mL甲醇-水(3:7, v/v)溶液溶解残渣, 过0.45 μm有机相和水相串联滤膜, 待液相色谱-串联质谱仪测定。
色谱柱:Agilent Polaris C-18柱(100 mm×2.0 mm, 5 μm); 流速:0.25 mL/min; 流动相:A为水, B为甲醇。梯度洗脱程序:0~4.0 min, 30%B~90%B; 4.0~5.0 min, 90%B; 5.0~5.1 min, 90%B~30%B; 5.1~6.5 min, 30%B。进样量:25 μL。
离子源:电喷雾电离(ESI)源; 扫描方式:负离子模式; 毛细管温度:350 ℃; 喷射电压:2.0 kV; 鞘气压力:0.38 MPa; 辅助气流速:2 L/min。
色谱柱:Agilent Polaris C-18柱(100 mm×2.0 mm, 5 μm); 流速:0.25 mL/min; 流动相:A为0.1%(v/v)甲酸水溶液, B为甲醇。梯度洗脱程序:0~1.0 min, 10%B; 1.0~3.0 min, 10%B~30%B; 3.0~4.0 min, 30%B; 4.0~6.0 min, 30%B~95%B; 6.0~9.4 min, 95%B; 9.4~9.5 min, 95%B~10%B; 9.5~11.0 min, 10%B。进样量:25 μL。
离子源:ESI源; 扫描方式:正离子模式; 毛细管温度:350 ℃; 喷射电压:2.5 kV; 鞘气压力:0.38 MPa; 辅助气流速:3.3 L/min。
50种抗生素的保留时间、母离子、子离子和碰撞能量见表 2。
根据欧盟2002/657/EC指令, 质谱确证方法必须达到4个确证点的要求, 采用低分辨液相色谱-串联质谱法检测时, 应在确定母离子的基础上选择两个以上的子离子。以分子离子为母离子进行二级质谱扫描, 最后采集全扫描的二级质谱图, 得到碎片离子信息, 然后再对得到的二级质谱参数, 如碰撞能量进行优化, 使定性离子与定量离子产生的离子对强度达到最大。根据此方法, 得到50种抗生素的最佳质谱参数, 结果见表 2。
由于雄蜂蛹粉中蛋白质含量较高, 前处理过程中需尽可能地将蛋白质去除, 以便后续净化。本实验首先选择同时具有沉淀蛋白质效果的高氯酸和三氯乙酸溶液作为提取试剂, 比较了两种溶液的提取效果, 结果发现三氯乙酸溶液沉淀蛋白质的效果较好, 但检测后发现雄蜂蛹粉中四环素类抗生素中的四环素、金霉素、土霉素和大环内酯类抗生素中的红霉素、北里霉素、泰乐菌素无回收; 采用高氯酸溶液提取, 在前处理过程中发现, 提取离心后的滤液略有浑浊, 净化时易出现固相萃取小柱堵塞的情况; 而提高酸的浓度会导致后期调节pH值时要加入更多的溶液。为使蛋白质尽可能沉淀完全且不影响后续调节pH值的操作, 选择醋酸铅以达到进一步去除蛋白质的目的, 结果表明, 采用高氯酸和醋酸铅结合的方法, 可以获得较清澈的液体, 而且不影响固相萃取的净化效率。
比较了不同体积(5、10、15和20 mL)的1%(v/v)高氯酸溶液对雄蜂蛹粉沉淀蛋白质的效果, 结果发现, 采用10 mL的1%(v/v)高氯酸溶液时可以获得相对清澈的溶液。
实验还比较了不同质量分数(2%、4%、6%和8%)的醋酸铅溶液沉淀雄蜂蛹粉中蛋白质的效果, 发现采用质量分数为4%的醋酸铅溶液就已经可以达到沉淀蛋白质的效果。同时比较了不同体积(5、10、15和20 mL)的4%(质量分数)醋酸铅溶液沉淀蛋白质的效果, 结果发现, 采用5 mL 4%(质量分数)醋酸铅溶液时沉淀效果最佳。
大环内酯类、喹诺酮类、磺胺类、四环素类、硝基咪唑类、林可霉素和氯霉素等50种抗生素的化学性质相差较大, 各化合物酸碱度不一。因此实验比较了不同pH值(pH 3~9)的提取液对各化合物提取效率的影响(见图 1)。由图 1可知, 不同pH值提取液对氯霉素、四环素类抗生素和红霉素影响最大, 这可能与氯霉素和四环素类抗生素在强酸和强碱溶液中易分解、红霉素在酸性条件下不稳定的因素有关。综合考虑, 将提取液的pH值设为8。
对系列混合标准工作液进行测定, 对目标化合物的峰面积(Y)和对应的质量浓度(X, μg/L)进行线性回归, 得到50种抗生素标准曲线的线性方程、相关系数(r)、检出限(LOD)和定量限(LOQ), 结果见表 3。50种抗生素在各自范围内线性关系良好, 相关系数均＞0.99。喹诺酮类抗生素的LOD为0.1 μg/kg, LOQ为5.0 μg/kg; 林可霉素和大环内酯类、磺胺类、硝基咪唑类抗生素的LOD为0.2 μg/kg, LOQ为10.0 μg/kg; 四环素类抗生素的LOD为0.4 μg/kg, LOQ为20.0 μg/kg; 氯霉素的LOD为0.008 μg/kg, LOQ为0.3 μg/kg。
本实验对50种目标化合物进行了3个添加水平的加标回收试验, 每个水平做6个平行样品, 计算50种目标化合物的加标回收率及相对标准偏差, 结果见表 4。
由表 4可以看出, 50种抗生素的平均加标回收率为70.2%~118.3%, 相对标准偏差为1.8%~13.6%, 满足日常检测的需求。
在2017年度共检测雄蜂蛹粉样品50批次, 其中5批次检出土霉素, 含量为21.0~40.0 μg/kg, 阳性率为10%, 说明雄蜂蛹粉中存在抗生素污染风险, 建立雄蜂蛹粉中多种抗生素残留检测的方法迫在眉睫。
建立了液相色谱-串联质谱检测雄蜂蛹粉中50种抗生素残留的分析方法。该法简便、快捷, 可以实现雄蜂蛹粉中多种抗生素的快速测定, 能够满足日常分析检测的需要。
2019,
Vol. 37 Issue (1): 46-53
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2019,
Vol. 37 Issue (1): 46-53
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