有机锡化合物通常可作为聚氯乙烯塑料稳定剂(如二甲基锡、二辛基锡、苯基锡)、杀虫剂、杀菌剂等^{[1, 2]}。这类化合物通常具有中度或高度毒性, 水溶性低, 具有脂溶性, 在环境中有良好的稳定性, 残留期长, 能够通过食物链在人体内富集, 如三苯锡在较低浓度时就能导致生物体内分泌紊乱。目前已在很多食品中发现有机锡化合物的存在, 主要包括蔬菜水果、粮谷、畜禽肉以及水产品等^[3-5]。除此之外, 食品接触材料中也有有机锡化合物检出^[6]。因此研究建立有机锡化合物的相关检测方法具有重要意义。目前我国已发布了相关检测标准, 如食品安全国家标准GB 5009.215-2016中规定了鱼类、贝类、葡萄酒和酱油等样品中有机锡化合物的测定, 标准SN/T 3938-2014中则规定了食品接触材料、高分子材料中有机锡的测定等。但对于人们日常生活中使用的食用植物油中有机锡化合物的测定仍然缺少相关标准。食用植物油受有机锡污染的来源主要有两个:一是大豆、玉米、花生等油作物在种植过程中可能会受到有机锡杀虫剂的污染, 因而导致成品食用油中会有有机锡化合物的检出现象; 二是由于我国大部分食用油皆用塑料制品包装, 而有机锡化合物又具有脂溶性, 从而导致有机锡化合物从包装迁移至食用油中。因此, 建立食用植物油中有机锡化合物的测定方法对于规范市场行为, 保护国民健康具有重要意义。

对食用油进行检测时通常要除去含量高的油脂, 否则一方面基体干扰大, 信噪比大幅下降、灵敏度不够, 从而导致假阴性漏判降低; 另一方面还会污染仪器及色谱柱, 增加维护成本, 降低使用寿命。目前针对食用油检测常用的前处理方法主要有凝胶渗透色谱(GPC)法^[7]、分散固相萃取(QuEChERS)法^{[8, 9]}、固相萃取法等^[10]。凝胶渗透色谱法利用不同物质相对分子量大小不同、从凝胶色谱中馏出顺序不同的原理来实现油脂与待分析物的分离。因而其在食用油检测方面具有非常大的优势。液液萃取法操作简单, 通常选用与油脂不相溶的有机试剂提取待分析物, 但提取过程中不可避免地会提取出小部分油脂, 依旧给后续的分析带来较大的净化压力。QuEChERS法具有原理简单、操作快捷、试剂消耗小等优点, 目前已有文献采用QuEChERS技术测定食用油中农药残留等^{[8, 9]}。对有机锡类化合物的常用检测方法主要包括气相色谱法^[11]、气相色谱-质谱法^[12]以及液相色谱-串联质谱法^[13]等。陈金保等^[13]采用低温冷冻提取结合分散固相萃取技术, 建立了高效液相色谱-串联质谱同时测定食用植物油样品中有机锡的分析方法, 其最低检出限可达到0.005 mg/kg, 但是高效液相色谱-串联质谱相对于气相色谱-质谱来说其检测及维护成本较高。Liu等^[14]采用气相色谱-质谱技术对食用油中有机锡化合物进行检测, 其检出限可达0.19 μg/kg, 但采用电子轰击电离(EI)源作为电离技术, 容易有复杂基质成分和柱流失带来的干扰问题, 会导致灵敏度的降低。而采用正化学源(PCI)作为电离技术可极大程度地避免柱流失的干扰, 因为PCI属于软电离模式, 分子离子峰强度高, 对大多数基质成分和柱流失响应很低或无响应。综上, 鉴于GPC在分离油脂与待分析物上的优点以及PCI作为电离技术干扰小的特点, 本文建立了以GPC为净化技术, 采用正化学源-气相色谱-质谱测定食用植物油中7种有机锡化合物的方法。该方法具有检出限低、操作简单、灵敏度高、目标物干扰小等优点。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 7890B气相色谱-5977A质谱仪(配备有化学电离源, 美国安捷伦公司); J2 Prepline凝胶净化系统(美国J2 Scientific公司); RE601A-O旋转蒸发仪(日本雅玛拓公司); XW-80A旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司); Xcelvap氮吹浓缩仪(意大利Horizon公司); Heraeus Multifuge XIR离心机(美国Thermo公司); Kh-500B超声波振荡器(昆山禾创超声仪器厂); DB-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm, 美国安捷伦公司)。

标准品:二苯基二氯化锡(DphT, 纯度≥98.0%, 批号141710)、三唑锡(azocyclotin, 纯度≥99.0%, 批号40108)、三丁基氯化锡(TBTCl, 纯度≥98.0%, 批号121721)、三辛基氯化锡(TOTCl, 纯度≥96.4%, 批号133195)、苯丁锡(FBTO, 纯度≥93.5%, 批号146124)、三苯基氢氧化锡(TPhT, 纯度≥95.0%, 批号120554)、三环锡(TCyT, 纯度≥97.0%, 批号30329)均购于德国Dr. Ehrenstorfer公司。

环己烷、乙酸乙酯和二氯甲烷均为色谱纯, 购自霍尼韦尔贸易(上海)有限公司; 四乙基硼化钠(NaBEt₄, 纯度98%)购自上海安谱实验科技股份有限公司; 其他试剂均为国产分析纯。实验用水符合GB/T 6682中一级水要求。

食用植物油由江苏出入境检验检疫局食品实验室提供。

1.2 溶液配制

单标准储备液:分别准确称取10 mg(精确到0.01 mg)7种有机锡标准物质标准品, 用二氯甲烷溶解并定容稀释到10 mL, 配成1 g/L的单标准储备液。

混合标准溶液:分别准确移取7种有机锡单标准储备液1 mL于10 mL容量瓶中, 用二氯甲烷稀释成100 mg/L的混合标准溶液。准确移取1 mL 100 mg/L混合标准溶液到10 mL容量瓶中, 用二氯甲烷定容, 配成10 mg/L的混合标准溶液, 于4 ℃冰箱内避光保存, 有效期为3个月。

基质标准工作溶液:量取一定体积的混合标准溶液, 氮气吹干后根据需要用经提取及净化后的阴性芝麻油样品溶液稀释成1 000、500、200、100、50、20 μg/L的系列标准工作溶液, 需现用现配。

乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH=4.5):称取18 g乙酸钠, 加入9.8 mL乙酸, 用水稀释定容至1 000 mL, 有效期为3个月。

1.3 样品前处理

1.3.1 GPC净化

称取1.00 g(精确至0.01 g)样品, 用环己烷-乙酸乙酯(1:1, v/v, 下同)溶解并定容至10 mL, 混合均匀, 取5 mL注入GPC中, 以环己烷-乙酸乙酯(1:1)为洗脱溶剂, 以5 mL/min的流速进行洗脱。收集17~30 min的流出液, 于40 ℃水浴下, 旋转蒸发至干。以5 mL正己烷溶解残渣, 待衍生。

1.3.2 衍生

向上述提取液中加入5 mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH=4.5)及1 mL四乙基硼化钠(2 g/100 mL)溶液, 振摇后超声反应20 min, 以8 000 r/min的速度离心3 min, 取上清液于试管中。加入5 mL正己烷, 重复提取衍生物, 合并上清液, 在40 ℃下氮气吹干, 用1 mL正己烷溶解后过0.22 μm有机相滤膜, 待仪器分析。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱:DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm); 进样口温度:300 ℃; 进样量:1 μL; 进样方式:不分流进样, 1 min后打开分流阀。程序升温条件:初始温度为100 ℃, 保持2 min, 以30 ℃/min的速率升温至300 ℃, 保持8 min。载气:高纯He(纯度≥99.999%); 流速:1 mL/min。

1.4.2 质谱条件

正化学电离源; 电离能量:139.9 eV; 反应气:甲烷(纯度≥99.999%), 流量为1 mL/min; 四极杆温度:150 ℃; 离子源温度:250 ℃; 传输线温度:280 ℃; 溶剂延迟:5 min; 扫描方式:选择离子监测(SIM)。在确定的仪器条件下7种有机锡化合物衍生物的保留时间、定量离子、定性离子等见表 1。其中三唑锡在水中会水解为三环锡, 因而其出峰时间及相应定性定量离子与三环锡相同(见图 1)。

表 1 (Table 1)

表 1 7种有机锡化合物衍生物的保留时间、定量离子、定性离子 Table 1 Retention time, quantitative ions, and qualitative ions of seven organo-tin derivatives Compound Retention time/min Retention time window/min Quantitative ion (m/z) Qualitative ions (m/z) TBTCl 5.544 5.0-6.5 263 291, 289, 261 DphT 7.139 6.5-8.0 255 303, 301, 253 TPhT 8.528 8.0-11.0 303 351, 349 TCyT 8.553 8.0-11.0 315 369, 313 Azocyclotin 8.553 8.0-11.0 315 369, 313 TOTCl 9.197 8.0-11.0 375 459, 457, 373 FBTO 11.887 11.0-14.7 415 519, 413 TBTCl: chlorotributyltin; DphT: dichlorodiphenyl; TPhT: fentin hydroxide; TcyT: cyhexatin; TOTCl: trioctyltin chloride; FBTO: fenbutatin oxide.

表 1 7种有机锡化合物衍生物的保留时间、定量离子、定性离子 Table 1 Retention time, quantitative ions, and qualitative ions of seven organo-tin derivatives

图 1

Fig. 1

图 1 7种有机锡化合物衍生物的总离子流图 Fig. 1 Total ion chromatogram of the seven organo-tin derivatives

2 结果与讨论

2.1 仪器方法的选择

现有的关于有机锡化合物的分析大都采用气相色谱-质谱-电子轰击电离源技术^[14], 但是EI源容易有复杂基质成分和柱流失带来的干扰问题, 而负化学源(NCI)只对电负性元素或基团的化合物有响应, 因此不适合有机锡化合物的分析, 而PCI属于软电离模式, 分子离子峰强度高, 对大多数基质成分和柱流失响应很低或无响应, 因此本试验采用PCI作为电离技术。

2.2 前处理条件的选择

关于食用油的前处理方法主要有GPC法^[7]、分散固相萃取技术法^{[8, 9]}及固相萃取法^[10]等。参考文献^[14]比较了分散固相萃取技术(QuEChERS)、固相萃取(SPE)净化技术以及GPC技术等3种净化方法, 对食用油中7种有机锡化合物进行了处理。分散固相萃取技术中, 采用甲醇作为提取液进行液液萃取, 取上清液进行衍生后加入100 mg乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)和50 mg无水硫酸镁, 过膜后上机分析。采用固相萃取净化技术处理食用油样品时, 选择了Captiva EMR-Lipid净化小柱, 该净化柱可用于处理高油脂含量的样品; 首先使用乙腈提取食用油样品, 取提取液过Captiva EMR-Lipid净化小柱, 收集洗脱液后衍生, 进气相色谱-质谱仪分析, 结果见图 2。由图可知, 采用GPC法时, 样品净化的最干净, 7种有机锡化合物均有回收, 且目标峰附近干扰小; 采用分散固相萃取技术及固相萃取技术时, 净化效果都较差。采用固相萃取技术净化时没有检出苯丁锡这类相对分子质量较大的化合物。综上所述, 选择GPC法作为净化方法。

图 2

Fig. 2

图 2 3种前处理方法中7种有机锡化合物衍生物的总离子流对比图 Fig. 2 Compared total ion chromatograms of the seven organo-tin derivatives with three pretreatment methods

2.3 GPC条件的优化

为了实现目标化合物与大分子油脂杂质的有效分离, 本试验主要对GPC的收集时间等进行了优化。除苯丁锡的相对分子质量较大外, 其余有机锡化合物均能通过GPC法实现与油脂的分离。为确定收集时间, 在阴性芝麻油样品中加入了1 mg/L混合标准溶液, 分段收集, 浓缩后按照1.3.2节方法进行处理, 用气相色谱-质谱仪进行分析。结果表明, 有机锡化合物从17 min开始被洗脱, 到30 min时, 所有待分析物均洗脱完毕。因此最终确定收集17~30 min的洗脱液进行分析。

2.4 方法学验证

2.4.1 基质效应考察

基质效应普遍存在于质谱分析中, 通常会表现为对目标化合物响应信号的增强或抑制作用, 从而会影响定量的准确性。因此本试验配制了2份相同质量浓度水平的系列标准溶液, 一份用阴性芝麻油样品按照1.3.1节前处理方法获得的基质液进行配制, 另一份用正己烷配制, 两份标准溶液进行衍生后采用气相色谱-质谱仪分析。根据基质匹配标准曲线的斜率与正己烷配制标准曲线的斜率之比来评价基质效应, 比值大于1则表现为基质增强效应, 相反则表现为基质抑制效应。从试验结果(见表 2)可知, 各化合物有一定的基质增强效应, 为了保证检测结果的准确性, 本文采用了基质标准曲线进行定量。

表 2 (Table 2)

表 2 阴性芝麻油中7种有机锡化合物衍生物的线性范围、回归方程、相关系数(r2)、检出限、定量限和基质效应 Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r2), LODs, LOQs and matrix effects of the seven organo-tin derivatives in negative sesame oil Compound Linear range/ (μg/L) Regression equation r2 LOD/ (μg/kg) LOQ/ (μg/kg) Matrix effect TBTCl 20-1000 Y=31.4X-236.4 0.9997 0.2 0.6 3.21 DphT 20-1000 Y=16.5X-191.1 0.9986 0.2 0.6 1.98 TPhT 20-1000 Y=28.9X-382.6 0.9960 0.2 0.6 2.79 TcyT (azocyclotin) 40-2000 Y=73.5X-864.2 0.9991 0.1 0.3 3.56 TOTC 20-1000 Y=11.6X-163.5 0.9953 0.4 1.2 4.10 FBTO 20-1000 Y=11.1X-114.6 0.9982 0.4 1.2 2.11 Y: peak area of quantitative ion; X: mass concentration of the compound, μg/L

表 2 阴性芝麻油中7种有机锡化合物衍生物的线性范围、回归方程、相关系数(r2)、检出限、定量限和基质效应 Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r2), LODs, LOQs and matrix effects of the seven organo-tin derivatives in negative sesame oil

2.4.2 标准曲线、检出限及定量限

以芝麻油为阴性基质, 按1.3.1节中处理方法进行处理后得到的基质液配制标准溶液, 进行衍生后在1.4节仪器条件下进行分析测定。以各组分定量离子峰面积为纵坐标、质量浓度(μg/L)为横坐标绘制标准曲线。以3倍信噪比确定检出限, 10倍信噪比确定定量限, 结果见表 2。

由表可知, 有机锡化合物在20~2 000 μg/L范围内的相关系数(r²)均大于0.99, 线性关系良好。由于三唑锡在水中易水解为三环锡, 经过净化衍生后, 其衍生化产物与三环锡相同, 且标准SN/T 4558-2016中规定三环锡与三唑锡的测定结果以三环锡计, 因而本试验中以三环锡进行定量表示三环锡与三唑锡含量之和。

2.4.3 方法的准确度及精密度

选取阴性芝麻油为基质进行添加回收试验, 3个添加水平分别为50、100和200 μg/kg, 按照样品净化、衍生步骤进行前处理后, 用气相色谱-质谱分析测定, 每个添加水平平行测定6次, 以得到的各目标物的加标回收率表示方法的准确度, 相对标准偏差表示方法的精密度, 具体数据见表 3。3个添加水平下, 以芝麻油为阴性基质, 7种有机锡化合物的平均回收率为66.2%~103.2%, 所有RSD均小于11.5%。苯丁锡回收率较其他目标物低的原因可能是其相对分子质量较大, 在进行GPC净化时, 部分随油脂等大分子杂质流出。但总体来说该方法准确可靠, 精密度高, 可用于植物油中有机锡化合物残留量的测定。

表 3 (Table 3)

表 3 芝麻油中7种有机锡化合物的平均添加回收率及相对标准偏差(n=6) Table 3 Average spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the seven organo-tin in sesame oil (n=6) Compound 50 μg/kg 100 μg/kg 200 μg/kg Recovery/% RSD/% Recovery/% RSD/% Recovery/% RSD/% TBTCl 86.7 9.2 96.4 8.1 92.5 6.5 DphT 93.1 10.2 89.6 8.9 103.2 9.4 TPhT 78.9 6.1 82.4 7.3 76.5 7.9 TcyT (azocyclotin) 89.7 8.5 81.9 7.3 79.2 9.4 TOTCl 91.0 11.5 85.3 9.4 88.7 8.9 FBTO 69.4 9.9 74.3 12.3 66.2 8.1

表 3 芝麻油中7种有机锡化合物的平均添加回收率及相对标准偏差(n=6) Table 3 Average spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the seven organo-tin in sesame oil (n=6)

2.4.4 方法稳定性

以芝麻油为阴性基质, 按1.3.1节中处理方法进行处理后得到的基质液配制100 μg/L混合标准溶液, 分别放置4、8、16、24和48 h后进行测定, 比较放置不同时间后各目标物的响应, 结果显示, 48 h内7种有机锡化合物响应变化在±10%以内, 表明溶液是稳定的。

2.5 实际样品检测

应用本方法对实验室内100个批次的芝麻油、橄榄油、棕榈油、大豆油、玉米油、葵花籽油等样品进行测定, 未检测出二苯基二氯化锡、三辛基氯化锡、苯丁锡、三苯基氢氧化锡、三环锡、三唑锡。部分食用植物油中有检出三丁基氯化锡, 范围为0.023~0.087 mg/kg。图 3为检测出三丁基氯化锡阳性大豆油样品的色谱图。

图 3

Fig. 3

图 3 阳性大豆油中三丁基氯化锡色谱图 Fig. 3 Chromatogram of TBTCl in positive soybean oil

3 结论

本文建立了正化学电离源-气相色谱-质谱测定食用植物油中有机锡化合物残留的方法。比较了分散固相萃取技术、固相萃取净化技术以及GPC技术等3种净化方法, 结果表明, 采用GPC技术时, 7种有机锡化合物均得到了较好的回收。采用PCI作为电离技术时, 质谱图的碎片信息较为丰富, 且抗干扰能力强。该方法具有较高的灵敏度, 在线性范围内相关性良好, 可用于测定食用植物油中有机锡化合物残留量。

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