色谱  2019, Vol. 37 Issue (1): 40-45   PDF    
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陈磊
刘芸
陈雷
张晓燕
冯峰
张峰
高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱检测中国杨树型蜂胶、巴西绿蜂胶和杨树胶中的酚类化合物及真伪鉴别
陈磊1, 刘芸1, 陈雷1, 张晓燕1, 冯峰2, 张峰2     
1. 南京海关动植物与食品检测中心, 江苏 南京 210019;
2. 中国检验检疫科学研究院食品安全研究所, 北京 100176
收稿日期：2018-09-01
基金项目：国家重点研发计划（2017YFF0211000）
通讯联系人：陈磊, Tel:(025)52345193, E-mail:coffeecatchen@163.com
摘要：建立了用于检测中国杨树型蜂胶、巴西绿蜂胶和杨树胶中23种酚类化合物的高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（HPLC/Q-TOF MS）法，并进行了差异性分析。蜂胶和树胶样品用甲醇-水（1：1，v/v）溶解后，过0.45 μm有机相滤膜后进样。采用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱分离，以乙腈和0.1%（体积分数）甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，电喷雾正离子模式全扫描方式检测，扫描范围为m/z 100~1000，外标法定量。结果表明，23种酚类化合物在10~200 μg/L范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99。桔皮素和刺芒柄花素的检出限和定量限分别为0.2和1 μg/L，其他化合物的检出限和定量限分别为2和10 μg/L。在10、25和50 mg/kg 3个添加水平下，23种酚类化合物在3种样品基质中的提取回收率为70.2%~122.6%，RSD值均小于10%。水杨苷、肉桂酸、咖啡酸和香豆酸可以作为中国杨树型蜂胶掺假鉴别的特征化合物，咖啡酸、阿魏酸、白杨素、咖啡酸苯乙酯、松属素、高良姜素、香豆酸、异鼠李素、山柰素和阿替匹林C可以作为辨别中国杨树型蜂胶和巴西绿蜂胶的特征化合物。该结果对蜂胶产品的质量控制具有一定的参考意义。
关键词：高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱    蜂胶    酚类化合物    掺假鉴别    
Determination of phenolic compounds in Chinese poplar propolis, Brazil green propolis, and poplar gum by high performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry and preliminary study of the identification of adulteration
CHEN Lei1, LIU Yun1, CHEN Lei1, ZHANG Xiaoyan1, FENG Feng2, ZHANG Feng2     
1. Animal, Plant and Food Inspection Center, Nanjing Customs, Nanjing 210019, China;
2. Institute of Food Safety, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100176, China
Foundation item: National Key Research and Development Project of China (No. 2017YFF0211000)
Abstract: High-performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (HPLC/Q-TOF MS) was used to analyze 23 phenolic compounds in Chinese poplar propolis, Brazil green propolis, and poplar gum. Propolis and poplar gum samples were dissolved in methanol-water (1:1, v/v) and filtered by 0.45 μm organic phase filtration membrane. The separation was carried out in an Agilent Eclipse Plus C18 column with gradient elution using acetoni-trile and 0.1% (volume percentage) formic acid solution as the mobile phases. The compounds were detected using positive ion electrospray ionization in full scan mode (m/z 100-1000). The quantification analysis was performed by the external standard method. The results showed that all the compounds were linear, with correlation coefficients>0.99, in the range of 10-20 μg/L. The limits of detection and limits of quantification for tangeretin and formononetin were 0.2 and 1 μg/L, respectively, and those for the other compounds were 2 and 10 μg/L, respectively. At the spiked levels of 10, 25, and 50 mg/kg, the recoveries of all the compounds ranged from 70.2% to 122.6%, with relative standard deviations of less than 10%. Salicin, cinnamic acid, caffeic acid, and coumaric acid could be used as markers for detecting adulteration in Chinese poplar propolis, while caffeic acid, ferulic acid, chrysin, caffeic acid phenethyl ester, pinocembrin, galangin, coumaric acid, isorhamnetin, kaempferide, and arte-pillin C could be used as markers for identifying Chinese poplar propolis and Brazil green propolis. The results presented in this paper may be helpful in quality control of propolis products.
Key words: high performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (HPLC/Q-TOF MS)     propolis     phenolic compounds     adulteration identification    

蜂胶是蜜蜂从植物芽孢和树干处采集的树脂混入蜜蜂上颚腺和蜂蜡等物质形成的一种具有芳香气味的黏性胶状固形物[1], 其作为蜜蜂生存环境的天然屏障, 可以有效维持整个蜂群的健康。一个5~6万只的蜂群一年只能生产蜂胶70~110 g, 蜂胶被誉为“紫色黄金”。由此可见, 蜂胶的实际产量并不大, 但目前我国市场上的蜂胶类产品却种类繁多, 其中不乏杨树胶制成的伪品。因此, 对蜂胶进行可靠的质量控制非常重要。我国目前实施的蜂胶国家标准(GB/T 24283-2009)中规定的感官指标包括结构、色泽、状态、气味和滋味, 理化指标包括乙醇提取物含量、总黄酮和氧化时间。在实际检测中发现, 这些指标均不能有效区分蜂胶与杨树胶, 因为杨树胶也可以达到检测要求。目前用于产地为中国的蜂胶掺假鉴别的国标方法为GB/T 34782-2017。该方法利用高效液相色谱法检测水杨苷和邻苯二酚, 对蜂胶和杨树胶进行鉴别。此外, 还有基于高效液相色谱指纹图谱法的行业标准(GH/T 1087-2013)也能用于蜂胶掺假鉴别。但总的来说, 蜂胶掺假的鉴别方法仍然偏少, 不足以遏制目前的蜂胶掺假现象。

蜂胶的质量取决于其中所含有效活性物质的量。蜂胶中含有许多黄酮类、酚酸及其酯类、萜类和有机酸类物质[2-4]。其中, 黄酮类与酚酸及其酯类同属酚类化合物, 是蜂胶疗效的最主要来源[5]。已有大量文献[6-9]报道, 蜂胶中的这些生物活性物质显示出广谱抗菌、抗肿瘤、杀菌, 局部麻醉、抗炎、降低血压、受激免疫及抑制细胞、稳定细胞和促进细胞组织再生的生理活性。由于蜂胶含有的化学成分受植物来源影响比较大, 所以在世界范围内, 不同地区蜂胶的化学成分也存在较大差异[10]。周梦瑶等[11]根据地域对世界主要蜂胶的植物来源及其化合物组成进行了综述。张翠平等[12]根据植物来源将世界范围内的蜂胶分为杨树属型、酒神菊属型、克鲁西属型、血桐属型和地中海东部地区型5大类。其中, 杨树属型蜂胶(例如中国蜂胶)和酒神菊属型蜂胶(俗称巴西绿蜂胶)被研究和报道的比较广泛和深入。

本文选取酚类化合物为研究对象, 以高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱为研究手段, 通过测定中国杨树型蜂胶、巴西绿蜂胶、杨树胶中的主要酚类化合物, 进行定量检测和差异性分析, 筛选能用于辨别中国杨树型蜂胶真伪、区别中国杨树型蜂胶和巴西绿蜂胶的特征标志物, 以改善现有的蜂胶质控方法。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

Agilent 1260液相色谱仪串联6530飞行时间质谱, 配有自动脱气机、二元高压泵、自动进样器、柱温箱及Mass Hunter数据处理软件(美国Agilent公司); PURELAB Option Q5超纯水制备仪(英国ELGA公司); KH-500B型超声仪(昆山禾创超声仪器有限公司)。

中国杨树型蜂胶、杨树胶样品采集自山东、湖北、河南、江苏等地, 巴西绿蜂胶为进出口企业送检样品。为保证样品的含胶量一致, 所选蜂胶及树胶样品均为乙醇提取物。

咖啡酸、白杨素、松属素、刺芒柄花素、芹菜素、高良姜素、柚皮素、芫花素、咖啡酸苯乙酯、山柰酚、木犀草素、水杨苷、山柰素、阿替匹林C、槲皮素、异鼠李素、鼠李素、杨梅酮、桔皮素、芦丁、香豆酸、肉桂酸以及阿魏酸标准品购自上海安谱化学试剂有限公司, 纯度均不小于99.5%;乙腈和甲醇(均为色谱纯, 德国Merck公司); 实验用水为超纯水。

1.2 标准溶液配制

分别准确称取10 mg咖啡酸、白杨素、松属素、刺芒柄花素、芹菜素、高良姜素、柚皮素、芫花素、咖啡酸苯乙酯、山柰酚、木犀草素、水杨苷、山柰素、阿替匹林C、槲皮素、异鼠李素、鼠李素、杨梅酮、桔皮素、芦丁、香豆酸、肉桂酸以及阿魏酸标准品, 用甲醇定容至10 mL, 得到1 g/L的标准储备液。临用前用甲醇逐级稀释至适当浓度。

1.3 样品前处理

称取约0.2 g样品, 加入适量甲醇, 超声约15 min至完全溶解后, 用甲醇定容至50 mL。取500 μL上述甲醇溶液至1.5 mL塑料离心管中, 加超纯水500 μL, 涡旋混匀后以12 000 r/min的速度离心3 min, 上清液过0.45 μm有机相滤膜后进样。由于样品中有些化合物含量非常高, 用甲醇-水(1:1, v/v)分别稀释10、100和1 000倍后再次进样。

1.4 色谱条件

色谱柱:Agilent Eclipse Plus C18(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm); 柱温:35 ℃; 流速:200 μL/min; 进样量:10 μL; 流动相:A相为乙腈, B相为0.1%(体积分数)甲酸。梯度洗脱程序:0~1.0 min, 30%A; 1.0~5.5 min, 30%A~55%A; 5.5~15.0 min, 55%A~70%A; 15.0~16.0 min, 70%A~30%A; 16.0~20.0 min, 30%A。

1.5 质谱条件

离子源:电喷雾离子(ESI)源; 检测模式:正离子; 干燥气流速:5 L/min; 干燥气温度:325 ℃; 雾化气压力:310 kPa; 鞘气温度:400 ℃; 鞘气流速:12.0 L/min, 离子扫描范围:m/z 100~1 000。

1.6 统计分析

使用SPSS 19.0软件(美国SPSS公司)进行独立样本t检验(95%置信区间), 分别比较中国杨树型蜂胶与巴西绿蜂胶, 中国杨树型蜂胶与杨树胶之间23种酚类化合物的含量差异, 筛选特征化合物。

2 结果与讨论
2.1 线性范围、检出限与定量限

分别取适量23种化合物的标准储备液, 配制成10 mg/L的混合标准溶液, 用甲醇-水(1:1, v/v)逐级稀释至200、100、50、20、10 μg/L。按照上述仪器条件检测后, 以化合物的峰面积Y对质量浓度X (μg/L)进行线性回归, 计算得到23种化合物的校正曲线方程。23种酚类化合物在10~200 μg/L范围内线性关系良好, 相关系数均大于0.99。桔皮素和刺芒柄花素的检出限和定量限分别为0.2和1 μg/L, 其他化合物的检出限和定量限分别为2和10 μg/L。23种酚类化合物的提取离子色谱图见图 1。

图 1 23种酚类化合物(200 μg/L)的提取离子色谱图 Fig. 1 Extracted ion chromatograms of the 23 phenolic compounds (200 μg/L)
2.2 精密度和回收率

在10、25和50 mg/kg 3个添加水平下, 分别考察23种酚类化合物在中国杨树型蜂胶、巴西绿蜂胶和杨树胶中的提取回收率。每个添加水平分别重复3次试验, 结果如表 1所示, 23种酚类化合物在3种样品基质中的提取回收率为70.2%~122.6%, RSD值均小于10%, 满足定量分析方法的要求。

表 1 23种酚类化合物在中国杨树型蜂胶、巴西绿蜂胶和杨树胶中的回收率和精密度(n=3) Table 1 Recoveries and precisions of the 23 phenolic compounds in Chinese poplar propolis, Brazil green propolis, and poplar gum (n=3)
2.3 实际样品检测

采用本文建立的检测方法对10个中国杨树型蜂胶、8个巴西蜂胶和10个杨树胶中23种酚类化合物的含量进行测定, 结果见表 2。杨树胶中阿魏酸、肉桂酸、白杨素、咖啡酸苯乙酯、松属素、高良姜素的含量比较高。中国杨树型蜂胶中咖啡酸、阿魏酸、白杨素、咖啡酸苯乙酯、松属素、高良姜素含量比较高。巴西蜂胶中香豆酸、异鼠李素、山柰素、阿替匹林C含量比较高。3种样品中均没有检测到芦丁、杨梅酮、刺芒柄花素和桔皮素。

表 2 杨树胶(n=10)、中国杨树型蜂胶(n=10)和巴西绿蜂胶(n=8)中23种酚类化合物的含量 Table 2 Contents of the 23 phenolic compounds in poplar gum (n=10), Chinese poplar propolis (n=10), and Brazil green propolis (n=8)

中国杨树型蜂胶和杨树胶的主要植物来源都是杨树, 检测结果显示这两组样品中白杨素、松属素、高良姜素含量都非常高, 与文献结论一致[10-12]。另外, 这两组样品中阿魏酸和咖啡酸苯乙酯的含量也都很高。已有较多文献[13-17]报道中国杨树型蜂胶中这两种化合物的含量较高。但是由于杨树胶的相关研究较少, 这两种化合物在杨树胶中的含量情况目前还存在疑问。如曹炜等[18]报道, 杨树芽提取物中阿魏酸和咖啡酸苯乙酯都有检出, 而Zhang等[19]报道杨树胶中未检出阿魏酸。

正是由于杨树胶和中国杨树型蜂胶的化合物组成存在诸多的相似性, 所以杨树胶经常用于中国杨树型蜂胶的掺假。根据本文的检测结果, 两者也有许多化合物的含量存在明显的差异, 可以用于中国杨树型蜂胶掺假鉴别。例如水杨苷和肉桂酸, 在杨树胶中的含量远高于中国杨树型蜂胶(P＜0.05), 可以作为杨树胶的特征化合物; 反之, 咖啡酸和香豆酸在中国杨树型蜂胶中的含量远高于杨树胶(P＜0.05), 可以作为中国杨树型蜂胶的特征化合物。在进行中国杨树型蜂胶的掺假鉴别时, 综合考察杨树胶和中国杨树型蜂胶两方面的特征化合物所得出的判定结论将会更加准确。其中, 水杨苷、咖啡酸、香豆酸用于中国杨树型蜂胶的掺假鉴别已有文献[19, 20]报道, 肉桂酸在中国杨树型蜂胶和杨树胶中的含量差异尚未见文献报道。

巴西蜂胶的主要植物来源为酒神菊树, 其化合物组成与中国杨树型蜂胶存在较大的差异。检测结果显示, 中国杨树型蜂胶中咖啡酸、阿魏酸、白杨素、咖啡酸苯乙酯、松属素、高良姜素的含量远高于巴西蜂胶(P＜0.05), 可以作为中国杨树型蜂胶的特征化合物。而巴西蜂胶中香豆酸、异鼠李素、山柰素和阿替匹林C的含量远高于中国杨树型蜂胶(P＜0.05), 可以作为巴西蜂胶的特征化合物。其中, 阿替匹林C作为巴西绿蜂胶的特有化合物已经有较多文献[21, 22]报道, 而香豆酸、异鼠李素和山柰素在巴西绿蜂胶中的含量情况文献报道较少[23]。

对于蜂胶中是否存在芦丁, 一直存在较大争议。在早期的文献和蜂胶标准[24-26]中, 认为蜂胶中存在一定含量的芦丁。但是近来有越来越多的文献报道[18, 19, 27]蜂胶中并没有检测到芦丁。因为蜜蜂在采集蜂胶时, 唾液中含有的β-糖苷酶能水解连接在苷元上的糖配基[28]。因此, 蜂胶中不含有芦丁应该是比较可靠的结论。

3 结论

本文建立了一种同时检测中国杨树型蜂胶、巴西绿蜂胶和杨树胶中23种酚类化合物的高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱方法, 该方法简单、准确、可靠。此外, 通过检测实际样品中23种酚类化合物的含量并进行差异性分析, 提出水杨苷、肉桂酸、咖啡酸和香豆酸可以作为中国杨树型蜂胶掺假鉴别的特征化合物, 而咖啡酸、阿魏酸、白杨素、咖啡酸苯乙酯、松属素、高良姜素、香豆酸、异鼠李素、山柰素和阿替匹林C可以作为辨别中国杨树型蜂胶和巴西蜂胶的特征化合物。

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