色谱  2019, Vol. 37 Issue (2): 239-245   PDF    
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王超
黄肇章
邢占磊
陈烨
于建钊
刘方
袁懋
在线固相萃取-液相色谱法直接测定水中超痕量多环芳烃
王超1, 黄肇章2, 邢占磊3, 陈烨1, 于建钊1, 刘方1, 袁懋1     
1. 中国环境监测总站, 北京 100012;
2. 广州市环境监测中心站, 广州 510091;
3. 赛默飞世尔科技有限公司, 北京 100080
收稿日期：2018-09-29
通讯联系人：王超, Tel:(010)84943198, E-mail:preparing@126.com
摘要：建立了在线固相萃取-液相色谱直接测定水体中16种超痕量多环芳烃（PAHs）的方法。水样经高速离心后，加入适量甲醇，配制成40%（体积分数）甲醇水溶液，直接进样2 mL至在线固相萃取流路，进行萃取富集，再通过阀切换将洗脱的PAHs转移至分析流路进行分离检测。16种PAHs在各自范围内线性关系良好，相关系数均大于0.996；方法的检出限为0.14~12.50 ng/L，其中苯并[a]芘（B（a）P）的检出限为0.38 ng/L。实际水样在10、40和200 ng/L加标水平下的加标回收率为76.1%~134.9%，RSD为0.3%~16.6%。B（a）P在1 ng/L加标水平下的回收率为71.8%~92.7%，RSD为3.9%。结果表明，该方法操作简单，灵敏度高，溶剂消耗量少，可满足水样中PAHs，尤其是B（a）P的超痕量分析要求。
关键词：液相色谱    在线固相萃取    多环芳烃    苯并[a]芘    水样    
Direct determination of ultra-trace polycyclic aromatic hydrocarbons in water by liquid chromatography coupled with online solid phase extraction
WANG Chao1, HUANG Zhaozhang2, XING Zhanlei3, CHEN Ye1, YU Jianzhao1, LIU Fang1, YUAN Mao1     
1. China National Environmental Monitoring Centre, Beijing 100012, China;
2. Guangzhou Environmental Monitoring Centre, Guangzhou 510091, China;
3. Thermo Fisher Scientific Corporation China, Beijing 100080, China
Abstract: A method was developed for the direct determination of 16 ultra-trace polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in water by liquid chromatography (LC) coupled with online solid phase extraction (online SPE). The water sample was centrifuged at a high speed to remove the particulate matter and prepared into an aqueous solution containing 40% (v/v) methanol. A 2 mL-sample was directly injected into the online SPE flow path. Online purification and enrichment of the samples were carried out on the SPE column (Acclaim PA Ⅱ, 50 mm×4.6 mm, 3 μm). The PAHs eluted from the SPE column were transferred to the analytical flow path by valve switching, and were separated on a Hypersil Green PAHs column (150 mm×3 mm, 3 μm). Water and acetonitrile were used as the mobile phases. The flow rates of 1.0 mL/min and 0.4 mL/min were used in the extraction and balance processes, respectively. The flow rate of 0.6 mL/min was used to separate the PAHs in the analytical flow path. Acenaphthylene without a fluorescent signal was detected at the ultraviolet absorption wavelength of 220 nm, while other PAHs were measured by the fluorescence signal via the special excitation/emission wavelength program. The entire analysis could be completed within 37 min. The linear correlation coefficients of the 16 PAHs were greater than 0.996. The limits of detection of the PAHs were 0.14-12.50 ng/L (S/N=3) with only 0.38 ng/L for benzo(a)pyrene (B(a)P). The recoveries of PAHs at spiked levels of 10, 40 and 200 ng/L in the water samples were 76.1%-134.9%. The RSDs (n=3) were 0.3%-16.6%. Furthermore, the recoveries and RSDs (n=3) of B(a)P were 71.8%-92.7% and 3.9%, respectively. The proposed method is simple, rapid, solvent-saving, stable and sensitive, and can meet the ultra-trace analysis requirements of the PAHs (especially B(a)P) in various water samples.
Key words: liquid chromatography (LC)     online solid phase extraction (online SPE)     polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)     benzo(a)pyrene (B(a)P)     water    

多环芳烃(PAHs)对人体具有较强的致癌作用[1], 是水体中重点监测和控制的有机污染物。美国将16种PAHs列为优先控制的有毒污染物, 并基于人体摄入水和鱼类/贝类产生的健康风险, 确定苯并[a]芘(B(a)P)的水质基准值(water quality criteria)为0.000 12 μg/L[2], 规定饮用水中B(a)P的标准限值为0.2 μg/L[3]。欧盟和世界卫生组织(WHO)分别规定饮用水中B(a)P的标准限值为0.010 μg/L和0.7 μg/L[4, 5]。现阶段我国对地表水中PAHs的控制要求(GB 3838-2002)要严于国外, 规定B(a)P的标准限值为2.8 ng/L, 对生活饮用水中B(a)P和PAHs总量的标准限值(GB 5749-2006)分别为10 ng/L和2 000 ng/L。

水体中PAHs的含量往往较低(ng/L水平), 而且分析过程中易受实验室环境的污染, 因此对于分析方法的灵敏度和抗污染能力等要求很高。目前分析水中PAHs常用的富集和净化方法是液液萃取、固相萃取、固相微萃取等, 常用的仪器检测方法是液相色谱法(LC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)等[6-8]。PAHs的分析方法常需要消耗大量水样及有机溶剂, 整个分析过程操作复杂, 费时费力, 且方法容易受到污染, 产生假阳性结果。在线固相萃取法所需水样少, 有机溶剂用量少, 水样前处理和分析测试一体化, 自动化程度高, 省时省力, 可有效避免实验过程中的污染, 在对水样的分析测试中具有广阔的应用前景[9-13]。关于水中PAHs的分析, 采用在线固相萃取-LC的报道较少。陈静等[9]建立了在线固相萃取-LC检测水中20种PAHs的分析方法, 并用于自来水样品的分析测试, 但该方法的检出限(LOD)较高(0.010~0.72 μg/L), 尤其是B(a)P的检出限为0.035 μg/L, 分别是我国地表水和饮用水中B(a)P标准限值的12.5倍和3.5倍, 无法满足实际监测分析的需求。

本研究建立了在线固相萃取-LC检测水体中16种PAHs的方法, 并应用于自来水、河流水和湖泊水的分析测试, 可有效满足我国水中16种PAHs的实际监测需求。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

液相色谱(U3000, 美国赛默飞世尔科技公司), 配有在线脱气机、双三元梯度泵、自动进样器(带大体积进样组件)、柱温箱(带两位六通阀)、二极管阵列检测器(DAD)和荧光检测器(FLD); 高纯水发生器(Direct 8, 法国密理博公司); 高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。

16种PAHs混合标准品包括萘(NAP)、苊烯(ACL)、氢苊(ACE)、芴(FLU)、菲(PHE)、蒽(ANT)、荧蒽(FLT)、芘(PYR)、苯并[a]蒽(B(a)A)、䓛(CHR)、苯并[b]荧蒽(B(b)F)、苯并[k]荧蒽(B(k)F)、B(a)P、二苯并[ah]蒽(DBA)、苯并[ghi]苝(BPY)、茚[1, 2, 3-cd]芘(IND), 质量浓度均为200 mg/L，购自美国AccuStandard公司; 乙腈和甲醇(色谱纯)购自德国默克公司。

1.2 实验条件
1.2.1 标准溶液的配制

取16种PAHs混合标准品, 用甲醇逐级稀释, 分别得到0.04、0.4、4.0和16 μg/L的混合标准储备液; 取一定量的混合标准储备液, 加入6 mL洁净矿泉水和4 mL甲醇, 分别配制1.0、5.0、10、20、40、80和200 ng/L的混合标准工作液。

1.2.2 样品前处理

取10 mL水样, 置于聚丙烯离心管中, 以10 000 r/min离心10 min, 去除悬浮颗粒物, 移取6 mL上清液, 加入4 mL甲醇, 混匀, 取一定体积的混合溶液, 置于10 mL棕色进样小瓶中, 待分析。

1.2.3 在线固相萃取-液相色谱分析

在线固相萃取条件:Acclaim PA Ⅱ固相萃取小柱(50 mm×4.6 mm, 3 μm, 美国赛默飞世尔科技公司); 进样体积为2 mL; 流动相为(A)二次去离子水和(B)乙腈。泵梯度条件为0~3 min, 5%B, 1 mL/min; 3~25 min, 100%B, 0.4 mL/min; 25~34 min: 5%B, 0.4 mL/min。在线固相萃取六通阀切换示意图见图 1, 六通阀切换条件为0~3 min时, 六通阀为1-6位(position A); 3~6 min时, 六通阀切换至1-2位(position B); 6~34 min时, 六通阀切回至position A。

图 1 在线固相萃取的六通阀切换示意图 Fig. 1 Six-way valve switch schematic diagram of online SPE Position A: sample loading, SPE column balance and detection; position B: SPE column elution.

液相色谱条件:色谱柱为Hypersil Green PAH分析柱(150 mm×3 mm, 3 μm, 美国赛默飞世尔科技公司); 柱温为20 ℃; 流动相为(A)二次去离子水和(B)乙腈; 流速为0.6 mL/min。梯度洗脱程序为0~10.0 min, 50%B; 10.0~17.0 min, 50%B~100%B; 17.0~27.0 min, 100%B; 27.0~27.1 min, 100%B~50%B; 27.1~34.0 min, 50%B。紫外检测波长为220 nm。荧光检测条件见表 1。

表 1 15种PAHs的激发波长、发射波长和程序切换时间 Table 1 Excitation wavelengths, emission wavelengths and program switching times of the 15 polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)
2 结果与讨论
2.1 在线固相萃取条件的优化

选择含有Acclaim Polar Advantage Ⅱ C18填料的固相萃取小柱富集水中的PAHs。该固相萃取小柱填料嵌合有极性基团, 可兼容100%水相, 保证使用寿命。实验比较了2种填料粒径均为3 μm的固相萃取小柱(50 mm×4.6 mm和33 mm×3.0 mm)的萃取效果。结果显示, 采用50 mm×4.6 mm规格的固相萃取小柱时, PAHs的峰形较采用33 mm×3.0 mm时好, 且考虑到50 mm×4.6 mm规格的固相萃取小柱的柱容量更高, 可以萃取更高浓度的PAHs, 因此选择50 mm×4.6 mm规格的固相萃取小柱。

实验比较了采用50%(v/v)乙腈水溶液洗脱时, 不同洗脱时间(3、5和7 min)的洗脱效果。结果显示, 在3种洗脱时间下, PAHs信号响应没有显著差异, 说明经过3 min的洗脱, PAHs已从固相萃取小柱上完全洗脱。因此选择洗脱时间为3 min。

2.2 检测条件的优化

在优化的流动相洗脱条件下, 实验比较了3种色谱柱对16种PAHs的分离情况, 3种色谱柱分别为Hypersil Green PAH (150 mm×3 mm, 3 μm, 美国赛默飞世尔科技公司)、Waters PAHs C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm, 美国Waters公司)和Waters BEH Shield RP18(150 mm×2.1 mm, 1.7 μm, 美国Waters公司)。结果显示, 采用Waters BEH Shield RP18色谱柱时, 低环PAHs的峰形较差, 推测是因为色谱柱的死体积较小, 初始流动相乙腈的比例过高, 通过降低初始流动相乙腈的比例依然无法改善色谱峰形; 采用Waters PAHs C18色谱柱时, PAHs的峰宽相对较大, 峰高相对较小, 灵敏度较低; 采用Hypersil Green PAH色谱柱时, PAHs的峰形尖锐, 色谱响应较强, 因此选为实验所用。

苊烯没有荧光信号, 在220 nm波长下进行紫外检测, 而其余15种PAHs具有较强的荧光响应信号, 可通过荧光检测实现高灵敏分析。实验比较了标准方法HJ 647-2013、HJ 478-2009和文献[6]方法的荧光检测条件, 结合PAHs的出峰情况, 确定了PAHs的荧光检测条件(见表 1)。

经过色谱条件的优化, 实现了16种PAHs的基线分离和高灵敏检测, 在线固相萃取-液相色谱分析过程仅需37 min。PAHs(200 ng/L)标准工作液的荧光检测图(除ACL)见图 2。

图 2 15种PAHs(200 ng/L)的荧光检测图 Fig. 2 Chromatogram of the 15 PAHs (200 ng/L) by fluorescence detector ACL was detected by UV 220 nm with the retention time of 13.58 min.
Peaks 1-16 were the same as that in Table 1.
2.3 前处理条件的优化

由于PAHs在水中的溶解度不高, 尤其是高环PAHs, 其溶解度较低, 因此配制PAHs混合标准工作液时需在水中加入一定量的有机溶剂, 促进PAHs溶解。采用含有不同体积分数甲醇的水溶液对PAHs标准溶液进行稀释, 未经在线固相萃取, 直接进行液相色谱分析, 考察15种PAHs(不含ACL)的荧光信号响应强度(见图 3a)。结果显示, 甲醇的体积分数对NAP、ACE、FLU、PHE、ANT、FLT和PYR的信号响应影响不显著, 对B(a)A、CHR、B(b)F、B(k)F、B(a)P、DBA、BPY和IND的信号响应有较大影响, 其信号响应随甲醇体积分数的增加而增强, 尤其是对B(a)P的影响最为明显; 当甲醇的体积分数达到35%时, PAHs的信号总体上达到最大响应强度, 说明PAHs得到充分溶解。

图 3 不同体积分数的甲醇对15种PAHs信号响应的影响 Fig. 3 Effect of volume fraction of methanol on the fluorescent intensity of the 15 PAHs a. direct LC analysis without SPE; b. online SPE-LC analysis.

甲醇的体积分数除了影响标准工作液或加标样品配制时PAHs的溶解度, 还会影响PAHs在固相萃取小柱上的保留情况。水样中甲醇的体积分数过高会使PAHs无法在固相萃取小柱上聚焦和保留, 从而影响PAHs的峰形和回收率。配制含不同体积分数甲醇的PAHs(80 ng/L)加标水样, 对15种PAHs(不含ACL)的信号强度进行归一化处理, 比较其经在线固相萃取后的响应信号(见图 3b)。结果显示, 随着水样中甲醇体积分数的增加, ACE、FLU和PHE信号响应强度保持稳定(NAP峰形变差导致信号响应增加异常), 当甲醇的体积分数达到50%时, 这4种PAHs的色谱峰形较差, 影响定量分析, 继续增加甲醇的比例, 4种PAHs的信号响应依次消失, 说明它们未保留在固相萃取小柱上; 而其余11种PAHs的信号响应强度随着甲醇体积分数增加而逐渐增加, 当甲醇体积分数增加至55%时, 11种PAHs达到最大信号强度, 其中B(a)P信号响应强度增加到10倍以上, 随着甲醇体积分数的继续增加, 11种PAHs信号响应强度逐渐降低, 说明11种PAHs在固相萃取小柱上的保留逐渐减小。

综合考虑标准工作液的配制和实际水样的固相萃取, 将甲醇的体积分数统一为40%。

为查看不同水样中PAHs的荧光信号强度, 选取了4种类型的水样(二次去离子水、矿泉水、自来水、河流水), 加入一定量的PAHs混合标准工作液和甲醇, 得到含20 ng/L PAHs和40%(v/v)甲醇的水样溶液。比较4种水样中15种PAHs(不含ACL)信号响应强度的差异。结果显示, 矿泉水、自来水和河流水中PAHs的荧光信号强度差异较小, 但均高出二次去离子水信号强度的20%, 其中B(a)P荧光信号强度高出近100%。推测由于水样中的离子对PAHs荧光信号有显著增强作用, 二次去离子水中离子浓度远低于矿泉水、自来水和河流水。因此实验采用与实际水样类似的洁净矿泉水配制标准工作液, 以降低系统误差, 提高检测灵敏度。

2.4 方法学评价

对不同质量浓度(1.0、5.0、10、20、40、80和200 ng/L)的PAHs标准工作液进行分析, 每个浓度水平重复分析2次, 对PAHs的平均峰面积和相应的质量浓度进行线性拟合, 得到标准工作曲线。如表 2所示, 16种PAHs在各自范围内呈良好线性, 线性相关系数(R)均大于0.996。

表 2 16种PAHs的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和相对标准偏差 Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (R), LODs and RSDs of the 16 PAHs

对低浓度的PAHs标准工作液进行分析, 并根据1.2.2节对实际水样的前处理操作，以3倍信噪比(S/N=3)对应的浓度乘以系数1.67获得方法的检出限。结果表明, 16种PAHs的检出限为0.17~12.50 ng/L, 其中B(a)P的检出限为0.38 ng/L, 低于现行国家标准规定地表水(GB 3838-2002)和饮用水(GB 5749-2006)中B(a)P的限量值(2.8 ng/L和10 ng/L)。

分别配制质量浓度为4.0、20、80和200 ng/L的PAHs标准工作液, 重复进样6次, 考察方法的重复性(见表 2)。结果显示, 16种PAHs在4.0、20、80和200 ng/L下的RSD分别为2.3%~13.0%、0.4%~13.3%、0.9%~4.5%和0.7%~3.4%(见表 2), 说明方法的重复性良好。

2.5 实际水样分析

分别采集某城市自来水、河流水和湖泊水, 采用优化的方法进行分析。结果显示, 在3种类型的水样中只检测出萘、氢苊、芴和菲, 含量分别为54.8~69.7 ng/L、9.9~12.3 ng/L、13.6~19.5 ng/L和16.1~28.2 ng/L。

对湖泊水样进行了10、40和200 ng/L3个水平的加标回收试验, 结果见表 3。在10、40和200 ng/L加标水平下, 16种PAHs的回收率分别为76.1%~99.5%、90.7%~115.6%和107.0%~134.9%, RSD分别为0.3%~16.6%、0.4%~9.7%和0.3%~0.9%(n=3)。

表 3 实际水样中16种PAHs的含量和加标回收率(n=3) Table 3 Contents and spiked recoveries of the 16 PAHs in real water samples (n=3)

为进一步考察该方法对含更低水平PAHs的实际水样的分析性能, 尝试开展1 ng/L的加标回收试验。由于实际水样中存在部分含量相对较高的PAHs, 并且部分PAHs的检出限相对较高, 所以最后得到了B(a)A、CHR、B(b)F、B(k)F和B(a)P等5种PAHs的有效结果, 加标回收率为62.5%~99.2%, RSD为1.4%~9.1%, 其中B(a)P的加标回收率为71.8%~92.7%, RSD为3.9%, 表明该方法适用于低浓度B(a)P的分析测试, 可有效满足实际分析要求。

2.6 与其他方法的比较

水样中超痕量PAHs的分析需要较高的富集倍数才能达到满意的检出限。HJ 478-2009方法采用离线固相萃取方法富集水体中16种PAHs, 所需水样10 L, 固相萃取上样时间为33.3 h, 富集倍数为20 000倍。陈静等[9]开发的在线固相萃取分析方法中B(a)P的检出限为35 ng/L。通过比较可以看出, 本方法方便简单, 耗时短, 灵敏度高, 可有效满足对水中超痕量PAHs的测定要求。

3 结论

本文建立了测定水中16种PAHs的在线固相萃取-液相色谱分析方法。该方法具有操作简便快速、节省溶剂、对人体毒害性小、方法稳定、灵敏度高、能有效降低背景污染等特点, 可满足各类水体质量标准中PAHs, 尤其是B(a)P的超痕量监测分析的要求, 具有较大的实际应用前景。

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