兽药抗生素(veterinary antibiotics)是微生物或高等动植物在生长过程中所产生的具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产物。其中, 主要以抗菌活性强、药动学优良、选择特异性突出、临床效果显著的喹诺酮类、四环素类、β内酰胺类、大环内酯类、磺胺类和咪唑类等广谱型抗菌药为主。这些抗生素在治疗和预防动物源性疾病, 促进畜禽机体健康生长, 以及提高饲料利用效率等方面做出了巨大的贡献[1]。
抗生素的半衰期不长, 但持续过量的抗生素在动物体内大多不被畜禽充分吸收, 不完全代谢降解的残留物对自然生态的破坏和人体机能的紊乱都有着潜移默化的作用和影响[2]。复旦大学重点实验室, 在国际权威杂志《Environment International》上阐述了儿童尿液中抗生素的严重性, 并认为抗生素的暴露模式可能是促进脂肪生成并导致儿童肥胖的危险因素之一。一直以来, 国际食品法典委员会(Codex Alimentarius Commission, CAC)的MRL2-2015《食品中兽药最高残留限量标准》、欧盟的《Commission Regulation (EU) No37/2010》、美国食品药品管理局(FDA)的《CFR21食品与药品联邦法案》和我国农业部的235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》[3]等都被用来规范食品中抗生素的使用。李双等[4]对99种兽药筛查的研究以及于洁等[5]对120种抗微生物药物的讨论, 也为抗生素的监控和检测提供了新的思路。因此, 建立一套能同时准确地测定畜禽中多种抗生素残留的方法非常必要, 这对保证食品质量安全具有重要意义。
近些年, 超临界流体萃取技术(supercritical fluid extraction, SFE)、分子印迹技术(molecular imprinting polymer, MIP)、QuEChERS技术等已被报道对抗生素的净化提取效率有着显著的效果。张晓光等[6]用在线固相萃取技术结合LC-MS/MS测定了10种大环内酯抗生素, Huertas-Pérez等[7]用QuEChERS技术结合荧光色谱测定了8种磺胺类抗生素、Dorival-García等[8]用超声波及固相萃取技术结合UPLC-MS/MS来测定牛奶中的喹诺酮类和β内酰胺类抗生素。但抗生素的类别较为广泛, 不同类型的畜禽在不同时期使用的抗生素均不同, 优化一套能同时快速测定动物源性食品中的多组分抗生素残留的分析方法是提高检测效率的根本需求。
本实验探究了各类别抗生素的化学结构和极性强弱, 通过优化去除水分、蛋白质和脂肪类基质干扰物的前处理方法, 建立了一套能够囊括多类别、多组分残留的仪器分析方法, 以快速确切地鉴别和定量120种抗生素。该高通量筛查方法灵敏度较高, 重复性优良, 可对畜禽肉中抗生素含量测定标准的制定提供较为可靠的参考依据。
XEVO TQ-XS三重四极杆串联质谱仪(带电喷雾离子源(ESI))、Acquity UPLC® H-CLASS液相色谱系统(Waters公司); MSZO 204S型电子天平(瑞士Mettler Toleo公司); Centrifuge 5804高速离心机(德国Eppendorf); D-91126多管涡旋振荡器(德国Heidolph); EZ-2.3 Elite快速溶剂蒸发仪(英国Genevac); Milli-Q超纯水系统(美国Millipore)。
甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷均为色谱纯(美国Thermo Fisher Chemical); 甲酸(色谱纯, 美国ACS色谱试剂); 乙二胺四乙酸二钠(国药集团化学试剂有限公司)。
50 mL管陶瓷均质子、QuEChERS dSPE EMR-Lipid净化管(美国Agilent); Oasis®PRiME HLB(3 mL/60 mg, 美国Waters)。
本实验所用的标准品纯度均≥98%, 24种喹诺酮100 mg/L混合标准溶液、8种抗真菌100 mg/L混合标准溶液; 10种青霉素100 mg/L混合标准溶液、20种磺胺100 mg/L混合标准溶液、12种头孢100 mg/L混合标准溶液、10种大环内酯100 mg/L混合标准溶液、17种咪唑类100 mg/L混合标准溶液、氨苄西林和苯唑西林标准品(美国A ChemTek公司), 9种四环素标准品和10种咪唑类标准品(德国Dr. Ehrenstorfer公司)。
准确称取均质后的试样5.00 g(精确到0.01 g)于50 mL具塞离心管中, 加入5.0 mL Na2EDTA-Mcllvain缓冲液与两粒陶瓷均质子, 涡旋3 min至肉呈灰白色糊状; 加入10.0 mL 1.5%(v/v)甲酸乙腈, 涡旋3 min, 摇床振荡15 min, 加入5 g无水氯化钠, 涡旋2 min, 以9 000 r/min离心3 min, 收集上清液。残余物质重复上述甲酸乙腈提取步骤, 合并两次上清液, 混合均匀, 待净化。
正己烷液液萃取 将合并后的上清液转移至快速溶剂蒸发仪中, 于45 ℃、10 kPa的条件下, 浓缩至干, 加入5 mL 25%(v/v)乙腈-水定容液和5 mL正己烷, 涡旋2 min, 以9 000 r/min离心2 min, 取下层液过0.22 μm聚四氟乙烯(poly tetra fluoroethylene, PTFE)滤膜, 供UPLC-MS/MS检测。
Oasis PRiME HLB固相萃取 将合并后的上清液转移至Oasis PRiME HLB柱中, 减压过滤并保持流速为1~2滴/s, 直接收集过滤液, 转移至快速溶剂蒸发仪中, 于45 ℃、10 kPa的条件下浓缩至干, 加入5 mL 25%(v/v)乙腈-水定容液, 涡旋2 min, 过0.22 μm PTFE滤膜, 供UPLC-MS/MS检测。
QuEChERS固相萃取 取5.0 mL超纯水至QuEChERS dSPE EMR-Lipid管中进行活化, 涡旋2 min; 将合并后的上清液转移至其中, 涡旋2 min, 再依次加入3.0 g盐析剂无水氯化钠和3.0 g脱水剂无水硫酸钠, 涡旋2 min, 以9 000 r/min离心3 min, 取上清液转移至快速溶剂蒸发仪中, 于45 ℃、10 kPa的条件下浓缩至干, 加入5 mL 25%(v/v)乙腈-水定容液, 涡旋2 min, 过0.22 μm PTFE滤膜, 供UPLC-MS/MS检测。
复合式净化 将合并后的上清液转移至Oasis PRiME HLB柱中, 减压过滤并保持流速为1~2滴/s, 直接收集过滤液, 转移至快速溶剂蒸发仪中, 于45 ℃、10 kPa的条件下浓缩至干, 加入5 mL 25%(v/v)乙腈-水定容液, 再次加入3 mL正己烷溶液, 涡旋3 min, 以9 000 r/min离心2 min, 取下层液过0.22 μm PTFE滤膜, 供UPLC-MS/MS检测。
液相色谱条件:色谱柱Atlantis® T3柱(100 mm×2.1 mm, 3 μm); 柱温40 ℃; 样品室温度15 ℃; 进样体积2 μL; 流动相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液; 流动相B:乙腈; 流速0.3 mL/min。梯度洗脱程序:0~1 min, 5%B; 1~16 min, 5%B~75%B; 16~17 min, 75%B~5%B; 17~18 min, 5%B。
质谱条件:电喷雾正离子模式(ESI+), 多反应监测(MRM); 毛细管压力: 3.00 kV; 椎孔电压: 40 V; 离子源温度: 150 ℃; 脱溶剂气温度: 550.0 ℃; 脱溶剂气流速: 1 000 L/h; 反吹气流速: 150 L/h; 碰撞气流速: 0.15 mL/min; 雾化气压力: 0.7 MPa。120种抗生素的监测离子对(Q1/Q3)、去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)见表 1。
抗生素多属于极性化合物, 而肉类产品的基质干扰组分主要为脂肪类非极性物质。因此, 本实验选用了在反相色谱条件下对极性化合物分离效果更佳的Waters Atlantis T3色谱柱。Atlantis T3还可以较好地改善普通C18柱对碱性化合物分离不佳, 柱寿命短以及碱性分析物与柱填料上残留硅醇基发生次级作用导致峰形恶化的状况[9]。
乙腈、甲醇作为2种优良的极性有机溶剂, 对于120种抗生素的洗脱能力没有本质差别。但乙腈需要的柱压更小, 化合物的保留时间更稳定。同时, 微量的甲酸可以提供ESI源在Q1四极杆内离子化所需的H+, 从而提高离子化效率, 得到更好的色谱峰形和更强的灵敏度。因此以0.1%(v/v)的甲酸水溶液和乙腈作为本实验的流动相。
将配制的质量浓度为1.0 mg/L的8大类混合标准溶液分别依次通过注射泵注入质谱仪中进行参数优化。本实验的目标化合物均在[M+H]+加合离子模式下采集, 分别在Q1和Q3四极杆中优化DP和CE值, 并选取相对丰度较高的两个特征碎片离子为定量和定性离子。所有化合物离子的质谱响应均在106以上, 其中喹诺酮、抗真菌、大环内酯和咪唑类化合物的质谱响应强度较为突出, 可能是因为这几类化合物结构中含氮原子, 能够形成稳定的带电离子[10]。将包含所有化合物(质量浓度为1 mg/L)的混合标准溶液再次注入质谱仪中进行核查, 结果表明这120种化合物均能在16 min内得到良好的色谱峰形。8类抗生素代表化合物的色谱图见图 1。
现有的标准与文献中, 甲醇、乙腈和乙酸乙酯常被用来作为目标化合物的提取溶剂。其中, 甲醇由于极性过强, 提取过程中会带出较多的杂质, 增加后续净化难度, 造成干扰峰过多[11]; 而乙酸乙酯的极性相对较弱, 毒性较低, 可作为某几类化合物(磺胺、咪唑类)合适的提取溶剂, 但在120种抗生素的筛查检测过程中, 乙酸乙酯对另外6类化合物的提取效率并不理想; 乙腈极性范围宽, 分子小, 组织穿透能力强, 对糖、脂肪、蛋白质类化合物的沉淀效果较好, 同时对多数目标化合物均有较好的溶解性和较高的提取率[12]。另外, 酸能破坏基质的细胞组织结构, 使目标化合物更充分地被分离出来。微量的有机弱酸还能调节体系的pH值, 抑制化合物酸性基团的解离, 从而改变目标物在水相-有机相之间的分配比, 加强其转移到乙腈层中的效率。在有机弱酸中, 甲酸酸性强于乙酸, 本实验最终以甲酸-乙腈为基础优化提取条件。
大部分抗生素在pH 4.0到9.0之间稳定, 因此, 本实验对提取液中的甲酸体积分数(0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.5%、5.0%)进行了优化。结果表明, 随着甲酸含量的提升, 基质提取液的颜色由透明色渐变成深褐色, 说明其对基质的组织结构穿透性越来越强。但当甲酸的体积分数在2.5%以上时, 大多数抗生素的回收率显著下降, 在高浓度酸性环境中, 其较容易被酸化降解。随着甲酸体积分数的上升, 基质的次级蛋白质结构可能已经发生改变, 5%(v/v)甲酸-乙腈溶液体系已不具有很强的流动性(明胶状态), 对后续的净化过程会造成一定的影响。
喹诺酮、抗真菌和咪唑类抗生素在甲酸的梯度变化中较为稳定, 回收率没有很大的波动, 稳定在70%以上(见图 2)。磺胺和大环内酯类抗生素属于碱性化合物, 随着甲酸体积分数的上升, 溶液中的H+更容易造成磺胺类抗生素芳伯氨基结合成配位键-NH3+, 使其失活, 也会促使大环内酯双环上由羟基与去氧氨基糖缩合成的碱性苷键发生水解、内酯开环以及脱酰基反应等, 导致其回收率逐渐下降。张科明等[13]在测定猪肉中的兽药残留时也发现, 当酸度过量时, 大部分磺胺类待测物都会发生一定程度的损失, 降低提取效率。青霉素类抗生素在酸性条件下的稳定性也较差, 易受到亲电性和亲核性试剂的攻击, 致使其失效。酸性较弱时, 其电子转移引起分子重排, 转变成青霉二酸; 酸性较强时, 其分子直接裂解, 生成青霉胺和青霉醛酸。不过肉类基质中的青霉素类抗生素由纯乙腈提取的回收率也并不理想, 平均回收率不到50%, 因此, 适量的甲酸对于青霉素类抗生素的提取是必要的。头孢类抗生素中的内酰胺环结构相对于青霉素类抗生素更为稳定, 但在pH低于2.0时, 也较容易分解, 其回收率在1.5%(v/v)的甲酸乙腈条件下达到最佳, 当甲酸体积分数继续上升后, 因酸化降解回收率显著下降。值得一提的是, 在酸性有机试剂提取条件下, 部分药物回收率出现先增大后减小的趋势, 也可能是因为甲酸量的加大造成药物离子化程度增加, 当超过某临界点时, 其在高比例有机相中的溶解性逐渐减弱[14]。四环素类抗生素较为特殊, 其十分容易和蛋白质以及金属离子配合, 只有在偏酸性的环境中才能抑制配合作用。在甲酸体积分数超过1.5%时, 四环素类抗生素的回收率均可以提升至70%以上。
据文献[15]报道, 目标化合物在由甲酸乙腈提取之前, 需用超纯水对样品进行基质分散, 水具有良好的组织渗透性, 能分散样品, 涡旋匀浆后能增加溶剂与样品的接触面积, 防止样品在乙腈溶剂中紧缩成一团, 包裹住目标化合物。本实验分别考察了5 mL水、Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液以及乙酸乙酯试剂对基质的分散效果, 结果发现:乙酸乙酯由于极性低于乙腈, 且会降低体系中甲酸的离子化程度, 因此不利于大多数目标物的提取, 导致喹诺酮、四环素、β内酰胺类和大环内酯类化合物的回收率均有不同程度的下降。相反, Na2EDTA是一种良好的配合剂, 不仅能够有效分散基质, 还能竞争性地配合基质中存在的金属离子, 使四环素和部分喹诺酮类化合物游离出来, 在Na2EDTA与无机离子螯合释放出四环素后, 利用一些酸化剂来调节体系的pH值可以更进一步地促进四环素的提取效率[16]。另外, Na2EDTA的弱电离性也能促进体系的电离平衡, 抑制溶液中的酸性离子对磺胺和大环内酯类化合物的冲击。
本实验最终选择5.0 mL Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液和20 mL 1.5%(v/v)甲酸乙腈作为复合提取溶剂。基质溶液的pH值稳定在4.0左右, 满足大多数抗生素的稳定条件。四环素类抗生素的回收率提升了近25%, 在80%以上。磺胺、大环内酯和青霉素类化合物的回收率也分别提升了近15%(见图 3)。(在提取溶剂的优化过程中, 均由正己烷净化, 均在同一溶剂标准曲线下校正和比较)。
由于肉类样品的基质较为复杂, 选择合适的净化方式除去多余杂质从而降低基质效应对于提高目标物的回收率至关重要。本文考察了传统正己烷液液萃取净化以及新型的Oasis PRiME HLB柱和QuEChERS粉包的固相萃取净化效果。结果发现, 抗真菌类和咪唑类化合物在3种净化方式下都较为稳定, 但其他类抗生素由QuEChERS净化后所得的结果要小于另外两种方法(见图 4), 其中喹诺酮和大环内酯类化合物的回收率下降显著。这可能与QuEChERS粉包的主要成分有机硅烷键合硅胶对于喹诺酮和大环内酯含氮双环结构的影响有关, 也可能与QuEChERS粉包难以克服的壁面损失和吸附作用有关。由于兽药残留基质复杂, 兽药化学性质各异, QuEChERS对多类别强极性化合物的净化效果还有待被确认和完善[17]。Oasis PRiME HLB通过式固相萃取柱能有效除去蛋白质、脂肪和磷脂类基质干扰物, 相对于普通HLB固相萃取柱, 其无需活化、平衡等步骤, 操作简单, 耗时更短。结果表明, Oasis PRiME HLB柱与正己烷两种净化方式对于目标物的提取效率无明显差别, 前者对于四环素和大环内酯的净化效果略有优势, 而后者较有利于磺胺和β内酰胺类化合物。本实验进一步探究了由Oasis PRiME HLB净化浓缩定容后, 再加入3 mL正己烷进行二次除脂, 以此复合法净化后的溶液更为澄清, 其回收率要比单一的净化方式所得的结果提升6%左右(见图 4), 部分β内酰胺类目标物的峰形也得到了改善, 杂质干扰更少。实验证明, Oasis PRiME HLB与正己烷的复合净化方式在兽药的多类别、多组分残留分析中更为有效。
由于肉类基质较为复杂, 目标化合物经过净化后仍然会有基质效应存在, 需对其影响进行评估。基质效应主要是由于样品在离子化时基质成分与目标化合物相互竞争电离而导致目标化合物的质谱信号强度有不同程度的增强或减弱。本实验采用(基质标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率-1)×100%进行评价, 负值表示存在基质抑制效应, 正值表示存在基质增强效应, 绝对值越大则基质效应越强[18]。通常认为, 基质效应在±20%内为不显著[19]。结果表明, 部分喹诺酮和咪唑类化合物存在着一定的基质增强作用, 肉类基质对于其余抗生素的质谱响应强度均呈抑制状态。β-内酰胺和大环内酯类抗生素的基质减弱现象较为明显, 其他抗生素均在-17.81%~15.37%之间(见附表1, http://www.chrom-China.com)。为了降低基质效应对质谱灵敏度和重复性产生的影响, 提升检测结果的准确性, 实验采用基质匹配曲线来考察各项方法学参数。
以阴性空白样本制备6个水平的空白基质加标溶液, 以目标化合物定量离子的峰面积(Y)为纵坐标、质量浓度(X, μg/L)为横坐标绘制工作曲线。120种抗生素在1.0~ 50.0 μg/L范围内均线性良好。线性相关系数(r2)在0.995 3~0.999 9之间, 其中89种化合物在0.999 0以上。以定量离子信噪比(S/N)=3计算样品的检出限(LOD), S/N=10计算定量限(LOQ)。7种化合物的LOQ为10.0 μg/kg, 21种化合物的LOQ为5.0 μg/kg, 其余92种化合物的LOQ均不大于2.0 μg/kg (见附表1)。
取猪、牛、羊、鸡空白样品, 添加混合标准溶液, 进行96个样品(4基质×6平行×4批次, 为期1个月)的加标回收率测定。120种抗生素的加标回收率平均值在低、中、高3个水平下分别为71.5%~108.8%、72.5%~109.0%和77.7%~109.2%, 平均相对标准偏差分别为2.0%~15.3%、1.0%~10.5%和1.1%~4.5%(见表 2)。
从表 2可以看出, 牛肉、鸡肉和羊肉的结果较为理想, 回收率较高, 稳定性较强。猪肉因为脂肪类杂质含量较多, 基质效应导致整体回收率偏低5%左右, 稳定性也略有浮动, 但均满足食品质量规范技术要求。以上结果说明本方法的准确性和精密度均较为理想, 能够满足多组分、多类别抗生素的定性筛查和定量检测要求。
采用所建立的方法, 对100批次畜禽产品(猪肉35批次, 牛肉25批次, 鸡肉25批次, 羊肉15批次)进行全面的筛查分析。检出含量较高的有猪肉中的磺胺甲嘧啶(2.97±0.12) μg/kg、恩诺沙星(5.96±0.08) μg/kg; 鸡肉中的阿苯达唑-2-氨基砜(7.80±0.37) μg/kg; 羊肉中的氟康唑(7.89±0.25) μg/kg。为了验证本方法的可行性和准确性, 对阳性样品分别采用相应的国标方法进行了比较, 由GB/T 21316-2007所得出的磺胺甲嘧啶含量为(3.06±0.15) μg/kg, 由GB/T 21312-2007所得出的恩诺沙星的含量为(6.19±0.02) μg/kg, 由GB 29687-2013所得出的阿苯达唑-2-氨基砜的含量为(7.62±0.22) μg/kg, 氟康唑目前没有相应的国标方法, 本文参考张凯等[12]的方法测得氟康唑的含量为(7.62±0.14) μg/kg。由此可见, 本实验方法与其对应的标准方法结果十分接近, 并在检测时间和适用类别上更有优势, 可被用作于兽药抗生素的定性筛查和定量分析。
本文结合肉类基质特点以及8类抗生素的理化性质, 对前处理方法进行了开发, 对仪器方法进行了优化, 建立了一套复合式预处理体系-超高效液相色谱-串联质谱法, 用于同时测定畜禽肉中120种抗生素的残留。低、中、高3个加标水平下的回收率均在70%~110%之间, 且重现性良好, 能被用于对畜禽肉中绝大多数兽药抗生素的快速筛查。该方法在阳性样品的检出结果中与传统标准方法基本吻合, 且检测时间更少, 鉴定范围更广, 对于多类别、多组分的兽药抗生素的检测具有较高的参考价值。
2019,
Vol. 37 Issue (2): 162-176
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