茶叶中的游离氨基酸是茶叶化学组分中的重要组成部分, 也是茶叶品质的重要评价因子之一。大多数氨基酸都存在D型和L型两种异构体, 其中L-氨基酸是人体重要营养物质[1]。茶叶中含有20多种L型游离氨基酸, 其组成和含量将直接影响茶叶的香气和滋味。其中茶叶特有的氨基酸茶氨酸具有类似味精的鲜爽和焦糖香气[2], 可缓解茶的苦涩味, 增强其甜味[3], 也是茶叶鲜爽滋味的主要来源, 其他的氨基酸也具有各自的风味特征。因此, 茶叶中L型游离氨基酸组分分析对于茶叶品质鉴定具有十分重要的意义。
对茶叶中游离氨基酸的检测方法一直在摸索与精进中。茚三酮比色法是目前测定游离氨基酸总量的常规方法, 也是国标《茶游离氨基酸总量测定》中所采用的检测方法[4], 但该法只适用于茶叶中游离氨基酸总量的测定, 不能检测茶叶中各游离氨基酸组分的含量。氨基酸自动分析仪法应用于茶叶中氨基酸的检测已有多年历史[5-8], 但存在设备价格及仪器局限性等问题[9, 10]。经过多年发展, 柱前衍生-高效液相色谱(HPLC)法已经取得了长足的进步, 其测定精密度和准确性正向离子交换法逼近, 加之HPLC具灵敏度高、仪器普及面广、能一机多用等优势, HPLC法测定茶叶中的氨基酸正式进入广泛应用阶段[11-13], 但HPLC法的衍生化精确性及操作性等问题还有待更完善地解决[10, 12]。因此, 需寻求一种更准确、高效、快速、操作简便的方法来测定茶叶中的游离氨基酸。
液相色谱-质谱联用(LC-MS)结合了液相色谱的强大分离功能和质谱分析的高选择性、高特异性、高灵敏度、高稳定性; 样品处理简单, 分析通量高, 易于自动化; 分析复杂样品时干扰小, 数据准确度高, 可信度高, 特别适于低含量样品的检测分析。随着串联质谱(MS/MS)和电喷雾离子(ESI)源的快速发展, 使得LC-MS/MS法成为氨基酸检测的最热门分析手段之一。目前此方法在测定植物[14-17]、动物[18, 19]体内的游离氨基酸已见较多应用, 张磊等[20]应用气相色谱-质谱联用(GC-MS)与LC-MS分析筛选出茶氨酸、谷氨酸及其他与茶叶滋味密切相关的化学成分, 但还未见应用LC-MS/MS法测定茶叶中各游离氨基酸组分的研究报道。
本文通过对质谱、色谱条件和提取方法的优化, 在ESI源正离子扫描模式下检测, 建立了超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)直接测定茶叶中游离氨基酸的方法。采用该方法检测了黄化品种绿茶(九凝飞黄)、白茶(白牡丹)和红茶(英德红茶)中游离氨基酸组分的含量, 并与文献中茚三酮法和HPLC法的结果进行了对比和讨论。
UPLC/TSQ Quantum Access MAX超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(美国Thermo Fisher Scientific公司); ACE EXCEL 2U AQ色谱柱(150 mm×2.1 mm, 2 μm, 广州菲罗门公司); 分析天平(感量0.000 1 g, 瑞士Mettler Toledo公司); 超纯水系统(成都康宁实验专用纯水设备厂)。
甲醇(色谱纯, 美国Tedia公司); 乙酸铵(色谱纯, 美国Fluka公司); 甲酸(色谱纯, 德国Merck公司)。氨基酸标准品:L-天门冬氨酸(L-aspartic acid, 简写为Asp, 纯度99%, 低金属含量)、L-脯氨酸(L-proline, 简写为Pro, 纯度99%)、L-缬氨酸(L-valine, 简写为Val, 纯度99%)、L-色氨酸(L-tryptophan, 简写为Trp, 纯度99%)、L-异亮氨酸(L-isoleucine, 简写为Ile, 纯度99%)、L-亮氨酸(L-leucine, 简写为Leu, 纯度99%)、L-半胱氨酸(L-cysteine, 简写为Cys, 纯度99%)、L-赖氨酸(L-lysine, 简写为Lys, 纯度98%)、L-酪氨酸(L-tyrosine, 简写为Tyr, 纯度99%)、L-谷氨酸(L-glutamic acid, 简写为Glu, 纯度99%)、L-丝氨酸(L-serine, 简写为Ser, 纯度99%)、L-苯丙氨酸(L-phenylalanine, 简写为Phe, 纯度99%)、L-蛋氨酸(L-methionine, 简写为Met, 99%)、甘氨酸(glycine, 简写为Gly, 纯度99.5%)、L-丙氨酸(L-alanine, 简写为Ala, 纯度99%)、L-天冬酰胺(L-asparagine, 简写为Asn, 纯度99%)、L-谷氨酰胺(L-glutamine, 简写为Gln, 纯度99%)、L-组氨酸(L-histidine, 简写为His, 纯度98%)、L-精氨酸(L-arginine, 简写为Arg, 纯度99%)、L-苏氨酸(L-threonine, 简写为Thr, 纯度99%)、L-茶氨酸(L-theanine, 简写为Thea, 纯度99%)均购自上海百灵威化学技术有限公司。水为超纯水。
选用九凝飞黄(浙江紫凝黄茶有限公司)、白牡丹(福建白天鹅茶业有限公司)和英德红茶(英德英茶辉达电子商务有限公司), 按照国标[21]制备成磨碎样品。
氨基酸单体标准溶液配制:分别称取10.0 mg固体氨基酸单体标准物质, 分别用0.2%(体积分数, 下同)甲酸水溶液溶解, 配制成质量浓度为100 mg/L的标准溶液, 于4 ℃冰箱中避光保存。
氨基酸混合标准溶液配制:分别称取除Gly外的18种氨基酸及2种酰胺类标准品100.0 mg, 置于同一烧瓶, 用0.2%甲酸水溶液溶解, 配制成各氨基酸质量浓度为1 000 mg/L的混合标准溶液, 于4 ℃冰箱中避光保存。
称取5份试样, 每份取0.300 g, 置于三角锥形瓶中, 分别加入沸水、0.2%、0.4%、0.6%和1.0%甲酸水溶液各50 mL, 在沸水浴中浸提45 min。称取3份试样, 每份取0.300 g, 置于三角锥形瓶中, 分别加入0.2%甲酸水溶液、60%乙醇和85%乙醇各50 mL, 在75 ℃水浴中浸提45 min。称取1份试样, 每份取0.300 g, 置于三角锥形瓶中, 加入50 mL甲醇, 在60 ℃水浴中浸提45 min。分别过滤并定容, 过滤后的9份浸提液分别稀释200倍, 记为A1~A9;过滤后的9份浸提液分别稀释600倍, 记为B1~B9。将A1~A9和B1~B9分别用0.22 μm水相滤膜过滤, 测定。
在1.4.1节的基础上, 选取最佳提取溶剂, 分别按茶水质量(g)体积(mL)比(简称茶水比)1:50、1:75、1:100、1:150、1:200的比例浸提45 min, 分别过滤并定容, 过滤后的浸提液分别稀释200和600倍, 再用0.22 μm水相滤膜过滤, 测定。
在1.4.1和1.4.2节的基础上, 选取最佳提取溶剂和茶水比, 分别提取10、20、30、45和60 min, 分别过滤并定容, 过滤后的浸提液分别稀释200倍和600倍, 再用0.22 μm水相滤膜过滤, 测定。
经优化后确定的条件为:ACE EXCEL 2U AQ色谱柱(150 mm×2.1 mm, 2 μm); 流动相A为5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.2%甲酸), 流动相B为甲醇; 流速:0.3 mL/min; 柱温:40 ℃; 进样量:5.0 μL。梯度洗脱条件:0~4.0 min, 100%A; 4.0~4.1 min, 100%A~100%B; 4.1~7.0 min, 100%B; 7.0~10.0 min, 100%B~100%A; 10.0~15.0 min, 100%A。
离子源为ESI, 正离子模式; 雾化气为氮气; 离子喷雾电压为3 500 V; 雾化室温度为120 ℃; 离子源温度为350 ℃; 碰撞气为氩气, 压强为0.2 Pa; 扫描模式为选择反应检测(SRM)。
质谱条件的优化主要包括选择各氨基酸组分的子离子、去簇电压、碰撞能量等。稀释各氨基酸标准溶液至1 mg/L后, 用针泵进样的方式, 进质谱仪器直接分析, 通过母离子扫描, 调节碰撞能量, 获得稳定性好、信号强度高的碎片离子。共优化出除Gly之外的20种氨基酸参数, 结果见表 1。将氨基酸混合标准溶液进行检测, 得提取离子流色谱图(见图 1)。通过图 1可知, 20种氨基酸可以通过母离子、子离子和保留时间进行定性分析。
由于各氨基酸的R基不同, 各氨基酸在水中的溶解度不同, 如Arg易溶于水, 而Tyr几乎不溶于水。根据氨基酸溶于酸的特性及前人的提取研究情况[22]。选取沸水、不同浓度甲酸的水溶液、60%乙醇、85%乙醇和100%甲醇作为提取溶剂进行试验。根据各溶剂的沸点, 设定沸水浴、75 ℃水浴和65 ℃水浴。
从表 2的结果可以看出, 用不同的溶剂提取氨基酸, 浸出氨基酸总量前3的溶剂顺序为:0.2%甲酸(75 ℃水浴)＞0.2%甲酸(100 ℃水浴)＞0.4%甲酸。添加甲酸的水溶液浸提率要略高于沸水浸提, 要明显高于乙醇和甲醇溶液, 浸出率最低的溶剂为100%甲醇, 多个氨基酸组分未检出。从表 2中也可以看出, 用0.2%甲酸(75 ℃水浴)浸提时, 主要氨基酸Thea、Arg、Asp浸出率也最高。因此, 提取溶剂选择0.2%甲酸(75 ℃水浴)。
按5个不同比例的茶水比, 加入0.2%甲酸, 在75 ℃水浴中浸提45 min。由图 2可知, 茶水比对氨基酸提取影响也较为明显, 当茶水比增加时, 测得的氨基酸总量随之上升, 茶水比在1:100时, 氨基酸总量达到最高, 随后逐渐降低。Thea、Glu、Asp、Gln和Asn等主要氨基酸含量提取趋势与总氨基酸含量相同。经过分析, 确定提取茶水比为1:100。
确定提取溶剂为0.2%甲酸(75 ℃水浴)和茶水比为1:100, 在此基础上, 将磨碎试样浸提10~60 min, 共设5个参数, 结果见图 3。提取10 min时, 氨基酸溶出率已较高, 氨基酸总量可溶出87.4%。在10~45 min期间, 总氨基酸含量随着提取时间增加而增加, 在45 min时达到最高, 随后降低。Thea变化趋势与氨基酸总量变化趋势基本一致, 在45 min时达到最高, 而Arg、Glu、Gln也在45 min时溶出率最高, 因此, 选择45 min为最终浸提时间。
将7个不同质量浓度(1、10、50、100、250、500和1 000 μg/L)的混合氨基酸标准溶液分别进行检测, 用各氨基酸的峰面积对其相应的质量浓度(单位μg/L)进行回归分析, 以3倍信噪比为检出限(LOD), 以10倍信噪比为定量限(LOQ)。由于茶叶中各氨基酸含量差异很大, Thea和Arg含量非常高。因此在测定茶样时, 用稀释600倍后的提取液测定Thea和Arg, 稀释200倍后的提取液测定其他氨基酸。根据稀释后茶样中各氨基酸的含量范围, 确定20种氨基酸的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限。由表 3可知, 在茶叶中各氨基酸的含量范围内, 各氨基酸的响应值与浓度呈良好的线性关系, 其相关系数均可达0.99以上。LODs为0.001~0.011 mg/L, LOQs为0.010~0.053 mg/L。
采用标准加入法, 进行加标回收试验。分别称取0.50 g茶叶样品, 加入适量的氨基酸混合标准溶液, 根据各氨基酸定量限和茶叶中实际含有的各氨基酸浓度(Thea和Arg除外), 配制成20和10 mg/L的添加水平。按照2.2节优化的样品提取方法进行提取, 稀释200倍, 相当于最终检测样中混合标准溶液的质量浓度为100和50 μg/L。根据各氨基酸在茶样中的含量水平, 检测并计算各氨基酸的回收率(Thea和Arg除外), 结果见表 4。分别称取0.50 g茶叶样品, 加入适量的混合标准溶液, 配制成30 mg/L的添加水平, 按照2.2节优化的样品提取方法, 进行提取, 稀释600倍, 相当于最终检测样中混合标准溶液的浓度为50 μg/L, 检测并计算Thea和Arg的回收率, 结果见表 4。由表 4可知, 样品溶液中20种氨基酸的回收率为92.3%~109.2%, 方法具有较高的准确度。将10 μg/L的氨基酸混合标准溶液平行测定6次, 其结果见表 4, 可知RSDs为2.00%~9.88%, 方法具有较好的精密度。
如表 5所示, 采用上述方法检测黄化品种绿茶(九凝飞黄)、白茶(白牡丹)和红茶(英德红茶)中游离氨基酸组分的含量。数据显示, 在九凝飞黄中, Thea、Arg、Asp、Asn、Glu和Ser的含量要明显高于白牡丹和英德红茶, 白牡丹中主要氨基酸Thea、Arg、Asp、Ser等含量要明显高于英德红茶, 氨基酸总量为九凝飞黄＞白牡丹＞英德红茶。之前的研究[23, 24]表明, 白化或黄化茶树品种加工的茶叶与其他茶叶相比, 会具有较高的氨基酸含量。用茚三酮比色法[4]测定九凝飞黄氨基酸总量为6.26%, 除去两个酰胺类物质的含量, 此法检测的氨基酸总量略低于茚三酮比色法检测结果。用高效液相色谱(HPLC)法[25]检测九凝飞黄中的Thea, 测得含量为2.26%。由表 2可知, 用沸水提取时, 九凝飞黄中Thea的检测结果为2.240%, 接近HPLC法检测结果。当应用此法中优化后的提取条件进行检测时, 九凝飞黄中Thea含量为2.347%, 略高于上两者, 进一步验证了此法的准确性。
本文通过对质谱、色谱条件和茶叶中氨基酸提取方法的优化, 建立了UPLC-MS/MS直接测定茶叶中游离氨基酸的方法。与氨基酸自动分析仪法和HPLC法相比, 该方法操作简单, 不需要对茶样进行衍生化处理, 分析时间短。该法具有较高的灵敏度和准确性, 具有良好的重复性和稳定性, 可有效检测出茶叶中的20种氨基酸, 可用于检测茶叶中的游离氨基酸组分。
2019,
Vol. 37 Issue (6): 597-604 DOI: 10.3724/SP.J.1123.2018.12041 
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