中药是我国传统医学的重要组成部分, 是防治疾病的重要工具。据不完全统计, 目前全球有130多个国家和地区销售中药, 世界上近四分之一的人口使用中药。中药制剂以中医药理论为指导, 以中药为原料, 根据处方将其制成某种剂型供临床直接使用, 以达到最大限度地发挥药物疗效的目的。中药活性成分是保证临床疗效的关键, 其质量控制尤为重要。建立中药制剂指标成分的分析检测方法可为中药制剂质量控制提供保障, 同时也是中药现代化、国际化的关键^[1]。目前色谱技术被广泛应用于中药制剂产品中丹参素、甘草酸、天麻素、绿原酸、葛根素、黄芩苷、芦丁等重要指标成分和有效活性物质的分离分析^[2], 已见报道的方法包括薄层色谱法^[3]、气相色谱法^[4]、毛细管电泳法^[5], 高效/超高效液相色谱法^[6]、生物色谱法^[7]、超临界流体色谱法^[8]等。

离子迁移谱(ion mobility spectrometry, IMS)是一种利用大气压下电离形成的气相离子在电场中迁移速率的差异对化学物质进行分离和表征的分析技术, 已被广泛应用于毒品检测^[9]、公共安全^{[10, 11]}、食品及化妆品安全^[12-16]、环境监测^{[17, 18]}、药品检测^[19-23]、生命科学^[24]等相关领域。离子迁移谱的基本原理是, 待测样品在电离反应区进行电离, 产生的离子在电场力驱动下, 通过周期性开启的离子门进入漂移区, 与逆向的中性漂移气体分子不断发生碰撞, 使具有不同迁移率的离子得到分离并依次到达检测电极^{[25, 26]}。在离子迁移谱测量中, 首先要生成气相离子, 然后才能进行产物离子的分离和检测。离子迁移谱现有的离子化方式包括放射性离子化、电晕放电离子化、光致离子化、火焰离子化、电喷雾离子化等^[27]。其中, 电喷雾电离源的出现, 进一步拓展了离子迁移谱的应用范围, 可用于分析热不稳定和难挥发性化合物。特别是电喷雾电离-离子迁移谱技术已有用于中药分析领域的研究报道^[28-32]。

尽管离子迁移谱具有简单便携、成本低廉、快速灵敏等优点, 但分离能力有限, 在样品基质较为复杂的情况下, 可能存在无法满足多组分同时分离需求、离子化过程中不同物质间产生电离竞争抑制等问题。将离子迁移谱与液相色谱通过电喷雾接口联用, 离子迁移谱作为液相色谱的检测器, 弥补了液相色谱常用的紫外检测器灵敏度低、对于分子结构上缺少生色基团的化合物没有信号响应的弊端。通过测量色谱分离柱流出物得到的离子迁移谱图, 从而同时实现电喷雾电离前、基于疏水性差异和电喷雾电离后、基于离子迁移率不同的二维分离, 可为复杂样品体系的准确鉴定提供更为丰富的化学信息, 增强离子迁移谱的分析价值。液相色谱-离子迁移谱联用技术目前已应用于天然产物^[33]、药物小分子或中间体^{[34, 35]}、碳水化合物^[36]、多肽^[37]和蛋白质^[38]的分离分析。液相色谱-离子迁移谱联用在硬件设备上较之液相色谱-质谱联用仪, 具有价格成本优势, 适合现场快速检测。同时, 离子迁移谱是在常压下对气态离子进行分析而非质谱仪所需的高真空条件, 液相色谱与离子迁移谱联用的接口装置简单、易于搭建实现。

本文采用液相色谱-电喷雾电离-离子迁移谱联用技术, 建立了中药口服液中丹参素、甘草酸、天麻素、绿原酸、葛根素、黄芩苷、芦丁等7种代表性指标成分的分析方法, 并优化了液相色谱、喷雾电压、迁移管和气体预加热温度、漂移气流速等分析参数, 同时建立了指标性成分的液相色谱-三重四极杆质谱辅助确证方法, 为中药制剂质量控制和活性成分检测提供了科学有效的技术手段。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

GA2100型便携式离子迁移谱仪(美国Excellims公司), 配有电喷雾离子源、离子栅门控制器、空气过滤装置(含硫酸钙和分子筛)、高分辨率离子迁移分析器、法拉第杯检测器、VisIon仪器控制与数据处理系统, 使用前用色氨酸和柠檬酸分别在正、负离子模式下校正仪器; QuickSplit 600-PO10-04型可调节式分流器(美国Analytical Scientific Instruments公司); ACQUITY超高效液相色谱仪、Xevo TQ-MS三重四极杆质谱仪、MassLynx数据处理系统(美国Waters公司); Milli-Q Integral 5型超纯水器(美国Merck Millipore公司)。丹参素(CAS 22681-72-7, 纯度98%)和绿原酸(CAS 327-97-9, 纯度98%)购自北京中科质检生物技术有限公司; 甘草酸(CAS 1405-86-3, 纯度98%)、芦丁(CAS 153-18-4, 纯度98%)、黄芩苷(CAS 21967-41-9, 纯度98%)和天麻素(CAS 62499-27-8, 纯度98%)购自百灵威科技有限公司; 葛根素(CAS 3681-99-0, 纯度98%)购自中国食品药品检定研究院。7种标准物质用甲醇配制成1 g/L标准储备液, 使用时根据需要用甲醇稀释成混合标准工作液; 甲醇(色谱纯)购自美国Fisher公司; 色氨酸和柠檬酸购自美国Sigma-Aldrich公司, 以甲醇配成10 mg/L校正液进行仪器校正。

1.2 实验方法

实验室自行搭建的液相色谱-电喷雾电离-离子迁移谱联用实验装置示意图如图 1所示。样品溶液经液相色谱分离后导入可调节式分流器(设置分流比为50 : 1), 流出液分为两路:一路与离子迁移谱仪连接(1 μ L/min), 在喷雾电压作用下发生电喷雾离子化, 形成的离子进入离子迁移谱的迁移管内进行分离, 最终到达法拉第杯检测器, 检测得到相应测试图谱; 另一路流出液进入三重四极杆质谱仪, 在多反应监测(MRM)模式下采集7种待测物的信号, 可对离子迁移谱检测结果作进一步确证。

图 1

Fig. 1

图 1 液相色谱-电喷雾电离-离子迁移谱实验流程 Fig. 1 Schematic of the liquid chromatography-electrospray ionization-ion mobility spectrometry work flow

1.3 液相色谱分离条件

色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C₁₈(50 mm×1 mm, 1.7 μ m); 流速:50 μ L/min; 流动相A为0.5%(v/v)甲酸水溶液, B为乙腈。梯度洗脱程序:0~3 min, 5%B~10%B; 3~10 min, 10%B~80%B; 10~12 min, 80%B; 12~12.1 min, 80%B~5%B; 12.1~15 min, 5%B; 柱温:25 ℃; 样品室温度:20 ℃; 进样量:5 μ L。

1.4 离子迁移谱分析条件

电喷雾电压:2 400 V; 离子化模式:负离子模式; 迁移管电压:8 000 V; 迁移管温度:190 ℃; 气体预加热温度:190 ℃; 迁移谱宽:26 ms; Bradbury-Nielsen离子门脉冲宽度:110 μ s，电压:37 V; 漂移气流速:1.4 L/min; 排气泵抽速:1.0 L/min。7种待测物的分子式、相对分子质量和迁移时间见表 1, 离子迁移谱图见图 2。

表 1 (Table 1)

表 1 7种待测物的分子式、相对分子质量、离子化方式和迁移时间 Table 1 Formulae, relative molecular masses (Mr), ionization modes and drift times of the seven analytes Compound Formula Mr Ionization mode Drift time/ms Danshensu C9H10O5 198.17 negative 9.4 Glycyrrhizic acid C42H62O16 822.93 negative 12.2 Gastrodin C13H18O7 286.28 negative 12.6 Chlorogenic acid C16H18O9 354.31 negative 13.1 Puerarin C21H20O9 416.38 negative 14.2 Baicalin C21H18O11 446.36 negative 14.8 Rutin C27H30O16 610.52 negative 17.3

表 1 7种待测物的分子式、相对分子质量、离子化方式和迁移时间 Table 1 Formulae, relative molecular masses (Mr), ionization modes and drift times of the seven analytes

图 2

Fig. 2

图 2 7种待测物的离子迁移谱图 Fig. 2 Ion mobility spectra of the seven analytes

1.5 质谱分析条件

电喷雾离子源负离子模式; 毛细管电压:2.8 kV; 射频透镜电压:0.3 kV; 离子源温度:150 ℃; 脱溶剂气温度:500 ℃; 脱溶剂气流量:800 L/h; 锥孔气流量:50 L/h; 光电倍增器电压:650 V; 碰撞气:氩气; 碰撞气压:0.32 Pa。7种待测物的质谱分析参数见表 2, 多反应监测色谱图见图 3。

图 3

Fig. 3

图 3 7种待测物的多反应监测色谱图 Fig. 3 MRM chromatograms of the seven analytes

表 2 (Table 2)

表 2 7种待测物的质谱参数 Table 2 MS parameters of the seven analytes Compound Precursor ion (m/z) Product ion (m/z) Cone voltage/V Collision energy/eV Relative abundance/% Acceptable tolerance/% Danshensu 197.0 135.0* 15 16 100 ±20 123.1 15 18 71 Glycyrrhizic acid 821.4 351.0* 40 41 100 ±20 193.2 40 41 60 Gastrodin 285.1 123.1 10 12 48 ±25 105.0* 10 27 100 Chlorogenic acid 353.1 191.3* 16 15 100 ±50 179.2 16 17 8 Puerarin 415.1 295.1 32 21 79 ±20 267.0* 32 30 100 Baicalin 445.1 269.0* 20 18 100 ±25 113.1 20 13 25 Rutin 609.1 300.1* 38 35 100 ±20 271.2 38 50 60    * Ions with higher responses.

表 2 7种待测物的质谱参数 Table 2 MS parameters of the seven analytes

2 结果与讨论

2.1 液相色谱分离条件的优化

离子迁移谱在与液相色谱联用时, 电喷雾电离源是最为常用的接口方式, 通过高压电场产生带电液滴和待测物离子, 而后进入离子迁移谱检测。由于本实验中离子迁移谱配备的电喷雾接口没有内置的辅助气和加热模块, 因此能够耐受的流速范围较低。综合考虑适用流速、分离效率、色谱峰形以及与电喷雾接口兼容性等因素, 本研究选用了微径柱ACQUITY UPLC BEH C₁₈(50 mm×1 mm, 1.7 μ m)。经比较, 以乙腈作为流动相的有机溶剂可获得较好的色谱性能和信号响应。鉴于7种待测物均为酸性化合物, 经考察, 以0.5%(v/v)甲酸水溶液作为流动相水相可获得理想的色谱峰形和保留行为。

2.2 离子迁移谱喷雾电压的优化

喷雾电压是决定目标成分信号响应强度及离子化效果的重要参数。样品经液相色谱分离, 柱后流出液经分流器分流后, 在喷雾电压作用下产生离子, 进入离子迁移谱, 得到响应信号。本实验考察喷雾电压为1 600~2 600 V条件下, 7种中药指标成分的响应值。它们的最佳喷雾电压略有差异, 实验结果如图 4所示。综合考虑7种待测化合物各自的最佳喷雾电压值及离子化效果, 确定本方法的喷雾电压为2 400 V。

图 4

Fig. 4

图 4 不同喷雾电压下7种待测物的信号响应(n=3) Fig. 4 Signal responses of the seven analytes at various spray voltages (n=3)

2.3 离子迁移谱迁移管和气体预加热温度的优化

本研究考察了离子迁移谱迁移管和气体预加热温度对目标化合物信号强度的影响。为避免由于热交换或其他因素而导致的离子迁移时间重现性差、响应值不稳定等问题^[39], 实验在优化上述两项参数时将其设为相同值。温度过低时, 环境中水分子会对离子信号造成干扰; 温度过高会造成系统不稳定, 导致离子损失。分别考察了不同温度(160、170、180、190、200 ℃)对7种中药指标成分响应值的影响, 结果如图 5所示。综合考虑各目标化合物离子的信号强度、信号漂移时间的稳定性以及峰形, 选择190 ℃为迁移管和气体预加热温度。

图 5

Fig. 5

图 5 不同迁移管及气体预加热温度下7种待测物的信号响应(n=3) Fig. 5 Signal responses of the seven analytes at various drift tube and gas pre-heating temperatures (n=3)

2.4 离子迁移谱漂移气流速的优化

漂移气的种类和流速对离子分辨率和响应强度存在一定的影响^[40]。空气凭借稳定性强、成本低廉等优势被选用为漂移气。本研究考察了不同漂移气流速(1.2~2.2 L/min)对7种化合物分离效果和响应强度的影响, 实验结果见图 6。当漂移气流速过低时, 7种化合物的分辨率较差; 而流速太高时, 响应信号的强度降低, 原因可能是目标物被稀释, 电场力的作用被抵消, 离子难以到达检测器。经考察, 漂移气的最佳流速为1.4 L/min。

图 6

Fig. 6

图 6 不同漂移气流速下7种待测物的信号响应(n=3) Fig. 6 Signal responses of the seven analytes at various drift gas velocities (n=3)

2.5 液相色谱-电喷雾电离-离子迁移谱联用分析

在分别对液相色谱和离子迁移谱条件进行优化的基础上, 将液相色谱通过电喷雾离子源与离子迁移谱联用, 进行二维分离分析, 结果见图 7。丹参素、甘草酸、天麻素、绿原酸、葛根素、黄芩苷、芦丁可同时实现电喷雾电离前、基于疏水性差异和电喷雾电离后、基于离子迁移率不同的二维分离, 因此每种成分分别具有各自的色谱保留时间和离子迁移谱迁移时间, 用于识别确认。丹参素、甘草酸、天麻素、绿原酸、葛根素、黄芩苷、芦丁等7种中药指标性成分的检出限、定量限、线性范围、线性方程和相关系数见表 3。

图 7

Fig. 7

图 7 7种待测物的二维分离分析 Fig. 7 Two-dimensional separation and analysis of the seven analytes Peak identifications: 1. danshensu; 2. glycyrrhizic acid; 3. gastrodin; 4. chlorogenic acid; 5. puerarin; 6. baicalin; 7. rutin.

表 3 (Table 3)

表 3 7种待测物的线性方程、线性范围、相关系数(r)、检出限和定量限 Table 3 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients (r), limits of detection (LODs) and limits of quantitation (LOQs) of the seven analytes Compound Linear equation Linear range/(μg/mL) r LOD/(μg/mL) LOQ/(μg/mL) Danshensu y=0.0457x+0.0313 10-500 0.9961 2.5 10 Glycyrrhizic acid y=0.0009x+0.0392 25-1000 0.9958 10 25 Gastrodin y=0.0148x+0.0346 5-200 0.9983 2 5 Chlorogenic acid y=0.0246x+0.0832 25-500 0.9910 10 25 Puerarin y=0.0269x+0.0099 25-500 0.9950 10 25 Baicalin y=0.0400x+0.0074 25-500 0.9966 10 25 Rutin y=0.0077x+0.0033 25-500 0.9977 10 25    y: peak area; x: mass concentration, μ g/mL.

表 3 7种待测物的线性方程、线性范围、相关系数(r)、检出限和定量限 Table 3 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients (r), limits of detection (LODs) and limits of quantitation (LOQs) of the seven analytes

由于常规液相色谱柱的工作流速通常在mL/min数量级, 而电喷雾离子迁移谱能够耐受的流速范围较低, 通常在μ L/min级别, 二者之间并不匹配。离子迁移谱配备的电喷雾离子源没有专门的脱溶剂气和加热模块, 过高的进样流速会造成离子化效率降低, 离子迁移谱信号噪声增加。利用色谱柱后分流技术可以得到较低流速, 以适应电喷雾离子迁移谱的兼容要求。为了尽可能降低设置分流比所导致的样品流失, 本研究采用了内径为1 mm的微径色谱柱, 其适宜的工作流速约为50 μ L/min。但推测由于在色谱柱后分流过程中, 经过分流器流向离子迁移谱的溶液流速由分流器前的50 μ L/min降低至约1 μ L/min, 流速的骤降导致管路内压力的大幅降低, 进而导致管路内成分谱带在一定程度上发生扩散、峰形扩展, 且各谱带有同步趋同的趋势。而经过分流器流向质谱的溶液流速为49 μ L/min, 较之分流器前的流速几乎维持不变, 也几乎不会造成压力的波动, 因此谱带分布总体上延续原有状态。

2.6 液相色谱-三重四极杆质谱分析确证

本研究还开发了丹参素、甘草酸、天麻素、绿原酸、葛根素、黄芩苷、芦丁等7种指标性成分的液相色谱-三重四极杆质谱确证方法。每种目标化合物分别选择一个前体离子和对应的两个产物离子作为监测离子对, 7种待测成分的质谱分析参数见表 2。如果样品中目标化合物的离子相对丰度与浓度相当的标准溶液的相对丰度一致, 且偏差不超过表 2中对应的允许偏差, 则判断样品中含有相应的目标化合物。

2.7 样品测定

应用本方法对儿感退热宁口服液、清开灵口服液、小儿清肺化痰口服液、小儿七星茶口服液、双黄连口服液等5件中药口服液实际样品进行了检测分析。经测定, 上述中药口服液样品中, 指标性成分甘草酸的含量为730.69和841.82 μ g/mL, 黄芩苷的含量分别为4.22、6.51和13.08 mg/mL, 均达到了《中华人民共和国药典》2015版中的含量要求。

3 结论

本研究采用液相色谱-电喷雾电离-离子迁移谱联用技术, 利用离子迁移谱高分辨、快速分离以及与液相色谱分离之间具有正交性的特点, 建立了中药口服液中丹参素、甘草酸、天麻素、绿原酸、葛根素、黄芩苷、芦丁等7种指标性成分的分离分析方法。液相色谱和离子迁移谱分别基于目标化合物的疏水性和离子迁移率差异进行分离, 由此组成的二维分离体系在分离能力上可相互补充, 提高样品分离分析效率, 可为复杂样品体系的全面解析提供更为丰富的综合信息。在后续实验研究中, 将探索采用微升/纳升液相色谱与离子迁移谱联用的相关研究。

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