面皮是我国传统的特色小吃, 随着食品工业的发展, 在保留传统工艺基础上, 增加真空包装、巴氏杀菌等生产工艺, 面皮行业已逐步摆脱了无包装、保质期短的缺点, 实现了面皮产业的工业化、速食化。但在真空包装过程中, 引入复合包装材料带来的食品安全隐患, 也应引起足够的重视。复合食品包装材料的生产, 一般需要用到含有甲苯二异氰酸酯(TDI)的黏合剂, TDI极易发生水解, 生成芳香胺类化合物2, 4-二氨基甲苯[1], 相关研究表明2, 4-二氨基甲苯对黏膜、呼吸道及皮肤有刺激作用, 中毒表现有支气管炎、气管炎、喘息等, 人体长期接触可能致癌、致基因突变[2]。
方便面皮标签明示的食用方法一般包括蒸、水煮和微波3种加热方式, 其中水煮和微波加热法是将面皮连同内包装袋一起加热, 这就加快了包装材料中2, 4-二氨基甲苯向食品的迁移。本文拟建立一套高效准确的2, 4-二氨基甲苯迁移量的检测方法, 并应用于采集样本的检测, 调研目前面皮行业包装材料中2, 4-二氨基甲苯的污染情况。
针对2, 4-二氨基甲苯迁移量的检测, 从2003年国家卫生部发布的GB/T 5009.119-2003[3]到2016年发布的GB 31604.23-2016[4], 国标方法由气相色谱法已逐步向气相色谱-质谱联用的方向发展。除此以外, 还有近年来文献报道的气相色谱法[5-11]、液相色谱法[12]、气相色谱-质谱联用法[13-16]等, 但以上检测方法的前处理过程主要是利用氨基碱性的性质, 对迁移溶液碱化处理, 液液萃取将分子态的2, 4-二氨基甲苯提取至有机相。然而液液萃取的提取方式操作繁琐, 有机试剂消耗量大, 同时萃取效果也易受pH值的影响。解伟欣等[17]应用反相固相萃取技术对二氨基甲苯进行浓缩富集, 但是为了增强二氨基甲苯在反相固相萃取柱上的保留, 过柱前仍需碱化处理。因此, 简化提取操作流程依旧是目前2, 4-二氨基甲苯迁移量检测的难点。
离子交换型固相萃取技术具有针对性强、操作简单、高效、有机试剂消耗量少等优势, 目前, 将离子交换型固相萃取应用于2, 4-二氨基甲苯的检测方法暂无报道, 本文拟采用混合型强阳离子交换柱浓缩净化迁移溶液, 利用磺酸基对碱性化合物良好的保留性质, 解决在酸性条件下反相吸附剂对2, 4-二氨基甲苯无法吸附保留的问题, 简化前处理过程, 再结合GC-MS定性准确的优点, 建立一套离子交换固相萃取-气相色谱-质谱联用法测定方便面皮复合包装袋中2, 4-二氨基甲苯迁移量的检测方法。
GCMS-QP2010SE气相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司); Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司); AUTOTRACE 280固相萃取仪(美国Dionex公司); MTN-2800D氮吹仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司); DHG-9140A烘箱(上海一恒科学仪器有限公司)。
碳酸氢钠、冰乙酸为分析纯(科密欧化学试剂有限公司); 氨水为分析纯(成都市科龙化工试剂厂); 乙酸乙酯、甲醇为色谱纯(美国霍尼韦尔公司); MCX固相萃取柱(200 mg, 6 mL)、HLB固相萃取柱(200 mg, 6 mL)、C18固相萃取柱(500 mg, 6 mL), 购于美国Waters公司; 2, 4-二氨基甲苯标准品(纯度99.0%)购于德国Dr. Ehrenstorfer公司; 七氟丁酸酐(纯度98.0%)购于玛雅试剂有限公司。
2, 4-二氨基甲苯标准溶液配制:准确称取10 mg(精确至0.1 mg)2, 4-二氨基甲苯, 用乙酸乙酯定容至100 mL, 配制成质量浓度为100 mg/L的标准储备液, 于4 ℃条件下保存。用乙酸乙酯稀释至1 mg/L, 得2, 4-二氨基甲苯标准使用液。再用乙酸乙酯将标准使用液稀释成1、5、10、25、50 μg/L的标准工作液。
参照GB 31604.23-2016, 移出面皮内包装袋中全部食品, 用水冲洗内包装袋至无污物, 再用水洗3次, 淋干。按照2 mL/cm2(内表面积)装入乙酸溶液, 热封口, 置于120 ℃±5 ℃条件下恒温40 min。迁移试验结束后, 自然冷却至室温, 剪开封口, 将溶液转移至干燥烧杯中备用。
选用MCX固相萃取柱。活化溶剂:5 mL甲醇; 平衡溶剂:5 mL水; 淋洗溶剂:5 mL水; 洗脱溶剂:3 mL 5%(v/v)氨化甲醇。上样量:50.0 mL。活化流速:3 mL/min; 平衡流速:3 mL/min; 上样流速:10 mL/min; 淋洗流速:3 mL/min; 洗脱流速:3 mL/min。淋洗后吹干2 min, 待固相萃取仪运行结束后, 收集洗脱液, 混匀, 在40 ℃下氮吹至近干, 用乙酸乙酯定容至2 mL, 混匀后待衍生处理。
在上述复溶液中加入50 μL七氟丁酸酐, 轻轻混匀, 室温下衍生10 min后, 加入4 mL 20 g/L碳酸氢钠溶液, 混匀, 待静置分层后, 取有机层待GC-MS分析。
取2, 4-二氨基甲苯标准工作液2 mL, 加入50 μL七氟丁酸酐按照1.3.3节步骤进行衍生处理, 取有机层待GC-MS分析。
毛细色谱柱:DB-5MS(30 m×0.25 mm, 0.25 μm); 进样口温度:250 ℃, 进样方式:不分流; 载气(He)流速:1.2 mL/min; 程序升温:起始温度80 ℃, 保持1 min, 以15 ℃/min的升温速度至250 ℃, 保持2 min; 进样量:1 μL。
轰击电子能量:70 eV; EI源温度:200 ℃; 接口温度:280 ℃; 溶剂延迟:6 min; 选择离子:m/z 514、m/z 345和m/z 317。
七氟丁酸酐可与2, 4-二氨基甲苯上的两个氨基发生衍生化, 改善目标物的气相色谱行为。以50 μg/L的2, 4-二氨基甲苯标准溶液为样本, 以衍生产物在GC-MS上的相应强度为指标, 分析比较不同衍生条件对衍生效果的影响。
在衍生过程中, 固定其他衍生条件不变, 考察不同衍生剂用量对衍生效果的影响。取2 mL 50 μg/L的二氨基甲苯标准溶液, 分别加入30、50、80、150 μL七氟丁酸酐, 40 ℃条件下衍生10 min, 每个水平做3次平行试验, 测定结果见图 1。结果表明, 当衍生剂用量大于50 μL时, 峰面积增加不明显, 故由此确定衍生剂的添加量为50 μL。
在40 ℃条件下, 在2 mL 50 μg/L的二氨基甲苯标准溶液中添加50 μL七氟丁酸酐, 分别衍生2、5、10、15、30 min, 每个水平做3次平行试验, 测定结果见图 2。由图 2可见, 七氟丁酸酐与2, 4-二氨基甲苯的衍生化反应主要发生在前10 min以内, 10 min后数据平稳, 因此确定衍生时间为10 min。
取2 mL 50 μg/L的二氨基甲苯标准溶液, 添加50 μL七氟丁酸酐, 分别在20、30、40、60 ℃条件下衍生10 min, 每个水平做3次平行试验, 测定结果见图 3。试验发现, 随着衍生温度的提高, 峰面积相应升高, 当衍生温度超过40 ℃, 峰面积趋于稳定, 故本方法选用40 ℃作为衍生温度。
使用C18、HLB分别在4%(v/v)乙酸溶液(pH 2.5)和pH 8.0(碱化)条件下考察这两种类型的固相萃取柱对2, 4-二氨基甲苯的保留效果, 同时在4%(v/v)乙酸溶液(pH 2.5)条件下, 评价MCX小柱对2, 4-二氨基甲苯的富集能力。各类型固相萃取柱的使用方法如下:HLB和C18小柱分别以5 mL甲醇、5 mL水活化平衡, 上样50 mL(加标质量浓度50 μg/L), 用5 mL水淋洗、3 mL甲醇洗脱; MCX小柱以5 mL甲醇、5 mL水活化平衡, 上样50 mL, 用5 mL水淋洗、3 mL 5%(v/v)氨化甲醇洗脱。分别收集C18、HLB和MCX小柱的洗脱液, 氮吹至近干, 用乙酸乙酯定容至2 mL, 混匀, 加入50 μL七氟丁酸酐, 40 ℃衍生10 min后, 加入4 mL 20 g/L碳酸氢钠溶液, 混匀, 待静置分层后, 取有机层待GC-MS分析, 测定结果见图 4。
结果发现, 若将乙酸体积分数为4%的迁移溶液直接过柱, C18、HLB对2, 4-二氨基甲苯均无保留, 但是若将迁移溶液先进行碱化处理后再上样, 目标的回收率得到显著提升; 而MCX型固相萃取柱即使在酸性条件下(4%(v/v)乙酸), 目标物的回收率也非常高。分析原因, 这是因为2, 4-二氨基甲苯的分子结构是由两个氨基取代了甲苯2、4位的氢, 这使得该化合物具备了亲水和亲脂的双重特征, 由于迁移试验是在4%(v/v)乙酸溶液中完成的, 受溶液pH环境影响, 2, 4-二氨基甲苯基本以离子形态存在, 因此无法直接使用烷基柱或二乙烯苯柱对2, 4-二氨基甲苯进行保留。MCX柱属于混合型阳离子交换柱, 磺酸基对碱性化合物具有良好的保留能力, 与二乙烯苯的亲脂基团协同作用, 因此不再受pH值的影响, 可以有效地富集目标物。因此, 确定选择MCX混合型阳离子交换柱。
洗脱是固相萃取技术中的关键环节, 洗脱液用量过大会影响检测的工作效率, 用量过小会导致目标物的回收率不高。以50 mL 4%(v/v)乙酸溶液(加标质量浓度50 μg/L)模拟迁移溶液, 固相萃取柱依次经活化、平衡、上样、淋洗除杂后, 分别加入1.0、2.0、3.0、4.0 mL 5%(v/v)氨化甲醇洗脱, 考察洗脱溶剂体积对目标物回收率的影响, 结果见图 5。
结果表明, 当洗脱液体积超过3.0 mL时, 回收率达到92.28%, 且基本保持不变, 说明此时2, 4-二氨基甲苯已经完全洗脱, 因此确定洗脱液的体积为3.0 mL。
2, 4-二氨基甲苯与衍生剂七氟丁酸酐反应生成2, 4-二(七氟丁酰氨基)甲苯, 反应式见图 6。在电子轰击能量70 eV、全扫描采集模式条件下, 设置质量扫描范围为40~550 u, 2, 4-二(七氟丁酰氨基)甲苯质谱分析得到的全扫描质谱图见图 7。
2, 4-二氨基甲苯的衍生物2, 4-二(七氟丁酰氨基)甲苯的相对分子质量为514, 经离子源轰击后, 产生分子离子碎片m/z 514(失去电子)、m/z 345(失去C3F7)、m/z 317(失去电子COC3F7)等(见图 8), 根据丰度, 选择m/z 345作为定量离子, m/z 514、m/z 317为参比离子。
对质量浓度分别为1、5、10、25、50 μg/L的标准工作液按照1.4节色谱及质谱条件建立峰面积(y)与质量浓度(x, μg/L)的线性关系, 结果表明, 2, 4-二氨基甲苯在1~50 μg/L质量浓度范围内线性良好, 线性方程为y=1154x-645, 线性相关系数(r)为0.9991。选取未检出2, 4-二氨基甲苯的包装袋浸泡液为空白基质, 在5 μg/L的添加水平下, 以3倍信噪比计算方法的检出限, 10倍信噪比计算定量限, 当取样量50.0 mL, 定容体积为2 mL时, 2, 4-二氨基甲苯的检出限为0.2 μg/L, 定量限为0.6 μg/L。
在空白基质浸泡液中添加1 mg/L的2, 4-二氨基甲苯标准使用液, 配制成1、10、50 μg/L 3个水平的加标样品, 进行样品加标试验, 每个水平测定6次, 计算回收率及精密度。结果表明, 本方法的平均回收率在89.0%~94.2%之间, 相对标准偏差为1.9%~3.6%。回收率和精密度均能满足定量要求, 实验结果见表 1。
面皮行业的发展已规模化、产业化, 如陕西关中的宝鸡、西安等地, 生产企业及小作坊数量众多。使用本文建立的检测方法对采集到的67份方便面皮复合包装袋样品进行检测(样本包括陕西生产企业32家、小作坊17家、超市自封2份、辽宁3份、甘肃3份、北京2份、河北1份、山西1份、广东1份、四川2份、河南1份、福建2份等), 其中两个样品2, 4-二氨基甲苯的结果呈阳性, 分别为1.4 μg/L和0.8 μg/L, 但符合GB 9683-88《复合食品包装袋卫生标准》[18]限量要求(≤0.004 mg/L), 其余65个样品未检出2, 4-二氨基甲苯。
本文建立了离子交换固相萃取-气相色谱-质谱联用法测定方便面皮复合包装袋中2, 4-二氨基甲苯迁移量的检测方法, 采用MCX混合型阳离子交换柱, 利用其磺酸基对碱性化合物良好的保留性质, 对迁移溶液中的2, 4-二氨基甲苯进行富集和净化。该前处理方法相较已报道的2, 4-二氨基甲苯迁移量的检测方法[4-16], 无需调节迁移溶液的pH值, 迁移溶液可以直接过柱进行目标物的浓缩。该方法大幅度缩短了前处理时间, 减小了有机溶剂的使用量, 操作便捷, 结果准确可靠, 适用于方便面皮复合包装袋中2, 4-二氨基甲苯迁移量的检测。
2019,
Vol. 37 Issue (10): 1053-1058 DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.01024 
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