生殖是生物体的最基本特征之一, 是物种得以延续和进化的保证。联合国特别规划署曾在20世纪末提出, 21世纪将成为人类“生殖健康”世纪, 并向全世界人民发出增加对生殖健康问题关注度的号召。我国作为世界上最大的人口大国, 近年来也在逐步增强对生殖问题研究的投入, 特别是在基础研究领域。我国育龄人口不孕不育率已高达15%~20%，不孕夫妇约2 000万[1], 而且不能生育的夫妻呈年轻化趋势, 就诊年龄最小23岁, 最大40岁。目前, 不孕不育和出生缺陷是生殖领域的重大问题。
微流控技术是20世纪90年代初期随电子和光刻等高技术的发展而诞生的。随着微加工、微电子技术的发展, 微流控芯片系统也得到了迅猛发展, 技术也逐渐成熟, 目前已经由微流控芯片制作的操控阶段向追求合理应用和广大市场需求的生产化阶段转变, 其应用领域包括化学、生物学、物理学、医学等, 其研究对象包括小分子、蛋白质、核酸、细胞、组织、器官和模式生物等, 显示出了强大的发展前景和应用潜力[2-6]。在生殖生育研究中, 微流控研究刚刚起步, 微流控技术具有以下优势:微管道的形状和尺寸可以灵活设计, 从而更好地模拟生理环境; 微流控芯片对样品的消耗量低, 可减少样品需求量, 适用于临床样本研究; 微流控技术可以集成多个实验步骤，具有很高的集成性。
综上, 微流控技术已被应用到精子活力评价与筛选、精子的化学趋向性筛选、卵丘细胞去除、透明带移除、卵细胞定位与筛选、受精过程、早期胚胎培养以及生殖器官模拟等各个方面[7]。
利用微流控装置对精子活力进行筛选和评价的方法包括:微管道筛选、介电电泳力筛选以及层流效应筛选。Kricka等[8]制作的以硅和玻璃为材料的微管道芯片, 用于人精子计数及活力测定, 开创了在微流控芯片上进行精子活力的评价技术。1997年, Kricka等[9]对其所设计的芯片进行了改进, 利用弯曲的通道芯片评价精子活力, 通过微管道得到的结果与马克勒室检测得到的结果进行对比, 发现两种方法所得的精子活力分级结果具有良好的相关性。Fuhr等[10]利用高频电场对人的单个精子实现了捕获、定位和筛选。Schuster等[11]利用层流效应筛选活力精子, 经过筛选精子活力由44%±4.5%提高到98%±0.4%(p＜0.05), 精子的正常形态率由10%±1.05%提高到22%±3.3%(p＜0.05);然而这项技术的缺陷在于精子的回收率不高(目前进样口仅能进样40~50 μL液体, 而30 min内只能回收10~20 μL精液)。微流控精子分析可与计算机辅助精子分析(CASA)方法结合对斑马鱼精子进行准确和快速的分析, 能够快速激活精子并持续测量其运动能力, 将有助于提高精子研究的重现性, 并有助于精子库的开发[12], 说明微流控分析技术可与其他分析技术结合发挥更高的效能。
Koyama等[13]采用聚二甲基硅氧烷-玻璃复合结构的微流控芯片评价了小鼠精子在卵巢提取液中的趋化作用。该芯片具有3个对称的进样通道和3个对称的出样通道, 在一侧进样管道通入卵巢提取液, 另一侧通入空白缓冲液, 中间管道通入小鼠精液, 在中间汇合处可形成化学梯度, 实验结果表明具有化学趋向性的精子约占精子总数的7%左右。
2003年, Bahat等[14]证明了哺乳动物精子趋温性的存在。Li等[15]利用不等温的微流控芯片储液池, 通过研究不同温度范围(34.0~35.3 ℃、35.0~36.3 ℃、36.0~37.3 ℃和37.0~38.3 ℃)内的精子反应, 发现只有5.7%~10.6%的精子显示出了热反应。
临床上对健康卵母细胞的筛选主要依靠形态学上的判断, 标准是透明带完整、卵细胞饱满、细胞质透明, 这样的方法对人的依赖度较高。为了避免人为影响, Choi等[16]利用正向介电泳, 应用卵细胞膜的特性对卵细胞进行筛选, 证实移动的卵细胞比不移动的卵细胞具有更好的发育潜能, 具有高囊胚形成率(23.8% vs 10.7%, p＜0.05)和低多精入卵现象(31.1% vs 42.9%, p＜0.05)。这项技术可能为未来自动化挑选卵细胞、提高准备率, 克服人为误差提供理论参考。
卵丘细胞是聚集在卵细胞周围的颗粒细胞, 与卵细胞共同组成了卵丘-卵母细胞复合体(COC)。在进行卵胞浆内单精子注射(ICSI)等操作时, 需要去除卵丘细胞获得裸卵, 以利于精子穿刺入卵。传统去除卵丘细胞的方法包括物理去除法和化学去除法。物理去除法又包括吹吸法和涡旋振荡法, 即通过用吸管反复吹打卵丘细胞或使用涡旋振荡器产生机械力, 使卵丘细胞脱落; 而化学去除法是将COC放置在透明质酸酶溶液中消化而使卵丘细胞从卵细胞周围解离出来。微流控芯片可以结合上述两种方法, 在流体中实现卵丘细胞的去除。Zeringue等[17]利用两条呈90°、宽度小于卵细胞直径的细微通道去除卵丘细胞, 当COC进样到主管道后, 在小管道施加负压, 卵丘细胞就会被逐渐吸走, 而卵细胞保留在主管道中。这种方法和传统的涡旋振荡法相比, 具有更高的效率和更小的伤害。
与传统的静态培养方法相比, 施加微流体更有利于卵细胞的成熟, 可能原因是构建的微环境与生理环境更为接近。因此, Waiters等[18]以聚二甲基硅氧烷(PDMS)为材料制作了微流控装置, 用来培养猪卵母细胞。研究发现, 常规方法的样品用量需500 μL, 微流控通道方法的样品用量仅需8 μL, 但结果没有显著性差异, 两种方法卵母细胞的成熟率分别为51%和61%。随后, Hester等[19]报道了在PDMS和硼硅酸盐杂合材料的微管道中培养成熟猪卵母细胞用于体外受精, 结果表明, 卵裂至2-细胞期的百分率(67%)与对照组(49%)相比显著升高。Zhao等[20]报道了一种新型的夹层结构微流体芯片用于表征卵母细胞膜传输特性, 可以进行溶液置换, 对温度具有良好控制能力, 可以准确表征卵母细胞膜的温度依赖性和渗透性。
1995年, 美国宾夕法尼亚大学的Kricka等[21]首次在微流控芯片上实现了体外受精。他应用微加工方法在玻璃基底上刻蚀引导精子的管道、卵细胞受精池和精子进样池。弯曲管道对精子具有筛选作用, 只有活力较强并且可以灵活转弯的精子才能穿越管道, 最终到达卵细胞, 实现了小鼠的体外受精。然而由于精子进样量少, 受精率比常规体外受精(IVF)方法略低(48%, 常规方法65%~80%)。Suh等[22]用比传统方法更少的精液实现了微流控技术的体外受精, 当精液含量降低至2×104~8×104个/mL时, 受精率提高, 以此说明微流控技术在体外受精研究中的优越性。Cheng等[23]利用4×4的微流控阵列装置整合了包括卵母细胞的定位、精子筛选、受精和胚胎培养等试管授精所有步骤, 结果表明通过筛选通道, 小鼠的精子活性从60.8提高到96.1。Ferraz等[24]利用3D打印技术将极化和分化的牛输卵管上皮细胞制成管状模拟输卵管, 适用于活体成像并支持体外受精。
透明带去除对于嵌合体产生或转基因动物制备具有重要的意义, 目前常规的做法是采用化学移除法, 将受精卵放入酸性裂解液中, 直至看到透明带开始降解, 立即将受精卵取出放入培养基完成透明带去除。Zeringue等[25]设计了一种用以去除透明带的微流控芯片, 用两个交叉的微管道形成一个“T”形结构, 将受精卵限制在主管道的狭窄区域, 然后在横断的管道中通入裂解液, 通过微小的负压将一小部分裂解液吸入主管道, 不断冲洗胚胎，将透明带移除干净, V形的狭窄区可将裸露的胚胎引导在一起, 有利于产生嵌合体。
常规的体外培养方式通常在微升到毫升的体积内单个或成组培养胚胎, 这和体内的环境不同(输卵管液常为数微升或更少), 而微管道的优势在于每个胚胎的需要量小于1 μL[26]。有研究[27]证实, 在小体积里成组培养胚胎可能更有利于胚胎发育并使总细胞数增多, 这是因为胚胎产生的旁分泌和自分泌产物能够对自身和周围胚胎起到刺激作用, 促进胚胎的自身发育。但是在小体积内同时培养过多胚胎也不利于胚胎发育, 原因是在培养过程中代谢产生的有害产物会对胚胎发育产生不良影响。有研究[28]表明, 每个胚胎对应0.5~2 μL培养液是较为合适的比例。Raty等[29]研究了不同的管道材料(硅、PDMS和硼硅酸盐)对胚胎培养的影响, 通过和传统培养皿IVF组比较, 发现硅-硼硅酸盐管道以及PDMS-硼硅酸盐管道均能更快地发生卵裂并产生更多囊胚, 囊胚退化率更低, 显示了微管道在胚胎培养方面的优越性。胚胎培养中另一个重要问题是静态培养和动态培养孰优孰劣。在生理环境下, 由于输卵管的不断收缩, 胚胎在发育过程中应该是动态的过程, 而采用传统的微滴培养法, 胚胎一直处于静止的状态。
利用微流体可以使胚胎处于持续流动的流体环境中。Hickman等[30]比较了不同微流体环境下小鼠胚胎的发育状况。结果显示, 流速为0.1 mL/h时微管道中桑椹胚、囊胚形成率与对照组类似, 而当施以连续流体时, 桑椹胚、囊胚形成率反而下降。Huang等[31]发明了一种更接近发育中胚胎所在的体内微环境的装置, 开发了一种数字化的微流体装置。该微流控电润湿设备被用来模拟胚胎发育过程中体内的流体流动, 与传统的静态培养相比, 小鼠胚胎卵裂的发生率明显高于传统的静态培养模式。目前对于动态培养的研究尚无统一明确的结论。
人体芯片, 就目前的研究水平而言, 更确切地说是芯片仿真人体器官系统(organ-on-a-chip systems), 也称为器官芯片(organs-on-chips)[32], 是一种利用微加工技术, 在微流控芯片上制造出能够模拟人类器官主要功能的仿生系统[33]。经过近几年来的快速发展, 研究人员已经在微流控芯片上实现了众多人体器官的构建, 如芯片肝、芯片肺、芯片肠、芯片肾、芯片血管、芯片心脏以及多器官芯片等。然而在生殖器官与微环境中, 器官芯片的研究才刚刚起步, 目前生殖系统的微流控技术体外构建分为男性生殖微系统和女性生殖微系统。
Komeya等[34]在2016年报道了利用PDMS夹多孔膜芯片, 体外模拟鼠睾丸组织, 装入的老鼠睾丸组织碎片成功地维持了精子形成和睾丸激素的分泌。如图 1所示, 装置中培养的睾丸组织成功地维持了6个月的精子形成, 产生的精子可以通过微授精产生健康的后代。此外, 通过促黄体激素刺激睾丸组织可以持续产生睾酮。
Blundell等[35]利用半透膜隔开的芯片共培养了人的滋养细胞BeWo和绒毛内皮细胞(见图 2a)。培养的滋养层在动态流动条件下形成致密微绒毛, 并表达了葡萄糖转运蛋白, 即生理膜转运蛋白, 模拟了葡萄糖的生理转运过程。另一研究组[36]实现人滋养细胞株JEG-3和人脐静脉内皮细胞的共培养, 该项工作研究了葡萄糖的转运功能(见图 2b)。体外微流控胎盘模型可以为研究复杂胎盘组织的微环境提供新的方法, 并为开发以安全测试孕前的药物筛选、细菌感染和毒性作用提供有效平台[37-39]。
2012年，Chen等[40]报道了使用微流体通道与印章法培养子宫内膜基质细胞(ESCs)和人类腹膜间细胞(HPMC)来模拟腹膜后子宫内膜异位症的病理生理微环境。研究在正常和病理状态下实时监测ESCs和HPMC之间的相互作用(见图 3a)。Gnecco等[41]设计并开发了一个双室微流体装置, 该装置利用树脂多孔膜, 可以长期联合培养人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)和子宫内膜基质细胞(见图 3b), 从而体外构建子宫微环境。该报道检测和分析了子宫内膜基质细胞和内皮细胞在类固醇调节作用下的相互作用。研究结果表明, 基质细胞分化成功能性蜕膜细胞, 发现了剪切应力可促进内皮细胞骨架排列和紧密连接的形成; 子宫内膜血管间质瘤模型可持续4周对类固醇响应。这些数据表明, 腹膜生理学可能对子宫内膜异位有重要作用。
2017年, Xiao等[42]展示了一种多器官微流体系统(见图 4)。该系统在28 d产生小的卵巢卵泡, 并调控女性生殖系统月经周期激素, 为月经周期的激素信号和怀孕等的内分泌循环研究提供平台, 可用于药物发现和毒理学等研究。Choi等[43]利用海藻酸盐和胶原蛋白合成具有卵巢皮质和髓组织的卵巢微组织, 并将其应用于早期的二级前卵泡的微型化3D培养。该研究开发的仿生卵巢微组织和微流体技术, 对于改善体外培养的卵泡质量, 以及了解卵泡发育和排卵机制具有十分重要的意义, 同时有助于寻找因卵巢功能紊乱而导致不孕的治疗方法。Nagashima等[44]利用灌流微流控系统体外培养家猫和狗卵巢皮质内或卵巢皮质外分离的卵泡, 该系统是对大型哺乳动物(如猫、狗)卵巢体外培养系统进行改进的重要探索, 在生育保存、生殖毒理学和濒危哺乳动物保护等方面具有潜在的应用价值。
微生殖技术, 包括微流控芯片和器官芯片, 是通过广泛的基础科学和生物工程技术的结合而形成的。更好、更快、更准确, 更“微观”的技术是各个领域迫切的现实需求, 而微生殖技术在生殖系统研究中才刚刚起步。在未来, 研究人员可以通过整合不同组织(例如生殖系统器官、胎盘)或不同细胞类型(例如配子、肿瘤细胞)、结合生物因子(例如激素和信号分子)、利用分析化验和技术(例如微型摄像头、质谱分析等等)等多因素来研究生殖系统与疾病。微流控技术有望应用在辅助生殖、药物测试和医疗诊断上, 对生殖系统与疾病的研究具有无限潜能。
2019,
Vol. 37 Issue (9): 925-931 DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.01036 
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Vol. 37 Issue (9): 925-931 DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.01036 PDF