色谱  2019, Vol. 37 Issue (7): 712-722     DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.01042   PDF    
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孟佳
古淑青
方真
钮冰
邓晓军
郭德华
朱坚
韩芳
高效液相色谱-串联质谱法测定肉制品和调味料中7种水产品过敏原
孟佳1, 古淑青2, 方真2, 钮冰1, 邓晓军2, 郭德华2, 朱坚2, 韩芳3     
1. 上海大学生命科学学院食品工程系, 上海 200444;
2. 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心, 上海 200135;
3. 安徽出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 安徽 合肥 230022
收稿日期：2019-01-24
基金项目：国家重点研发计划项目（2018YFC1603603）；上海市中央引导地方科技发展专项项目（YDZX20173100004528）；上海市技术标准专项项目（17DZ2201100）；长三角科技合作项目（17395810102，1804b06020349）
通讯联系人：古淑青.Tel:(021)38620526, E-mail:gushuqing@sina.cn
摘要：基于高效液相色谱-串联质谱系统建立了食品中水产品过敏原的快速筛查和定量检测方法。样品经蛋白质提取、纯化、胰蛋白酶解后，利用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-Q/Exactive-HRMS）结合ProteinPilot软件，基于母离子和碎片离子谱分析，实现蛋白质和多肽的鉴定。再通过基本局部比对搜索工具（BLAST）与Uniprot数据库对比分析，筛选出南美白虾、大闸蟹、青蟹、金枪鱼、大西洋鲑鱼的7种过敏原蛋白的30个特征肽。利用高效液相色谱-三重四极杆质谱（UPLC-QqQ-MS）系统对特征肽进行验证和多反应监测（MRM）定量研究。结果表明，该方法在5~250 mg/kg范围内线性关系良好，检出限为2~3.5 mg/kg，平均回收率为88.7%~110.2%。该方法重现性好，通量高，可应用于肉制品和调味料中7种过敏原的快速筛查和定量分析。
关键词：液相色谱-串联质谱    特征肽段    水产品过敏原    肉制品    调味料    
Detection of seven kinds of aquatic product allergens in meat products and seasoning by liquid chromatography-tandem mass spectrometry
MENG Jia1, GU Shuqing2, FANG Zhen2, NIU Bing1, DENG Xiaojun2, GUO Dehua2, ZHU Jian2, HAN Fang3     
1. Department of Food Engineering, School of Life Science, Shanghai University, Shanghai 200444, China;
2. Technical Center for Animal Plant and Food Inspection and Quarantine, Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai 200135, China;
3. Technical Center for Inspection and Quarantine, Anhui Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Hefei 230022, China
Foundation item: National Key Research and Development Plan Project (No. 2018YFC1603603); Shanghai Central Guiding Local Science and Technology Development Special Project (No. YDZX20173100004528); Shanghai Technical Standard Project (No. 17DZ2201100); Science and Technology Joint Project of the Yangtze River Delta (Nos. 17395810102, 1804b06020349)
Abstract: A liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the identification of marker peptides of aquatic product allergens and quantitative detection of multiple allergens in meat products and seasonings was developed. The samples were prepared by protein extraction, protein purification, and trypsin hydrolysis. The proteins and peptides were identified using ProteinPilot by the data analysis of the ion spectrum of polypeptide fragments using ultra-performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic orbitrap high-resolution mass spectrometry (UPLC-Q/Exactive-HRMS). The identification of 30 species-specific marker peptides in Penaeus vannamei, Eriocheir, Scylla serrata, Thunnus thynnus, and Atlantic salmon by comparison of the basic local alignment search tool (BLAST) with the UniProt database was achieved. The verification and multiple reaction monitoring (MRM) quantitative studies of these marker peptides were performed using a triple quadrupole mass spectrometry (UPLC-QqQ-MS) system. The proposed method showed a good linear relationship in the range of 5-250 mg/kg. The limits of quantitation and observed recoveries were in the range of 2-3.5 mg/kg and 88.7%-110.2%, respectively. This method presents various advantages such as good repeatability and high throughput, suitability for rapid screening, and quantitative analysis of seven aquatic allergens in meat products and seasonings.
Key words: liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)     marker peptides     aquatic product allergen     meat products     seasoning    

近年来, 食物过敏已经成为一个全球性的健康问题, 由于饮食多样性及食物的复杂性, 食物过敏患病率逐年上升。西方国家最近的研究表明, 成人患病率在5%左右, 儿童患病率在8%左右[1-4]。典型的过敏症状包括引发荨麻疹、呕吐、哮喘、腹泻等, 严重者可引起过敏性休克甚至危及生命[5]。食物过敏目前没有有效的治疗方案, 在商品标签上进行明确的标注提示消费者规避是唯一的选择。然而, 由于目前各个国家和地区对食品过敏原的研究和关注水平存在较大差距, 过敏原标识管理不统一, 产品中过敏原应标未标的情况普遍存在[6]。并且, 即便标签上对已知过敏原进行了标注, 在产品加工、运输和存储过程中存在不可避免的交叉污染, 有可能带来一些隐形的未知过敏原[7]。因此, 有必要开发出一套适用于复杂食品基质的准确快速的过敏原检测方法。

水产品作为人类食物的重要来源之一, 其市场和消费群体不断扩大。与此同时, 由水产品引发的食物过敏也日益增多, 在联合国粮农组织公布的8大类过敏食物中, 水产品就占了两大类, 并且水产品是导致过敏最严重的食物之一。目前, 常用的水产品过敏原分析方法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)和聚合酶链反应(PCR)法。ELISA方法操作简便且有商品化试剂盒, 但是该方法受产品加工方式影响较大, 热加工食品由于化学或物理方法导致的蛋白质免疫化学识别受损, 会降低过敏原的检测浓度[8, 9], 造成假阴性。并且大多数试剂盒只能检测单一过敏原, 通量低且易发生交叉反应[10]。PCR方法能够通过特定的DNA对水产品过敏原进行定性和定量检测, 但是检测物是DNA而非致敏蛋白质[11-13]。基于蛋白质组学的质谱检测方法既克服了免疫学方法存在的通量低和交叉干扰的弊端, 也克服了PCR技术不能直接检测致敏蛋白质的缺点, 能够对蛋白质和多肽进行明确鉴定, 并且可以同时实现多种过敏原的定性和定量检测[14]。目前已有多种质谱方法用于水产品过敏原的检测, 包括利用四极杆-飞行时间质谱(Q/TOF)检测草虾中的过敏原精氨酸激酶蛋白[15], 利用三重四极杆质谱(QqQ)检测雪蟹中的过敏原原肌球蛋白[16], 利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)检测虾中的过敏原精氨酸激酶[17]和多种鱼类中的过敏原小清蛋白[18], 利用液相色谱-电喷雾离子阱质谱(LC-ESI-IT-MS/MS)确定完整鱼类过敏原小清蛋白[19]等。但同时确定大闸蟹、青蟹、南美白虾、金枪鱼和大西洋鲑鱼5种水产品的生物标志性特征肽段, 并对过敏原蛋白进行定量研究还未见报道。

本研究针对复杂的食品基质, 采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q/Exactive-HRMS)和超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-QqQ-MS)相结合, 筛选出大闸蟹、青蟹、南美白虾、金枪鱼和大西洋鲑鱼的主要过敏原蛋白原肌球蛋白、肌球蛋白、血蓝蛋白和小清蛋白的30个特征性多肽, 建立了基于特征肽段的水产品过敏原定量检测方法。该方法重现性好、通量高, 可用于肉制品及调味料中多种水产品过敏原的快速筛查和定量检测。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

超高效液相色谱(Dionex UltiMate 3000)-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱联用仪(Q-Exactive, Thermo Fisher, 美国); 液相色谱(Nexera X2)-三重四极杆质谱(triple quadrupole system, TQS)联用仪(MS8060, Shimadzu, 日本); 水浴锅(SW22, Julabo, 德国); 离心机(Allegra X-22R, Beckman Coulter, 美国); 高速振荡机(Eyela, 日本); 氮吹仪(Jnc, 美国)。所有实验用水由Milli-Q超纯水系统(Millipore, 美国)制得。

碳酸氢铵(纯度≥99%)、二硫苏糖醇(DTT、纯度≥99%)、碘代乙酰胺(IAA, 纯度≥99%)、氯化钙(纯度≥99%)(Sigma, 美国); 三氟乙酸(TFA, 纯度≥98%)和甲酸(98%, 色谱纯)(Fluka, 美国); 牛胰蛋白酶(测序级, Promega公司, 美国); 乙腈(色谱纯, 纯度≥99%, Thermo Fisher, 美国); 三氯甲烷(纯度≥99%, TEDIA, 美国); Tris-HCl缓冲液(1 mol/L)、Bradford蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司); 正己烷(色谱纯, 上海安谱实验科技股份有限公司); 丙酮(色谱纯, CNW, 德国); 超滤离心管(1.5 mL, Anpel, 中国); 低蛋白吸附离心管(1.5 mL, Eppendorf, 德国); 低蛋白吸附移液器吸头(0.1 mL/1.0 mL, Brand, 德国); 低蛋白吸附滤膜(0.22 μm, Agela, 美国)。南美白虾、大西洋鲑鱼、青蟹、大闸蟹和金枪鱼样品均为市售。

1.2 样品前处理
1.2.1 蛋白质提取

取2 g均质化的样品置于50 mL离心管中, 加入0.1%(体积分数, 下同)的三氟乙酸(TFA)/氯仿(1:4, v/v)进行氯仿脱脂, 涡旋震荡5 min, 以4500 r/min的速度离心3 min, 去除上清液, 以上步骤重复两次后, 氮气吹干。加入10 mL 50 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0±0.2)进行提取, 涡旋震荡1 min, 在60 ℃水浴锅中震荡1 h后, 以4500 r/min的速度离心5 min, 过膜。得到质量浓度为2.0×105 mg/L的蛋白质提取储备液。于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 蛋白质酶解

蛋白质酶解步骤与文献[20]报道相似。取200 μL上清液, 置于1.5 mL的低蛋白离心管中, 加入150 μL 500 mmol/L碳酸氢铵溶液和10 μL 500 mmol/L DTT, 混匀后置于75 ℃水浴锅恒温震荡30 min, 取出至室温后加入30 μL 500 mmol/L IAA, 放于暗处30 min后, 加入10 μL 100 mmol/L氯化钙和50 μL 500 mg/L牛胰蛋白酶溶液, 混匀后置于37 ℃恒温水浴锅中, 过夜酶解12 h, 加入10 μL甲酸终止酶解, 静置15 min后, 加水定容至1 mL, 过低蛋白吸附膜, 质谱检测。

1.3 仪器条件
1.3.1 UPLC-Q/Orbitrap-HRMS条件

色谱条件:采用Kinetex XB-C18反相色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, Phenomenex, 美国)。进样体积:5 μL; 柱温:35 ℃。流动相A为0.1%甲酸-水溶液, 流动相B为0.1%甲酸-乙腈溶液。采用梯度洗脱:0~3 min, 97%A; 3~10 min, 97%A~70%A; 10~13 min, 70%A~20%A; 13~16 min, 20%A; 16~20 min, 97%A。流速:0.2 mL/min。

质谱条件:电喷雾电离(ESI)源, 采用正离子模式; 保护气压力:206.85 kPa; 辅助气压力:68.95 kPa; 喷嘴电压:3.5 kPa; 毛细管温度:320 ℃; 辅助气温度:250 ℃; 全扫描模式; 扫描范围:m/z 300~2000;分辨率:35000。

1.3.2 UPLC-QqQ-MS条件

色谱条件:采用1.3.1节相同色谱柱。流动相A为0.1%甲酸-水溶液, 流动相B为0.1%甲酸-乙腈溶液。液相梯度洗脱程序:0~2 min, 95%A; 2~14 min, 95%A~55%A; 14~17 min, 55%A; 17~20 min, 95%A。流速:0.3 mL/min。进样体积:10 μL; 柱温:40 ℃。

质谱条件:ESI源, 采用正离子模式; 加热气:空气, 15 mL/min; 雾化气:氮气, 15 mL/min; 干燥气:氮气, 15 mL/min; 碰撞气:氩气; 源温度:300 ℃; 脱溶剂管(desolvation line, DL)温度:250 ℃; 加热模块温度:400 ℃; 制冷气温度:15 ℃; 扫描范围:m/z 50~2000;驻留时间:30 ms; 延迟时间:3 ms。

2 结果与讨论
2.1 样品前处理优化
2.1.1 蛋白质提取条件优化

由于水产品中含有一定的油脂, 为了不影响后续的酶解效果以及质谱分析, 除酯是前处理的必要步骤。除酯后一般选择pH=8.0左右的缓冲盐溶液, 于60 ℃水浴振荡提取数小时, 得到过敏原蛋白质的粗提液, 某些情况下需加入一定浓度的尿素和硫脲以增加蛋白质的溶解度, 提高提取效率[21, 22]。本文考察了除酯试剂A(正己烷)和除酯试剂B(三氟乙酸(TFA)-氯仿(4:1, v/v))、提取试剂C(50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH=8.0±0.2))和提取试剂D(6 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH=8.0±0.2))交叉组合后的提取效果。交叉组合后得到4种前处理方法, 分别为A+C、A+D、B+C和B+D。根据高分辨质谱检测特征肽段的响应值数据进行比较分析, 观察各肽段提取离子流色谱图峰面积变化情况, 如图 1所示, 每条肽段平行检测3次, 取平均值, 当前处理方式选择B+C, 即用三氟乙酸(TFA)/氯仿(4:1, v/v)除脂、50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH=8.0±0.2)提取时, 各过敏原特征肽段的检测浓度可达到最高值, 不仅操作简单, 还减少了盐类物质对仪器的损害, 适用于水产品的前处理。因此本研究选择三氟乙酸(TFA)/氯仿(4:1, v/v)作为除酯试剂, 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH=8.0±0.2)作为提取试剂。

图 1 不同前处理对5种特征肽段提取率的影响(n=3) Fig. 1 Effects of different pretreatments on the extraction ratios of the five marker peptides (n=3) A: n-hexane; B: trifluoroacetic acid-trichloromethane (4:1, v/v); C: 50 mmol/L Tris-HCl (pH=8.0±0.2); D: 6 mol/L urea, 2 mol/L thiourea, 50 mmol/L Tris-HCl (pH=8.0±0.2).
2.1.2 蛋白质酶解条件优化

对于复杂的食品基质来说, 酶解效率受多重因素的影响, 要保证酶解效率需全面优化并严格控制各实验条件。在前期的工作中, 对影响酶解条件的因素包括酶解时间、酶解促进剂等进行了考察和优化[22, 23]。本工作在前期工作的基础上, 对酶解时酶和蛋白质的量进行了优化, 用Bradford试剂盒测定蛋白质提取液的总浓度, 按照酶与蛋白质质量比为1:10、1:20、1:30、1:50、1:100考察了加酶量对酶解效果的影响, 结果表明, 当酶与蛋白质质量比为1:30时, 酶解效果最佳。同时, 为保证酶解效率的一致性, 减小基质效应对酶解效率的影响, 选用空白基质提取液配制系列标准溶液。经过优化后, 对目标水产品过敏原蛋白进行了实验验证, 相同浓度的标准溶液和基质加标溶液相应肽段的峰面积偏差＜10%(n=6)。

2.2 特征肽段
2.2.1 物种特征肽段的选择

本研究充分利用Q-Exactive高分辨质谱的优势, 采用Full MS/dd-MS2扫描模式对酶解后的样品进行全扫描, 结合二级碎片离子谱的分析, 可以实现在没有标准品的情况下, 对样品有无过敏原进行精确鉴定。通过ProteinPilot软件(Version 5.0, AB SCIEX)结合蛋白质检索数据库Uniprot, 对采集的数据和肽段理论碎片的匹配度进行验证, 根据特征肽段的选择原则[14, 20], 筛选出可能的特征肽段。最后将备选特征肽段通过BLASTP(http://www.uniprot.org/blast/)搜索实现对种属特征性多肽的筛选[24, 25]。由于食物过敏原蛋白在加热、蒸煮或焙烤过程中会发生成环、氧化、交联等各种副反应, 如果特征肽段选择的不合适、不稳定, 将会影响定性和定量结果。因此, 在选取特征肽段时, 优先选择不含漏切位点、不含甲硫氨酸、不含NXS/T的糖基化基序、不成环、无氧化、没有任何蛋白质修饰的肽段, 从而确保特征肽段的稳定性。依据肽段的选择条件和丰度信息, 选取大闸蟹、青蟹、南美白虾、金枪鱼和大西洋鲑鱼多条特征肽段(不含漏切位点、不含甲硫氨酸、不含NXS/T的糖基化基序)。

二级质谱鉴定中, 多肽经过电喷雾电离主要产生N端碎片离子(b离子)和C端碎片离子(y离子)。以金枪鱼特征肽段LVVIESDLER(m/z 960.5)为例, 如图 2所示, 图中红色和绿色谱线分别代表理论y离子和b离子的碎片峰, 蓝色谱线代表实验获得的离子碎片峰, 可以看出, 实验获得的谱图和预测的碎裂模式之间有良好的对应关系, 预期的18个b、y碎片离子中有17个得到鉴定, 试验结果与理论预测的碎裂模式高度匹配并显示了很高的置信度, 证明该肽段可用于MRM进一步分析。

图 2 金枪鱼特征肽段LVVIESDLER(m/z 960.5)的碎片离子排布实验结果与理论对比图 Fig. 2 Product ion mass spectrum of the precursor ion at m/z 960.5 assigned to the Thunnus thynnus LVVIESDLER peptide corresponding to the predicted fragmentation patterns

利用本方法筛选出南美白虾的13个特征肽段, 分别属于肌球蛋白和血蓝蛋白; 大闸蟹的5个特征肽段, 属于血蓝蛋白; 青蟹的3个特征肽段, 属于血蓝蛋白; 金枪鱼的3个特征肽段, 属于原肌球蛋白; 大西洋鲑鱼的6个特征肽段, 属于小清蛋白, 结果见表 1。针对每个特征肽段, 将Skyline软件预测的离子对列表直接导到LabSolutions中进行初步的特征肽段验证, 将检测结果导入Skyline软件排查色谱峰, 筛除未检出肽段和未检出子离子。根据肽段的碎裂模式, 氨基酸序列相近的肽段之间存在较多的相互干扰[10], 影响定性和定量结果的准确性。肽段的MS/MS碎片匹配的越多, 定性准确度越高[26]。为尽可能消除干扰, 针对每个肽段至少选择6个b、y离子对用于定性确证, 选择3个干扰最少、响应最高的子离子进行定量检测(见表 1)。

表 1 南美白虾、大闸蟹、青蟹、金枪鱼、大西洋鲑鱼的特征肽段及MRM参数 Table 1 Marker peptides and MRM parameters for Penaeus vannamei, Eriocheir, Scylla serrata, Thunnus thynnus, and Atlantic salmon
2.2.2 质谱条件的优化

目标蛋白质的定量检测主要采用MRM方式, 它的显著优点是具有较高的灵敏度和特异性, 能够在复杂的基质中对微量靶蛋白质进行精确测定。为提高检测灵敏度并增强系统稳定性, 首先优化各质谱条件。利用岛津LC-MS/MS自带的Interface软件, 生成优化气流量、温度和电压的采集方法, 利用Skyline软件自动生成优化碰撞能的采集方法。以金枪鱼特征肽段LVVIESDLER离子通路586.8297(2+)为例, 本工作考察了加热气流量、雾化气流量、接口温度、DL温度、接口压力和碰撞能量(CE)对信号响应强度的影响。当质谱加热气流量分别为5、10和12 L/min时, 结果如图 3a所示, 加热气流量为12 L/min时, 响应强度最佳。当质谱雾化气流量分别为1.5、2.0、2.5和3.0 L/min时, 结果如图 3b所示, 雾化气流量为3 L/min时, 响应强度最佳。当质谱接口温度分别为200、250、300和350 ℃时, 结果如图 3c所示, 接口温度为250 ℃时, 响应强度最佳。当质谱DL温度分别为150、200、250和300 ℃时, 结果如图 3d所示, DL温度为200 ℃时, 响应强度最佳。当质谱接口压力分别为0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 kV时, 结果如图 3e所示, 接口压力为2.0 kV时, 响应强度最佳。当质谱碰撞能量分别为8.0、11.0、14.0、17.0、20.0、23.0、26.0、29.0、32.0、35.0和38.0 V时, 结果如图 3f所示, 碰撞能量为20.0 V时, 响应强度最佳。从结果可以看出, 当加热气流量为12 L/min、雾化气流量为3 L/min、接口温度为250 ℃、DL温度为200 ℃、接口压力为2.0 kV、碰撞能量为20.0 V时肽段响应强度最高, 在该条件下生成最终的MRM定量方法。其余各肽段均采用上述方式对质谱条件进行逐一优化, 优化后的MRM方法中各物种特征肽段离子对信息如表 1所示, 优化后各物种特征肽段的提取离子色谱图见图 4。

图 3 金枪鱼特征肽段LVVIESDLER的质谱条件优化结果 Fig. 3 Optimization results of mass spectrometry condi- tions of the Thunnus thynnus LVVIESDLER peptide a. heating gas flow; b. nebulizing gas flow; c. interface temperature; d. desolvation line temperature; e. interface pressure; f. collision energy.

图 4 南美白虾、大闸蟹、青蟹、金枪鱼、大西洋鲑鱼特征肽段的提取离子流色谱图 Fig. 4 Extracted ion chromatograms for the selected marker peptides of Penaeus vannamei, Eriocheir, Scylla serrata, Thunnus thynnus, and Atlantic salmon
2.3 方法学验证

水产品中鱼虾蟹为常见的过敏原产品, 采用本方法对水产品过敏原检测进行了定量研究, 考察5种水产品的检出限、定量限、回收率等。由于过敏原蛋白标准品的缺乏, 在定量研究中, 参考文献[8, 10]报道, 选择致敏物质的蛋白质提取液作为标准品, 浓度以致敏物质的含量表示。后续定量结果也是以致敏物质的含量表示, 而不是某一种过敏原蛋白的含量。针对每个物种, 分别选择响应强度最高的一个特征肽段进行方法学考察, 如表 2和表 3所示, 每个特征肽段对应的定量离子参见表 1。

表 2 南美白虾、金枪鱼、大西洋鲑鱼、青蟹和大闸蟹的5个特征肽段的线性范围、线性方程、相关系数(r2)、检出限和定量限 Table 2 Linear range, linear equations, correlation coefficients (r2), LOD and LOQ of the five marker peptides of Penaeus vannamei, Eriocheir, Scylla serrata, Thunnus thynnus, and Atlantic salmon

表 3 南美白虾、金枪鱼、大西洋鲑鱼、青蟹和大闸蟹的5个特征肽段的平均回收率和日内精密度、日间精密度 Table 3 Average recoveries, intra-day RSDs, and inter-day RSDs of the five marker peptides of Penaeus vannamei, Eriocheir, Scylla serrata, Thunnus thynnus, and Atlantic salmon
2.3.1 方法的线性关系、定量限和检出限

从1.1节制备的标准储备液中分别取5种样品的蛋白质提取储备液, 用空白基质提取液逐级稀释至5、10、25、50、75、100和250 mg/kg, 酶解, 分别以质量浓度为横坐标, 以所选取的特征肽段峰面积为纵坐标制作标准曲线。结果如表 2所示, 5种特征肽段在5~250 mg/kg内呈良好的线性关系, 各标准曲线相关性系数均大于0.99。以3倍和10倍信噪比(S/N)确定方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ), 南美白虾、金枪鱼、大西洋鲑鱼和大闸蟹的检出限和定量限分别为2和5 mg/kg, 青蟹的检出限和定量限分别为3.5和10 mg/kg。

2.3.2 回收率和精密度

为了验证方法的准确性和重现性, 在空白肉类样品基质中分别添加1、2、5和10倍LOQ水平的蛋白质提取液, 酶解后用质谱检测, 采用标准曲线定量计算加标回收。测定日内精密度时, 每个水平单独加标3次, 按照样品前处理步骤进行酶解后, 每份样品进样检测3次; 测定日间精密度时, 连续测定3天中, 每个水平加标1次, 酶解后, 每个样品平行检测3次。结果见表 3, 平均加标回收率为88.7%~110.2%, 日内精密度不大于8.2%, 日间精密度不大于13.1%, 证明该方法具有较高的准确度和稳定性, 使用该方法能够较为可靠地测定水产品中5种所选过敏原成分的含量。

2.4 实际样品检测

为验证所建立分析方法的适用性, 确保本方法可以应用于实际样品的检测, 在市场上选购45种肉制品和调味料样品, 通过MRM方法检测不同商品中是否含有7种水产品过敏原。由于实际样品的复杂性, 蛋白质定性要同时满足两个条件:对于每种蛋白质, 表 1列出的所有特征肽段都要有检出; 对于每个特征肽段, 至少有6个b、y离子匹配上。对可能存在的过敏原蛋白进行定性确证后, 再进行定量检测。结果见表 4。在未明确标明致敏信息的商品中, 有5种肉制品、6种调味料均检测出了水产品过敏原。

表 4 5种特征肽在45种市售食品中的测定 Table 4 Determination of the five types of marker peptides in 45 commercial foods
3 结论

本文建立了一种同时检测食品中多种水产品过敏原的高效液相色谱-串联质谱方法, 结合UPLC-Q/Exactive-HRMS和UPLC-QqQ-MS, 共筛选出5种水产品中7种过敏原蛋白的30个特征肽段, 并且建立了以特征肽段为分析对象的食品中水产品过敏原的定量检测方法。该方法重现性好、通量高, 能同时对肉制品和调味料中的南美白虾、金枪鱼、大西洋鲑鱼、青蟹和大闸蟹中的7种过敏原进行快速筛查和定量分析。本方法采用经典蛋白质组学原理进行过敏原检测, 为水产品过敏原的确证和定量提供了可靠的技术平台, 可作为传统ELISA、PCR方法的有益补充。

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