随着消费者对于绿色功效性化妆品的推崇, 化妆品研发人员越来越多的从天然植物中寻找原料。目前, 部分植物提取物中的功能性成分在改善皮肤外观、调理皮肤状态、养发护发等方面具有显著作用, 已被广泛应用于各类化妆品中[1, 2]。然而, 我们在利用天然植物的有效成分时, 必须去除与功能成分并存的有毒活性物物质。例如，乌头中的乌头碱(aconitine)、次乌头碱(hypaconitine)和新乌头碱(mesaconitine)等二萜类型生物碱能麻痹感觉神经和中枢神经, 毒害心肌细胞, 导致心脏中毒而危害生命[3]。茄科植物中的阿托品(atropine)和东莨菪碱(scopolamine), 属于莨菪烷型生物碱, 具有散瞳、抑制腺体分泌和大脑皮质的作用[4]；马钱子中主要的有毒成分为番木鳖碱(brucine)和士的宁(strychnine), 会对中枢神经系统产生影响, 甚至造成肾脏和心肌损伤[5]。化妆品安全技术规范(2015年版)[6]明确规定化妆品中禁止使用东莨菪碱、番木鳖碱、乌头碱、秋水仙碱(colchicine)、阿托品和士的宁。因此, 建立化妆品中有毒生物碱的检测方法, 对于保障化妆品的安全, 为国家化妆品质量监测提供技术支撑, 对完善化妆品的风险监测技术体系具有重要意义。
目前, 测定生物碱的方法主要有高效液相色谱法[7, 8]、超临界液相色谱法[9, 10]、液相色谱-串联质谱法[11-15]、气相色谱-串联质谱法[16]、薄层色谱法[17]和毛细管电泳法[18]。其中, LC-MS/MS以其灵敏度高、适用范围广、选择性和特异性好等优点, 成为检测多种生物碱最为常见的方法。范素芳等[11]建立了LC-MS/MS测定食品中15种有毒生物碱的方法, 并对植物源饮料、粮食及果蔬中15中生物碱进行了定量检测。张春华等[15]建立了LC-MS/MS同时检测尿液和胃液中12种有毒生物碱的方法, 优化了前处理过程和LC-MS/MS条件, 探讨了质谱碎裂机理。目前，LC-MS/MS测定多种生物碱的基质多集中在中草药材[5, 7-9]、食品[11]、血液[12]、胃液和尿液[15]等生物制品, 化妆品相关的检测研究较少。本研究采用超声波提取技术结合高效液相色谱-串联质谱法建立了一种同时测定化妆品中东莨菪碱、番木鳖碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、秋水仙碱、阿托品、士的宁、喜树碱(camptothecin)和毛果芸香碱(pilocarpine)10种生物碱的检测方法。该方法前处理操作简单, 检测灵敏度高, 适用于化妆品中10种有毒生物碱的安全风险筛查和定量检测。
Triple Quad 6500三重四极杆质谱仪, 配有电喷雾电离(ESI)源(美国AB Sciex公司); 岛津20A高效液相色谱仪(日本岛津公司); 3K15高速冷冻离心机(美国Sigma公司); P300H超声波清洗器(德国Elma公司); VORTEX 3涡旋混匀仪(德国IKA公司)。
乙腈、乙醇、甲醇均为色谱纯(美国Fisher公司); 正己烷为分析纯(北京化学试剂公司); 甲酸为色谱纯(美国Supelco Analytical公司); 实验所用水均为屈臣氏蒸馏水(屈臣氏集团(香港)有限公司); 10种生物碱标准品(纯度≥99%)购于上海源叶生物科技有限公司; Oasis MCX固相萃取阳离子交换柱(60 mg/3 mL)购于美国Waters公司。
标准溶液的配制:称取10种生物碱标准品10 mg, 分别置于100 mL容量瓶中, 用50%(v/v)乙醇水溶液溶解配制成100 mg/L的标准储备液, 储存于4 ℃冰箱。
混合标准储备溶液:分别准确移取上述标准储备溶液各1 mL, 置于100 mL容量瓶中, 用甲醇定容至刻度, 配制成质量浓度均为1.0 mg/L的10种生物碱混合标准储备溶液, 于4 ℃避光保存。
水剂类化妆品和膏霜乳液类化妆品(水包油)样品:准确称取试样约1.0 g, 置于50 mL具塞塑料离心管中, 准确加入15 mL 80%(v/v)甲醇水溶液, 涡旋分散均匀后, 超声提取15 min, 用80%(v/v)甲醇水溶液定容至20 mL, 以9 000 r/min离心10 min, 移取上清液, 过微孔滤膜, 待测定。
膏霜乳液类化妆品(油包水)样品:准确称取试样约1.0 g, 置于50 mL具塞塑料离心管中, 加入5 mL正己烷, 分散均匀后, 准确加入20 mL 80%(v/v)甲醇水溶液, 超声提取15 min, 以9 000 r/min离心10 min, 弃去上层正己烷后, 移取下层清液, 过微孔滤膜, 待测定。
色谱柱:Waters BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm); 柱温:30 ℃; 流动相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液, 流动相B:乙腈; 流速:0.30 mL/min; 梯度洗脱程序:0~2.0 min, 10%B; 2.0~6.0 min, 10%B~25%B; 6.0~23.0 min, 25%B; 23.0~23.1 min, 25%B~10%B; 23.1~25.0 min, 10%B。进样量:2 μL。
离子源:ESI源, 正离子模式; 离子源温度:500 ℃; 喷雾电压:5.5 kV; 气帘气压力:0.21 MPa; 雾化气压力:0.34 MPa; 辅助气压力:0.34 MPa; 扫描模式:多反应监测(MRM)模式。10种生物碱的其他质谱参数见表 1。
生物碱的溶解性能是设置提取方法的重要依据, 传统提取生物碱的方法有水、酸水、醇类和亲酯性有机物提取等[19]。10种生物碱存在极性差异, 在溶解性上也存在差异, 如秋水仙素碱和阿托品易溶于水, 但番木鳖碱和喜树碱不溶于水, 溶于甲醇和乙醇等有机溶剂。为更好地从化妆品中提取出10种生物碱, 考察了水剂类化妆品为基质时, 乙醇-水(50:50, v/v)甲醇-水(50:50, v/v)和乙腈-水(50:50, v/v)的提取效果。经3种提取液提取后所得的回收率结果见图 1a。结果表明, 用甲醇-水(50:50, v/v)提取时, 毛果芸香碱、番木鳖碱、的士宁、阿托品和乌头碱的回收率明显高于另外两种提取溶剂。虽然喜树碱用甲醇-水(50:50, v/v)提取的回收率较另外两种溶剂的提取回收率低, 但是回收率也达到了80%。综合比较, 实验选用甲醇水体系作为提取溶剂。
实验继续考察了体积分数分别为30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%的甲醇水溶液的提取效果。通过图 1b的结果分析, 对于不易溶于水的番木鳖碱、的士宁和喜树碱而言, 随着甲醇比例的增加, 3种生物碱的回收率也逐渐增加, 当甲醇的体积分数升至80%以后, 3种生物碱的回收率为97.5%~102.9%。其他7种生物碱的回收率随甲醇比例变化不明显, 回收率为90.0%~103.3%。因此最终选择80%(v/v)的甲醇水溶液为提取溶剂。
化妆品的基质复杂, 含有大量的表面活性剂和脂溶性物质, 并且生物碱类物质在化妆品中的含量较低。因此, 为提高检测的灵敏度, 本实验拟采用阳离子交换固相萃取柱[20]对样品进行净化、浓缩, 选择水剂类化妆品型爽肤水为基质, 10种生物碱的添加水平为100 μg/kg, 考察10种生物碱的回收率。结果表明, 经阳离子交换柱后, 秋水仙碱未检出; 毛果芸香碱、喜树碱回收率低于60%, 番木鳖碱的回收率为75.6%, 其他6种生物碱的回收率为86.3%~110.7%。说明阳离子固相萃取柱不适合目标物的净化, 最终样品前处理过程不考虑采用固相萃取净化。
对比了3种色谱柱Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm)、Thermo Accuore-150 C18(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm)和资生堂Capcell PAK(100 mm×2.1 mm, 2 μm)对10种生物碱的分离效果。结果表明, 使用BEH C18色谱柱时, 10种生物碱实现了基线分离, 峰形良好, 峰响应也较高; 使用Accuore-150 C18色谱柱时, 番木鳖碱和阿托品没有基线分离; 使用Capcell PAK色谱柱时, 10种生物碱峰形良好, 但峰面积偏小。因此实验后续选择BEH C18色谱柱。
实验考察了采用0.1%(v/v)甲酸水溶液或10 mmol/L乙酸铵溶液为流动相A、乙腈为流动相B对10种生物碱色谱行为和离子化程度的影响。实验发现, 当流动相为10 mmol/L乙酸铵溶液-乙腈时, 毛果芸香碱的峰形较宽且拖尾严重, 士的宁和番木鳖碱不能基线分离, 并且喜树碱的响应值特别低。当流动相为0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈时, 各种目标物的信号响应高, 尤其是喜树碱的响应强度有明显增高, 峰形尖锐对称, 分离度能满足检测要求。因此实验采用0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈体系作为流动相。
10种生物碱的化学结构中都含有杂环原子, 在电喷雾电离源、正离子模式(ESI+)下易得到一个H+, 形成[M+H]+准分子离子峰。选择ESI+模式对100 μg/L的10种生物碱混合标准溶液进行质谱条件的优化。采用全扫描的方式确定各分析物的母离子, 通过调整气帘气压、辅助气压、喷雾气压和离子源温度等参数, 使各标准物质的[M+H]+准分子均可达到较高的响应值。采用二级质谱扫描方式选择响应较高的2个碎片离子, 优化碰撞能和去簇电压值等参数。最终选定母离子和2个特征子离子进行定性分析, 选择其中响应值高的子离子的作为定量离子。10种生物碱标准物质优化后的质谱参数见表 1，总离子流色谱图见图 2。
本实验评价了化妆品基质对10种生物碱离子化效果的影响。通过公式ME=A/B×100%评价其基质效应。其中, A表示空白基质液配制的标准溶液的响应值; B表示80%(v/v)甲醇水溶液配制的标准溶液的响应值。当ME大于100%时, 表示存在基质增强效应; 当ME小于100%时, 表示存在基质抑制效应; 当ME等于100%时, 表示不存在基质效应。实验测定了两种溶液配制的20 μg/L混合标准溶液的离子响应强度比值, 平行测定3次。结果表明, 阿托品和东莨菪碱在3种化妆品中均有明显的基质抑制效应, 10种生物碱的平均基质效应为56.2%~98.7%。因此本实验选用空白基质的提取液配制标准溶液进行定量。
用空白基质提取液将10种生物碱混合标准储备液逐级稀释成0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/L的混合标准工作液, 在上述确定的分析条件下测定, 平行测定3次。以各生物碱定量子离子的质谱峰面积为纵坐标(Y), 混合标准工作液的质量浓度为横坐标(X, μg/L)进行回归分析, 得到线性回归方程。结果表明, 10种生物碱化合物在各自的范围内线性关系良好, 相关系数(R2)均大于0.99。采用标准添加法来确定方法的检出限和定量限, 以3倍和10倍信噪比下各待测物的质谱响应值计算化妆品基质中10种生物碱的检出限和定量限, 结果见表 2。
分别向空白水剂类化妆品和膏霜乳液类化妆品样品中添加中1倍、2倍和6倍定量限的标准品, 每个水平重复测定6次。按照1.3节方法提取并分析, 计算10种生物碱的加标回收率和相对标准偏差(见表 3)。结果显示, 10种生物碱在膏霜乳液、水剂类化妆品基质的平均加标回收率为70.91%~116.75%, RSD为0.49%~9.98%, 满足标准检测方法的要求。
实验考察10种生物碱在提取溶液中放置24 h内的稳定性。在空白水剂类化妆品样品中添加待测物, 添加水平分别为阿托品12.5 μg/kg, 次乌头碱和新乌头碱25.0 μg/kg, 其他50.0 μg/kg。按照1.3节方法提取后, 放置0、4、8、12、16、20和24 h后分别测定提取溶液中10种生物碱的峰面积, 并计算其相对标准偏差。结果表明, 在24 h内提取溶液中10种生物碱峰面积的相对标准偏差为1.25%~9.02%, 符合检测要求。
应用本方法对市场上20种含植物成分的化妆品(5种面霜、5种爽肤水、5种洗发水和5种乳液)进行检测。结果表明, 实际样品中10种生物碱均未检出。
将本研究建立的分析方法应用于膏霜乳液和爽肤水等化妆品中10种有毒生物碱的检测, 均可获得满意的回收率和重复性。本方法前处理简单, 灵敏度高, 为相关机构对化妆品中有毒生物碱禁用组分的风险监控提供有力的技术支撑。
2019,
Vol. 37 Issue (9): 977-982 DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.01054 
PDF
2019,
Vol. 37 Issue (9): 977-982 DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.01054 PDF