色谱  2019, Vol. 37 Issue (9): 1019-1025     DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.02010   PDF    
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陈婷
续艳丽
张文
闫君
彭涛
全自动QuEChERS样品制备系统结合高效液相色谱-串联质谱法检测植物源性食品中34种农药残留
陈婷, 续艳丽, 张文, 闫君, 彭涛     
兰州市食品药品检验所, 甘肃 兰州 730050
收稿日期：2019-02-21
基金项目：甘肃省食品药品监督管理局青-科技创新项目（2018GSFDA045）；兰州市2017-第四批科技计划项目（2017-4-25）
通讯联系人：续艳丽, Tel:0931-2312065, E-mail:864093439@qq.com
摘要：建立了全自动QuEChERS样品制备系统结合高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）同时检测植物源性食品中34种农药残留的分析方法。方法利用全自动QuEChERS样品制备系统涡旋振动和离心功能，将手动QuEChERS方法中样品提取和分散固相萃取相结合；优化了操作参数及前处理步骤，在多反应监测（MRM）模式下检测，基质匹配外标法定量。从方法学验证角度对全自动QuEChERS法与手动QuEChERS法进行了比较。结果表明：该方法中大多数农药在一定范围内呈现良好的线性关系，相关系数（R2）均大于0.99，检出限为0.76~3.60 μg/kg，定量限为2.28~10.80 μg/kg，加标回收率为53.0%~125.2%，相对标准偏差（RSD） < 15.9%（n=5）。该方法与手动QuEChERS法的方法验证比对结果显示差异不明显，用于植物源性食品中多农药残留检测可有效降低劳动强度和出错概率。
关键词：高效液相色谱-串联质谱    全自动QuEChERS样品制备系统    农药残留    植物源性食品    
Determination of 34 pesticide residues in plant-derived foods by automated QuEChERS sample preparation system combined with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
CHEN Ting, XU Yanli, ZHANG Wen, YAN Jun, PENG Tao     
Lanzhou Institutes for Food and Drug Control, Lanzhou 730050, China
Foundation item: the Youth Science and Technology Innovation Project of Gansu Food and Drug Administration (No. 2018GSFDA045); the Fourth Batch of Lanzhou Science and Technology Plan Program in 2017 (No. 2017-4-25)
Abstract: An analytical method for the determination of 34 pesticide residues in plant-derived foods was established using an automated QuEChERS sample preparation system combined with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). The sample extraction and dispersive solid-phase extraction in the manual QuEChERS method were combined using the vortex vibration and centrifugation functions of the automated QuEChERS sample preparation system. The operating parameters and pretreatment steps were optimized, and the analytes were detected in the multiple reaction monitoring (MRM) mode. The quantification analysis was performed by the matrix-matched external standard method. The automated and the manual QuEChERS methods were compared from the methodological verification standpoint. The calibration curves showed good linearity in a certain range, and the correlation coefficients (R2) were greater than 0.99. The limits of detection and limits of quantification were 0.76-3.60 μg/kg and 2.28-10.80 μg/kg, respectively. Moreover, the recoveries ranged from 53.0% to 125.2%, and the relative standard deviations (RSDs) were less than 1.59% (n=5). The results obtained by the manual QuEChERS method were not significantly different from those obtained by the automated QuEChERS method. This method can effectively reduce the labor intensity and probability of error in the determination of pesticide residues.
Key words: high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)     automated QuEChERS sample preparation system     pesticide residues     plant-derived foods    

近年来, 随着科技的快速发展和人类生活水平的不断提高, 人们对食品安全问题越来越重视。我国作为农药生产和使用大国, 农药在农作物的增产增收方面发挥着重要作用[1], 但大量农药的不合理应用, 已对生态环境和人体健康造成极大威胁, 农药残留作为食品安全中的突出问题[2, 3], 备受广大民众关注。一些国际组织, 如国际食品法典委员会和欧盟也已制定了食品中农药残留的最大残留限量(MRLs), 并不断开发新的技术方法加强对食品中农药残留的检测工作[4, 5], 确保食品安全和保障人类健康。

农药种类繁多、理化性质各异, 涉及的样品基质复杂, 农药残留在测定之前, 需经过萃取、净化、浓缩等复杂的前处理步骤, 因此建立一种高效、快速、安全、成本低廉的多残留前处理方法具有重要意义。目前, 农药残留检测样品的前处理方法主要有凝胶净化色谱法(GPC)[6]、基质固相分散萃取法(MSPD)[7]、固相萃取法(SPE)[8]等, 这些方法虽然有效, 但是前处理过程消耗大量有机试剂, 耗时且耗力, 在检验检测中的应用存在一定局限性。由Anastassiadas等[9]提出的QuEChERS技术, 因其简单、快速、高效等优点, 已成为农药残留快速前处理技术的首选。目前相关研究主要集中在对QuEChERS技术的优化方面, 如通过不断优化提取溶剂、分散固相萃取净化剂的种类和加入量等[10-13], 充分实现操作的方便性和良好的重复性, 而对改进QuEChERS前处理操作方式的研究较少。据统计, 农药残留检测样品前处理的时间约占整个检测时间的2/3[14], 其中手动QuEChERS处理由于人员操作差异会加大实验结果的不稳定性, 影响检验结果的准确性, 因此需要一种更为快速高效的操作方式来进行QuEChERS前处理。

因此, 本文通过评估和验证全自动QuEChERS样品制备系统, 建立植物源性食品中多种农药残留的前处理方法, 并结合高效液相色谱-串联质谱技术进行定性及定量检测, 对手动QuEChERS法和全自动QuEChERS法同时测定不同基质中多农药残留含量进行了比较, 为植物源性食品安全评估检测工作提供技术支持。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

Waters Iclass/Xevo TQD高效液相色谱-串联质谱仪(配有电喷雾电离(ESI)源、三重四极杆线性离子阱质量分析器及MassLynx 4.1工作站, 美国Waters公司); Centrifuge 5810R高速离心机(德国Eppendorf公司); VORTEX-5涡旋混匀器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司); ME204/02电子天平(美国梅特勒公司); KS501摇床(德国IKA公司)。

SiO-6512 QuEChERS全自动样品制备系统(配有涡流振动离心机、12位均质离心转子、均质分离工作站)购自北京Ability公司。

乙腈、丙酮、甲醇(色谱纯, 德国Merck公司); 实验用水(美国Millipore公司); 提取剂包(4.0 g无水硫酸镁、1.0 g氯化钠、1.0 g柠檬酸钠、0.50 g柠檬酸二钠)、无水硫酸镁、N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB)、聚丙烯整合管、ZrO2珠包(北京Ability公司); 34种农药标准品(纯度≥95%, 德国Dr. Ehrenstorfer公司)。

1.2 标准溶液的配制

标准储备液的配制:精密称取10 mg(精确至0.01 mg)农药标准品, 分别置于10 mL容量瓶中, 根据标准品的溶解性和测定的需要, 选用丙酮或者甲醇稀释并定容至刻度, 于-18 ℃避光保存待用。

混合标准工作液:根据每种农药在检测器上的响应值, 准确移取一定体积的农药, 分别置于25 mL容量瓶中, 用甲醇稀释并定容至刻度, 配制成质量浓度为1~350 μg/L的混合标准工作液, 于4 ℃避光保存。取阴性样品制备空白基质溶液, 过0.22 μm微孔滤膜后, 于4 ℃保存备用。

1.3 实验方法
1.3.1 手动QuEChERS方法

准确称取10 g试样(含水量＞10 g/100 g)或2 g试样(含水量≤10 g/100 g)(精确至0.01 g), 置于50 mL离心管中, 加入10.0 mL乙腈、提取剂包、1颗陶瓷均质子, 剧烈振荡10 min, 以3900 r/min离心5 min, 吸取6 mL上清液, 置于内含净化剂(通用净化剂为0.6 g MgSO4、0.1 g PSA; 茶叶等颜色较深的样品净化剂为0.6 g MgSO4、0.1 g PSA、0.02 g GCB)的QuEChERS净化管中, 涡旋混匀1 min, 以3900 r/min离心5 min, 准确吸取1.0 mL上清液, 过0.22 μm微孔滤膜, 待LC-MS/MS测定。

1.3.2 全自动QuEChERS方法

准确称取10 g试样(含水量＞10 g/100 g)或2 g试样(含水量≤10 g/100 g)(精确至0.01 g), 置于整合管外管, 依次加入5 mL超纯水、ZrO2珠包(24粒)、10.0 mL乙腈、提取剂包。将装有净化剂(同1.3.1节)的内管置于整合管中, 将整合管放入SiO-6512主机中, 运行。运行方法为以1100 r/min振动5 min; 以4000 r/min离心10 min; 以1100 r/min振动5 min; 以4000 r/min离心5 min。程序结束后取出整合管, 准确吸取1.00 mL上清液, 过0.22 μm微孔滤膜, 待LC-MS/MS测定。

1.4 分析条件
1.4.1 色谱条件

色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm); 柱温:30 ℃; 流动相:(A)乙腈和(B)0.1%(v/v)甲酸水溶液; 流速:0.3 mL/min。梯度洗脱:0~0.5 min, 5%A; 0.5~8.5 min, 5%A~95%A; 8.5~10.0 min, 95%A; 10.0~12.0 min, 5%A。进样量:1.0 μL。

1.4.2 质谱条件

离子源:ESI源, 正离子模式; 离子源温度:150 ℃; 扫描方式:多反应监测(MRM)模式; 去溶气温度:400 ℃; 去溶气流速:850 L/h; 毛细管电压:3.00 kV; 锥孔电压:45 V; 碰撞气:高纯氩气(99.999%)。34种农药的质谱参数见表 1。

表 1 34种农药的保留时间(RT)及质谱参数 Table 1 Retention times (RTs) and MS parameters of the 34 pesticides
2 结果与讨论
2.1 流动相的选择

比较了甲醇-水、甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液和乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液3种流动相对各化合物分离效果的影响(见图 1)。结果显示:甲醇-水作为流动相时, 抑霉唑、噻菌灵色谱峰拖尾, 烯酰吗啉、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐无响应, 原因是水相条件下不利于目标化合物的电离, 减弱了目标化合物在色谱柱上的保留性, 从而降低了灵敏度; 甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液为流动相时, 氧乐果、多菌灵分离效果较差, 烯酰吗啉响应明显降低; 乙腈-0.1%(v/v)甲酸水除个别化合物响应略低外, 其余化合物与采用甲醇-0.1%(v/v)甲酸水时差别不大。甲酸的加入明显提高了灵敏度, 且乙腈与甲醇相比具有更强的反相洗脱能力, 在保证目标化合物响应值和分离度的前提下优化了目标化合物的色谱峰形。因此本实验选择乙腈-0.1%(v/v)甲酸水作为流动相。

图 1 采用不同流动相时34种农药的总离子流色谱图 Fig. 1 Total ion chromatograms of the 34 pesticides with different mobile phases a. methanol-water; b. methanol-0.1% (v/v) formic acid aqueous solution; c. acetonitrile-0.1% (v/v) formic acid aqueous solution.
2.2 前处理条件的优化
2.2.1 样品加水量

依据欧洲标准[15]中采用QuEChERS法提取农药时的含水量要求, 适量的含水量有利于目标农药的提取, 可显著提高被提取农药的回收率。通过调整样品加水量考察含水量对被测样品检测结果的影响。本实验取阴性样品马铃薯(含水量＞10 g/100 g)10 g和大米(含水量≤10 g/100 g)2 g, 分别加入0、5、10和15 mL水, 按1.3.2节处理后进样, 并计算加标回收率(见图 2)。结果表明:不添加水时, 马铃薯和大米试样中各农药组分加标回收率均不稳定, 且含水量较少的大米试样经处理后进入净化管的上清液体积少于1 mL, 不利于后续上机实验; 加水量为5 mL时, 各农药加标回收率在70%~120%范围内的农药数量明显增多; 当加水量超过5 mL时, 会造成QuEChERS提取剂包过载, 影响液液分配效率, 导致回收率过高或过低。对于含水量较少的大米试样, 为达到较好的回收率, 称取10 g需相应提高加水量, 但水量过高会造成整合管过载且不利于后续提取。因此, 综合考虑不同食品含水量的差异, 对于含水量＞10 g/100 g的试样选择每10 g试样加水5 mL, 含水量≤10 g/100 g的试样选择每2 g试样加水5 mL, 以保证所有农药都能获得较好的回收率。

图 2 不同加水量对马铃薯和大米中34种农药回收率的影响 Fig. 2 Effects of the different water addition on the recoveries of the 34 pesticides in potatoes and rice
2.2.2 提取转速与时间的优化

QuEChERS全自动样品制备系统将提取、离心及净化过程整合, 使其在尽可能短的时间内从复杂的基质中高通量分析农药残留。实验对第一阶段振荡转速和提取时间进行了优化, 选取振荡转速700、900和1100 r/min, 提取时间2、3、5和8 min, 进行实验组合处理(见表 2), 分析不同实验组对各目标化合物回收率的影响。结果表明, 当振荡转速为1100 r/min时, 提取5 min足以获得满意的回收率, 当提取时间继续增加后, 回收率并没有明显的提高。因此选择振荡转速1100 r/min, 振荡时间5 min。

表 2 实验方案设计 Table 2 Experimentation design
2.3 基质效应(ME)

本实验通过比较橘子、茶叶、大米、马铃薯、洋葱空白基质溶液配制的混合标准溶液与乙腈配制的混合标准溶液的斜率, 评价基质效应[16]。公式为ME=(mmatrix-msolvent)/msolvent×100%。其中, mmatrix、msolvent分别为基质标准曲线和溶剂标准曲线的斜率。当|ME|＜20%时可忽略不计; 当|ME|为20%~50%时表示有基质效应; 当|ME|＞50%时表示基质效应较强。实验结果可以看出, 全自动QuEChERS法的基质效应与手动QuEChERS法差别较小, 绝大多数农药的ME值为负数，表现出基质抑制作用。在全自动QuEChERS法中, 约70%的农药表现出较低的或可忽略的基质效应, 25%表现出中等强度基质效应, 5%表现出较强基质效应; 而手动QuEChERS法中, 约60%的农药表现出较低的或可忽略的基质效应, 30%表现出中等强度基质效应, 10%表现出较强基质效应。本实验采用对应的基质配制标准曲线进行校正, 一定程度上减弱了基质效应对目标化合物的影响。

2.4 方法的线性范围、检出限及定量限

本实验用橘子阴性样品基质配制不同质量浓度的混合标准溶液, 以化合物的质量浓度为横坐标(x, μg/L)、定量离子对的峰面积为纵坐标(y)建立标准曲线。向阴性样品中添加标准曲线最低浓度的混合标准溶液, 在本文优化的前处理方法和仪器条件下, 通过调整各目标化合物的添加浓度, 得到各目标化合物响应为3倍和10倍信噪比(S/N)时对应的含量, 作为检出限(LOD)和定量限(LOD)。结果显示:目标化合物在一定范围内具有良好的线性关系, 手动QuEChERS法和全自动QuEChERS法相关系数(R2)均大于0.99。手动QuEChERS法LOD为0.81~3.90 μg/kg, LOQ为2.43~11.70 μg/kg; 全自动QuEChERS法LOD为0.76~3.60 μg/kg, LOQ为2.28~10.80 μg/kg, 相比手动QuEChERS法, 全自动QuEChERS法的检出限及定量限均低于手动QuEChERS法, 结果见表 3。

表 3 采用手动和全自动QuEChERS法时34种农药的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限 Table 3 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (R2), LODs and LOQs of the 34 pesticides by manual or automatic QuEChERS
2.5 方法的回收率及精密度

采用全自动QuEChERS方法, 选用不含待测农药的阴性样品马铃薯和大米, 向其中添加10.0、50.0和100.0 μg/kg 3个水平的混合标准溶液, 每个加标水平做5次平行试验, 计算样品加标回收率, 结果见表S1(详见http://www.chrom-China.com)。各农药回收率为53.0%~125.2%, RSD＜15.9%。

为了验证不同基质的回收率效果, 选用不含待测农药的阴性样品(橘子、绿茶、大米、马铃薯、洋葱), 分别向其中添加50.0 μg/kg水平的混合标准溶液, 对手动QuEChERS法和全自动QuEChERS法进行比较(见图 3)。结果表明, 在橘子、大米、绿茶及洋葱中, 采用全自动QuEChERS法时农药的回收率略高于手动QuEChERS法; 而在马铃薯中, 采用手动QuEChERS法时农药的回收率略高于全自动QuEChERS法, 可能是由于基质效应或含水量差异的影响。除噻虫嗪外, 全自动QuEChERS法与手动QuEChERS法相比大部分农药的回收率差异不大, 均能满足回收率要求。相比手动QuEChERS法, 全自动QuEChERS法在满足实验室日常检测的同时能够降低劳动强度, 节约时间, 提高检验效率。

图 3 采用全自动和手动QuEChERS法时5种基质中农药(50.0 μg/kg)回收率的箱线图 Fig. 3 Boxplot of the recoveries of pesticides (50.0 μg/kg) in five matrices using the automated and manual QuEChERS method
2.6 实际样品检测

为了进一步验证方法的可行性, 应用所建立的全自动QuEChERS法对市售豇豆、芒果、大米等植物源性食品中34种农药残留进行了检测。结果在豇豆、芒果、辣椒和芹菜中分别检出多菌灵、氧乐果、克百威和烯酰吗啉, 且含量与手动QuEChERS法相近, 相对误差＜17.3%(见表 4)。

表 4 实际样品检测结果 Table 4 Test results of real samples
3 结论

本文利用全自动QuEChERS样品制备系统结合LC-MS/MS, 建立了针对植物源性食品中34种农药的定性定量检测方法, 与手动QuEChERS法比较, 大部分农药回收率差异不大, 但全自动QuEChERS方法实现了化合物提取与净化一步完成, 方法时间短、人为影响因素小, 在保证检验结果准确性的同时大大提高了检测效率。通过方法学考察和加标回收试验, 表明该方法具有良好的回收率和精密度, 可作为农药残留检测的参考方法应用于日常检测中。

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