木质素(lignin)是一种无定型、三维天然高分子聚合物, 是植物细胞壁中3大主要组分之一, 约占细胞壁总含量的10%~35%, 是自然界唯一能巨量提供可再生芳基化合物的生物质资源。鉴于天然高分子木质素结构的复杂性和惰性, 将木质素解聚转化为低相对分子质量物质是最有效的应用木质素的途径[1]。由于真实木质素经催化转化获得的解聚产物为复杂的混合物体系, 解聚后样品由于存在显著的基质效应[2, 3], 色谱分离和质谱检测条件又很难协同优化, 而且气相色谱-质谱联用(GC-MS)或液相色谱-质谱联用(LC-MS)在检测未知化合物方面都具有一定的局限性, 使得迄今仍未建立起对于木质素解聚程度和解聚效率可靠的定量分析评价方法。目前对木质素的解聚研究[4-8]大多还是以模型化合物为研究对象, 采用氧化催化或金属盐催化解聚, 通过GC-MS或核磁分析方法检测有限的低相对分子质量目标酚类产物。由于模型化合物与真实木质素结构的差异性, 其结果很难用于指导真实的木质素的解聚研究[1]; 而对已商业化的真实木质素的解聚研究也主要集中在以木质素磺酸盐及硫酸盐为研究对象, 通过氧化催化解聚, 分析单一的香草醛或几种酚类目标化合物[9-13]。因此, 建立系统对真实木质素解聚产物的分离和表征技术已成为高效转化木质素、解聚机理研究以及木质素结构化学研究优先要解决的关键问题。
测定木质素解聚产物的平均相对分子质量及相对分子质量分布, 是评价解聚木质素结构与其物理特性的重要指标之一。凝胶渗透色谱(GPC)是一种广泛应用并行之有效的聚合物表征方法, 也已被广泛地应用在分析测试木质素相对分子质量的研究中[14-18], 如Stahl课题组[15]采用传统GPC分析了催化解聚酶解木质素的醋酸乙酯提取后不溶物, 对比了解聚前木质素和解聚后木质素残渣的相对分子质量。本文作者[18]也采用超高效凝胶渗透色谱(advanced polymer chromatography, 简称APC)水性柱分析了酸催化木质素磺酸盐解聚前和解聚后残渣的相对分子质量, 通过对比解聚前后木质素的相对分子质量变化初步确定解聚的程度。但由于多数催化解聚研究主要采用高温高压条件, 催化解聚过程中可能使部分产物炭化, 影响分离效果, 也导致木质素解聚产物组成异常复杂, 致使将传统的GPC技术直接用于木质素解聚后酚类产物的研究很难开展。本文在前期酸催化解聚木质素磺酸盐的工作中, 采用温和的无金属催化剂条件, 获得了相对易于分离的流动性好的解聚产物。利用该解聚产物易于分离的优势, 以此解聚产物为研究对象, 选用测试低聚物具有高分辨率高分离度优势[19]的串联ACQUITY APC XT油溶性小孔径小粒径刚性填料柱, 通过探索优化色谱测试条件, 建立了APC快速分离测试和分析酸催化木质素解聚后获得的酚类产物的方法, 并采用该技术方法探讨了酸催化解聚木质素磺酸盐的解聚行为。
超高效聚合物色谱系统包括ACQUITY APC等度溶剂管理器, ACQUITY APC样品管理器, ACQUITY单区间柱管理器, ACQUITY示差(refractive index, 简称RI)检测器, ACQUITY紫外(UV)检测器(美国Waters公司)。Nicolet380傅里叶转换红外光谱仪(美国Nicolet公司)
商业木质素磺酸钠(sodium lignosulfonate, 简称SL), 重均相对分子质量(Mw)为5×104 Da, 磺酸盐含量约20%;苯酚、盐酸、硫酸、醋酸乙酯、乙腈、四氢呋喃和乙腈均为分析纯, 由西陇化工股份有限公司提供。用于色谱测试的其他溶剂均为色谱级。
采用四氢呋喃(tetrahydrofuran, 简称THF)提取解聚木质素磺酸盐的产物, 使用聚苯乙烯标样做标准曲线, 以pH为7.5的四氢呋喃作流动相, 采用4根油溶性的ACQUITY APC XT色谱柱串联, 包括1根孔径为200 nm的色谱柱(150 mm×4.6 mm, 2.5 μm)和3根孔径为4.5 nm的色谱柱(150 mm×4.6 mm, 1.7 μm)。测试在柱温和检测器温度均为40 ℃、进样量为10 μL、流速为0.5 mL/min的条件下进行。提取分离后的样品经充分溶解静置, 离心过滤, 待测。木质素磺酸盐及解聚后不溶物使用系列葡聚糖标准品做标准曲线, 选用3根水相ACQUITY APC AQ水性色谱柱串联进行测试, 分别是孔径为45 nm的色谱柱(150 mm×4.6 mm, 2.5 μm)、孔径为20 nm的色谱柱(150 mm×46 mm, 2.5 μm)和孔径为4.5 nm的色谱柱(150 mm×4.6 mm, 1.7 μm)。具体的测试条件为, 流动相:0.1 mol/L NaNO3水溶液; 柱温:40 ℃; 示差折光检测器:40 ℃; 流速:0.5 mL/min; 进样量:10 μL; 待测样品含量:0.5%(质量分数)。
采用KBr压片法测定, 分辨率为4 cm-1, 扫描次数为32次。
按照已报道的解聚实验方法[18, 20], 在110 ℃条件下, 制备获得木酚比(木质素:苯酚)为25%(质量分数, 下同)的解聚产物。反应过程中可观察到瓶壁有灰白色固体沉淀析出, 在先前的工作[20]中已确定沉淀是木质素解聚的同时原位脱除了木质素原有的钙和钠盐。采用四氢呋喃对解聚产物进行提取, 经分离获得木质素解聚液。
木质素磺酸盐具有木质素苯丙烷的特征结构, 如图 1所示, 具有特征的Cβ-O-C键接方式, Cα上大都键接磺酸盐基团, 具有很好的水溶性, 但不溶于丙酮、乙酸乙酯、乙腈、四氢呋喃等有机溶剂。选用乙酸乙酯、乙腈、四氢呋喃对催化解聚脱盐渣后木质素解聚液(木酚比为25%, 110 ℃酸催化30min)进行萃取。准确称取2.50 g木质素解聚液于离心管中, 分别分3次加入约50 mL乙酸乙酯、乙腈、四氢呋喃作为萃取剂, 室温静置过夜, 高速离心分离不溶残渣, 真空烘干, 获得黑色不溶物。乙酸乙酯、乙腈、四氢呋喃对解聚液萃取后的不溶物质量分别为0.3077、0.1283和0.1127 g, 分别占解聚液质量的12.28%、5.13%和4.50%, 表明后两者具有更好的萃取效率。而所产生的黑色不溶物具有很好的水溶性, 经红外光谱证实为未完全解聚的木质素磺酸盐。按照25 g木质素磺酸盐在100 g苯酚中酸催化解聚, 除去约5 g 20%的盐渣, 即可供解聚的木质素高分子有机质约为20 g计, 2.5 g的解聚液含有可供解聚的木质素高分子有机质约为0.4 g, 以四氢呋喃萃取后的黑色不溶物0.11 g计, 即被解聚有机质约为0.29 g, 初步计算, 本试验条件下解聚木质素产率约为0.29/0.4, 即72.5%。本研究利用该解聚液流动性和稳定性好的优势, 以APC测试常用流动相四氢呋喃为溶剂萃取解聚液, 作为APC分析的待测液, 系统研究酸催化木质素解聚产物的相对分子质量及其分布和影响因素, 具体流程如图 1所示。
本课题组[21]的前期研究工作表明, 采用APC可获得比传统GPC更高重现性和超高分辨率的色谱峰, 使用新开发的孔径4.5 nm的刚性填料, 尤其适于低分子质量聚合物的分析。本研究在先前采用水性柱子测试木质素磺酸盐及其解聚后水溶性残渣的工作基础上, 进一步优化分析测木质素酸催化解聚后酚类产物实验条件。结果表明, 选用1根孔径20 nm和3根孔径4.5 nm的油溶性柱子串联, 以pH为7.5的四氢呋喃作流动相, 分析低相对分子质量聚合物可以获得较好的分离度。还比较了示差检测器和紫外检测器的分析效果, 如图 2所示的是某解聚样品同时采集的RI与UV检测器的测试结果对比图, 可以看出, 对于芳香类低聚物或化合物, 在同样的极低的样品浓度时(1‰~5‰), 由于紫外检测器受干扰低, 测试结果具有极高灵敏度和更平的基线, 有利于低分子化合物的分辨, 如图 2b所示, 解聚产物得到了高效的分离, 并具有明显的紫外信号; 而示差检测器灵敏度很低(见图 2a)。木质素解聚后的酚类产物具有紫外吸收的特点, 为了减少半纤维素糖类等杂质的影响, 更准确和灵敏地获得其相对分子质量及其分布特征, 本研究采用UV检测器在较低的样品浓度下研究酸催化解聚木质素行为。
采用4根油溶性的ACQUITY APC XT色谱柱串联, 分别是1根孔径为20 nm的色谱柱(150 mm×4.6 mm, 2.5 μm)的和3根孔径为4.5 nm的色谱柱(150 mm×4.6 mm, 1.7 μm); 采用紫外检测器在波长240 nm下分析液液萃取后的产物, 结果见图 2。从图中可以看出, APC在14 min内就对解聚产物实现了高效的分离, 解聚产物具有明显的紫外吸收信号, 四氢呋喃萃取后产物出现了3个峰, 保留时间分别为12.40、12.90和13.75 min。由于高效凝胶色谱分离的标样相对分子质量下限在266 Da, 图 2中保留时间为13.75 min的峰因标样范围所限不能获得平均相对分子质量数据, 经计算, 其相对分子质量在260 Da左右, 初步判定是具有更低相对分子质量的解聚产物或与溶剂苯酚共流的组分, 其中, 主要的单酚或双酚类化合物已被GC-MS测试所证实[20], 本文暂不对此峰做详细讨论。图谱中相对Mp在726、495和更低相对分子质量的低聚物产物获得了高效的分离, 且相对分子质量分布很窄(见表 1), 分子质量分布指数(polydispersity index, 简称PDI)接近1, 而未测试到高相对分子质量木质素的信号。已知该木质素磺酸盐原料的Mw约为50000 Da, 以上结果表明, 四氢呋喃萃取获得的解聚产物主要为酚类低聚物, 进一步证实了在该特定的温和酸催化条件下, 约有72.5%的木质素磺酸盐被高效解聚为相对分子质量为几百的酚类低聚物和一些单体化合物。测试结果也有力地证明了在本色谱条件下, APC克服了传统的GPC时间长(30~60 min)、分离度、灵敏度很难满足测试要求的弱点[14, 19], 能够快速和高效地分离分析木质素解聚后获得的低分子酚类产物。
在相同的木酚比(25%)和相同的酸催化剂条件下, 考察不同催化反应温度对解聚的影响, 采用四氢呋喃液液萃取解聚液。从图 3可以看出, 不考虑与苯酚共流组分峰, 解聚产物也均在12.4和12.9 min处获得了很好的分离, 对应的Mp均为720和490 Da左右, 两峰面积比例为75:25, 且具有近似1的分布指数, 初步表明不同温度下的酸催化解聚机理相同。在反应温度为50 ℃时, 紫外吸收强度只达到最高解聚峰值的1/4左右, 随着反应温度的升高, 两吸收峰强度呈上升趋势, 70 ℃时的两吸收峰峰强度较50 ℃时明显上升, 达到最高解聚峰值的50%左右, 升至130 ℃后紫外吸收峰强度趋于一致, 表明达到最高的解聚效率。从表 2液液萃取后的黑色不溶物残渣率可以看出, 随着反应温度的提高, 液液萃取后剩余残渣的质量分数依次递减, 到130 ℃趋于平稳。以上结果表明, 随着催化反应温度的提高, 木质素酸催化解聚效率不断提高, 到150 ℃时达到最高值, 最高解聚效率可以达到80%以上。130 ℃由于条件较为温和, 产物不易被炭化, 并能获得较高的解聚效率, 该温度条件更适用于解聚反应。
图 4是酸催化解聚木质素体系(25%木酚比)在110 ℃反应时解聚产物随时间变化的APC色谱图, 可以看出, 不考虑与苯酚共流峰, 解聚产物均在12.4和12.9 min处获得了很好的分离, 该保留时间对应的Mp均为720和490 Da左右, 两峰面积比均约为75:25, 表明不同催化时间下的解聚机理相同。在温度上升刚到110 ℃时, 即在该温度条件下反应0 min时, 取样测试其紫外吸收强度达到最高解聚强度的1/3左右; 随着催化反应时间的延长, 催化解聚30 min时两峰峰值呈明显上升趋势, 紫外吸收强度达到最高解聚峰值的80%左右; 解聚反应进行到60 min时, 木质素磺酸盐获得最高的解聚效率。以上结果表明, 随着反应时间的延长, 木质素酸催化解聚效率不断提高。由于反应时间延长有可能导致炭化等, 酸催化反应控制在1 h内为宜。
催木比即催化剂与木质素质量之比。图 5是酸催化解聚木质素体系(25%木酚比)在110 ℃反应30 min条件下, 解聚产物随催木比变化的APC色谱图, 可以看出, 解聚产物均在12.4和12.9 min处获得了很好的分离, 对应的Mp均为720和490 Da左右, 两峰面积比均约为75:25, 表明不同催木比下木质素磺酸盐酸催化的解聚机理相同。从图 5可以看出, 催木比为0.583时解聚效率最低, 只达到最高解聚峰值的1/4左右, 四氢呋喃萃取后所得黑色沉淀不能烘干, 不溶物的含量很高, 有大量木质素未发生解聚, 解聚效率很低。当催木比为1.167时, 两峰峰值呈明显上升趋势, 解聚产物色谱峰值达到最高解聚峰值的80%左右, 表明解聚效果明显, 但液液萃取后不溶物含量也较高。当催木比为2.334和2.917时, 两峰峰值达到最高值, 并趋于一致; 随着催木比进一步提高到3.5时, 两峰峰值呈下降趋势。可初步判定当催木比为2至3时, 在本试验条件下木质素磺酸盐解聚效率能够达到较高的程度。
综合以上结果可以看出, 酸催化解聚反应的温度、时间和催木比对解聚效率都有一定的影响, 但峰形、Mp值以及峰面积都表现出一致性, 酸催化解聚生成的产物分布在720、490和260 Da 3个相对分子质量区间, 表明该催化剂体系下解聚反应遵循同样的断裂机制和解聚机理, 解聚产物具有近似的分子组成, 初步可以认为催化反应具有一定的选择性。对液液萃取后的黑色残渣采用APC水溶性柱子进行系统分析[21], 结果如图 6所示, 与未解聚前的木质素(见图 6a)相比, 该残渣的相对分子质量高于2×104 Da(见图 6b), 峰位相对分子质量显著降低, 且相对分子质量分布发生了变化。FT-IR测试结果也进一步证实了该残渣仍具有磺酸盐的结构特征。如图 7所示, 除了苯环的特征吸收峰(1622、1513和1461 cm-1), 还观察到在1222 cm-1处芳醚键、1117 cm-1处烷氧醚键和1039 cm-1处-SO3H的特征吸收[10], 由此可以推断该残渣为未完全解聚的木质素磺酸盐, 说明大相对分子质量部分的木质素磺酸盐由于位阻等效应只是发生了部分解聚, 而相对分子质量在1.7×104 Da以下的木质素磺酸盐基本被完全解聚成低相对分子质量的酚类化合物。
由此, 结合残渣的量以及催化条件温和的原则, 可以总结出, 当催木比为2.334、130 ℃酸催化木质素解聚反应60 min时, 可以获得解聚效率高达70%以上的木质素磺酸盐酚类解聚产物, 这也是迄今报道的酸催化解聚真实木质素中条件较温和、产物较高的解聚途径[23]。
本研究以温和酸催化条件下获得的木质素解聚产物为研究对象, 建立了木质素酚类解聚产物的APC快速分析方法。采用优化的APC方法对解聚产物实现了高效的分离, 解聚产物色谱信号灵敏, 能快速直接地表征酸催化解聚木质素的解聚程度和解聚效率。采用该方法重点探讨了酸催化解聚木质素磺酸盐的行为, 研究表明, 该酸催化反应的机理不受反应时间、温度以及催木比影响, 表现出一定的可控性。研究结论为后续解聚产物的快速精细分离提供了基础条件。在该APC测试结果的引导下, 后续的工作将采用超高效液相色谱和高分辨质谱联用技术, 系统分离分析鉴定酸催化解聚后木质素基酚类目标化合物, 以期获得真实木质素解聚产物结构信息, 进一步探讨解聚机理。
2019,
Vol. 37 Issue (9): 983-989 DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.02013 
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